CC BY
9DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-32-64-72 УДК 577.212.3:616-007.15
Е. П. Михаленко1, О. М. Малышева1, И. В. Сахаров2, А. Ю. Гордеева3, М. В. Артюшевская4, В. А. Шостак3, А. Б. Сущевский3, Г. А. Шишко4, А. В. Кильчевский1
КЛИНИЧЕСКИЙ СЛУЧАЙ ВРОЖДЕННОЙ АЛЬВЕОЛЯРНО-КАПИЛЛЯРНОЙ ДИСПЛАЗИИ ЛЕГКОГО: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ
УТОЧНЕНИЯ ДИАГНОЗА
Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: michalenko75@mail.ru 2Учреждение здравоохранения «Городское клиническое патологоанатомическое бюро» Республика Беларусь, 220045, г. Минск, ул. Семашко, 8/8 3Учреждение здравоохранения «5-я городская клиническая больница г. Минска» Республика Беларусь, 220026, г. Минск, ул. Филатова, 9
"Государственное учреждение образования «Белорусская академия последипломного образования» Республика Беларусь, 220013, г. Минск, ул. П. Бровки, 3, корпус 3
Цель исследования — установить роль патологических клинико-лабораторных характеристик течения нео-натального периода, данных морфологического и молекулярно-генетического исследования в танатогенезе случая альвеолярно-капиллярной дисплазии (АКД) у новорожденного. АКД — редкое летальное нарушение развития легких у новорожденных, причиной развития которого в большинстве случаев являются точечные мутации в гене FOXF1 или делеции в области q24.1 хромосомы 16. У ребенка Ш. проведено высокопроизводительное секвенирование полного экзома с использованием протокола Illumina-IDT Exome Enrichment на сек-венаторе NextSeq 550. Ведущую роль в танатогенезе тяжелой дыхательной недостаточности сыграло наличие у ребенка АКД, что подтверждено морфологическими данными. Генетический анализ не выявил патогенных вариантов в генах FOXF1, PLXNB2, DOCK8, MPRIP, ESRP1, SLC50A1, ZMYND11, а также делеций в области L17941 и L29692 q24.1 хромосомы 16. Для определения делеций LINC01081 и LINC01082 необходима разработка дополнительных биоинформатических алгоритмов.
Ключевые слова: альвеолярно-капиллярная дисплазия, новорожденный, дыхательная недостаточность, гистология, молекулярно-генетическая диагностика.
Введение
Интерстициальные заболевания легких в детском возрасте включают гетерогенную группу состояний, характеризующихся нарушением развития альвеол и дистальных отделов воздушного пространства [1, 2]. Альвеолярно-капиллярная дисплазия со смещением легочных вен (АКД) — редкое летальное нарушение развития легких у новорожденных, характеризующееся уменьшением количества легочных капилляров, утолщением мышц в малых легочных артериолах и аномально расположенными легочными венами, идущими вдоль легочных артериол [3, 4].
Пациенты с АКД имеют синдром дыхательных расстройств, обычно сопровождающийся легочной гипертензией и возникающий в течение нескольких часов после рождения. В большинстве случаев (80-90%) причиной развития АКД являются точечные мутации в гене FOXF1 или делеции в области q24.1 хромосомы 16, которая может включать часть гена FOXF1 или некодирующие элементы (эн-хансер гена), регулирующие его экспрессию [5, 6]. В 10-20% случаев генетическая основа развития АКД неизвестна. Чаще заболевание носит спорадический характер, что означает, что генетические изменения происходят во
время оплодотворения и не наследуются от родителей. Однако наблюдаются редкие случаи, когда АКД может передаваться по наследству [5-7]. Гетерогенность симптомов заболевания, отсутствие у большинства пациентов мутаций в гене FOXF1 и его энхансерах указывают на необходимость поиска генов, которые также могут быть задействованы в патогенезе данного заболевания.
Цель исследования — установить роль патологических клинико-лабораторных характеристик течения неонатального периода, данных морфологического и молекулярно-генетиче-ского исследования в танатогенезе случая АКД у новорожденного.
Материалы и методы
Представлен случай альвеолярно-капил-лярной дисплазии легких у новорожденного ребенка Ш., выхаживание и лечение которого осуществлялось в отделении новорожденных и в отделении реанимации и интенсивной терапии для новорожденных родильного дома УЗ «5-я городская клиническая больница» г. Минска. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности, получено письменное информированное согласие законного представителя пациента и разрешение Комитета по этике БелМАПО на проведение исследования.
Клинический метод исследования включал результаты объективного осмотра и динамического наблюдения за новорожденным, данные анамнеза (акушерско-гинекологический анамнез, течение беременности и родов).
Инструментальные методы, использованные в работе — мониторинг механики дыхания, эхокардиография и рентгенологическое исследование. Для уточнения причин тяжелого течения заболевания выполнена гистологическая, молекулярно-генетическая экспертиза фрагмента легкого. Морфологический метод представлял собой посмертное макро- и микроскопическое исследование с использованием иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания.
Материалом для молекулярно-генетическо-го исследования послужила геномная ДНК, выделенная из ткани легкого с помощью коммерческого набора FFPE gDNA Miniprep System (Promega, США). Проведено высоко-
производительное секвенирование полного экзома с использованием протокола Illumina-IDT Exome Enrichment на секвенаторе NextSeq 550 (Illumina) с последующей обработкой полученных данных (fastq-файлы) алгоритмом Dragen Enrichment (Illumina). Аннотирование vcf-файла выполнено с помощью онлайн-ре-сурса wANNOVAR [8].
При фильтрации вариантов, ассоциированных с развитием альвеолярно-капилляр-ной дисплазии, из полученного списка замен удалены некодирующие (интронные) и синонимичные варианты без изменения сайтов сплайсинга, варианты с незначительной частотой встречаемости аллелей (MAF), большей или равной 1%, в базе данных 1000Genome, ExAc, GnomadGenome, GnomadExome, мис-сенс-варианты, которые, согласно программам предсказания PolyPhen-2 (http://genetics.bwh. harvard.edu/pph2/), SIFT (https://sift.bii.a-star. edu.sg/) и Mutation Taster (http://mutationtaster. org/) не являются патогенными. Для дальнейшей проверки и анализа были отобраны обнаруженные варианты в генах, влияющих на функциональную активность их белков.
Наиболее протяженные делеции в области энхансера гена анализировали с использованием микросателлитного анализа про-банда и его родителей. Микросателлиты были амплифицированы с использованием пар праймеров L17941 (Forward: 5'- 6FAM-CTGGGTACTCTTC TGTGACA-3'; Reverse: 5 '-CTCTCTCCCC AAC ATGGTG-3 ') и L 2 9 6 9 2 (Forward: 5'-6FAM-TGTGTGTCTTCTG GGGGAGT-3'; Reverse: 5'-CACAGCTAGCCACAGGCAG-3') [9]. Ам-плифицированные продукты детектировались с помощью капиллярного электрофореза на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 («Applied Biosystems», США).
Результаты и обсуждение
Ребенок Ш. — доношенный мальчик массой 3 340 г, длиной 51 см с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов, родился от первой беременности, протекавшей на фоне хронической фетоплацентарной недостаточности в УЗ «5-я городская клиническая больница» в сроке ге-стации 275 дней (39 недель).
Послед массой 500 г отделился самостоятельно (патоморфологическое исследование:
ворсинчатый хорион, оболочки плаценты, пуповина — нормального строения).
Состояние ребенка Ш. при рождении и в течение последующих трех суток было удовлетворительное. На четвертые сутки жизни наблюдалось ухудшение состояния новорожденного младенца за счет нарастания дыхательной недостаточности (ДН). Для дальнейшего обследования и лечения ребенок был переведен в отделение реанимации для новорожденных.
Состояние новорожденного ребенка при поступлении в отделение реанимации было тяжелое, обусловленное ДН 3-й степени. Ре-
90
бенок был переведен на конвенциональную искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) с уровнем подачи кислорода 40% ^02), однако в динамике наблюдалось нарастание кисло-родозависимости, что потребовало перевода младенца на высокочастотную искусственную вентиляцию легких (ВЧО-ИВЛ).
Динамика кислородозависимости (Й02), уровня сатурации ^а02) и изменения параметров среднего давления в дыхательных путях (МАР) у ребенка Ш. в отделении анестезиологии и реанимации для новорожденных отображена на рисунке 1.
Вследствие тяжелого течения дыхательной
■С
а
£н ВО
70
£ т
6 -
и 50 £ 40
й*> 20 ю
(МУ >1 /
М 92г^\ —Е- Л * ■ шСз оо ню к» ]оо 9 СЕ 100
ХоЧ Д / * / \ ТШ * ЛГ^ч / оа\ гъ \ / \ * 1 \— V 1 1 / _а*_и
/¡о во 1 ео V У ао \ / ■71^' V 1
70 70 П<>2,%
МЛР, гиЬ
40 33 х 30 А 133
20 30 / [5уЛ— \ 23 / 41: 20 20 20 " лЛ**^ VI» 18 «X
V * т * ч^/ » ^_ .
Но грает ребёнка III., су[К!Г
Рис. 1. Динамика кислородозависимости (А02), уровня сатурации (8а02), изменения параметров МАР
у ребенка Ш. в отделении реанимации для новорожденных
недостаточности и высокой резистентности легких у ребенка развилась клиника перси-стирующей легочной гипертензии. На протяжении последующих 28-ми дней у ребенка сохранялась высокая кислородозависимость (Й02 80-100%). На 29-е сутки ребенок умер.
По данным эхокардиографии было выявлено наличие персистирующей легочной гипертен-зии, резистентной к проводившейся терапии. При анализе клинической картины заболевания ребенка Ш. наблюдалось волнообразное
течение и стойкая отрицательная динамика патологического процесса. На основании анализа имеющихся клинико-лабораторных данных у новорожденного Ш. было предположено наличие интерстициального заболевания легких — альвеолярно-капиллярной дисплазии.
Для уточнения причин тяжелого течения заболевания выполнена гистологическая, моле-кулярно-генетическая экспертиза фрагмента легкого. При морфологическом исследовании на малом увеличении определяется выра-
женная дезорганизация легочной ткани, нормальное дольковое и ацинарное строение не прослеживается. На малом увеличении ткань представлена дольками разной формы и размеров, не имеющими связи с ветвлением бронхиального дерева. Отмечается аномальное расположение крупных артерий и вен, многие бронхи и крупные сосуды находятся субплев-рально. Большинство артерий с периваску-лярным фиброзом, многие имеют извитой ход (рис. 2А). Регистрировались множественные участки кровоизлияний и геморрагического пропитывания с очаговым некрозом ткани. В бронхах выявлена десквамация эпителия и кровоизлияния.
На большом увеличении в большинстве участков преобладает рыхлая и плотная соединительная ткань с большим количеством сосудов капиллярного типа, альвеолы между ними отсутствуют (рис. 2Б). В других участках имеются альвеолы, выстланные кубическим эпителием. Между ними широкие прослойки из рыхлой соединительной ткани, в которой расположены капилляры, не контактирующие со стенкой альвеол (рис. 2В). Для визуализации сосудистого русла использовалась ИГХ окраска на CD31 (маркер эндотелиоцитов). В небольших фрагментах определяются немногочисленные мелкие альвеолы нормального строения с десквами-
Л
Л :■ -
" -гЩ7*.г
Б
" *
* ■
. г.
*Л * %
х-*- ■- ■
« ' 1 V ' . ' * '
, ^ - 1
I
-I
I /* V, .
С , н
- г
и V.* ч
■ . у»1
^ гч кг,
Рис. 2. Микроскопические изменения в легких А — Периваскулярный фиброз и извитой ход артериолы, ув. *100; Б — Отсутствие альвеол, преобладание соединительной ткани с многочисленными капиллярами, ув. ><400; В — Альвеолы разделены широкими прослойками из рыхлой соединительной ткани с капиллярами, не контактирующими со стенкой альвеол, ув. ><400; Г — Небольшой участок нормально сформированных альвеол, ув. ><400. А, Б — окраска гематоксилином и эозином,
В, Г — ИГХ окраска на СБ31
рованным и некротизированным эпителием (рис. 2Г). Местами в просвете альвеол небольшое количество лейкоцитов и фибрин. Гранулы гемосидерина во многих альвеоло-цитах и в соединительной ткани.
По результатам проведенной гистологической экспертизы фрагмента легкого был поставлен патологоанатомический диагноз — АКД: дезорганизация легочной ткани, нарушение долькового и ацинарного строения, аномальное расположение крупных артерий и вен около бронхов и бронхиол, а также суб-плеврально, нарушение васкуляризации альвеол, нарушение лобуляции правого легкого.
Следует отметить, что при АКД часто микроскопически определяется нарушение расположения ветвей легочных вен (misalignment of pulmonary veins, MPV). Они расположены не в междольковых соединительнотканных
ван 241 вариант в 217 генах на их возможное участие в развитии тяжелого состояния пациента (табл. 1). Были обнаружены 4 гетерозиготные однонуклеотидные замены в 3 генах SHH, МиС5В, SH2B3, ассоциированных с развитием респираторных осложнений у человека (табл. 2).
Патогенные замены в этих генах могут вызвать заболевания с аутосомно-рецессивным типом наследования. Обнаруженные гетерозиготные замены не влияют на развитие АКД
перегородках, а рядом с артериями, и имеют общую с ними адвентициальную оболочку [2, 10, 11]. У ребенка Ш. этого не наблюдалось, однако многие артерии и вены располагались субплеврально. Важно, что поражение легочной ткани было тотальным, что обусловило быстрое развитие, тяжелое течение и летальный исход заболевания.
В дальнейшем было проведено молекуляр-но-генетическое исследование образца ткани легкого пациента. Полноэкзомное секвени-рование позволило обнаружить 11 485 замен с глубиной прочтения >30, среди которых 71 расположены в зонах сплайсинга. Распределение детектированных генетических изменений новорожденного Ш. по типам мутаций представлены в таблице 1.
После проведения фильтрации выявленных при секвенировании замен был проанализиро-
у пациента.
Ген FOXFl, мутации в котором вызывают развитие АКД, кодирует белок F0XF1, экс-прессируемый в мезенхиме легких и эндотелии сосудов во время органогенеза легких. Он относится к семейству факторов транскрипции forkhead и является мишенью для передачи сигналов из эпителия в SHH-сигнальном пути, а также участвует в развитии легочных альвеол и капилляров. Промотор гена FOXF1 перекрывает CpG-островок, не содержит ТАТА-бокса
Таблица 1
Распределение выявленных генетических изменений по типам мутаций
Тип замены Количество, % Количество замен после фильтрации, %
Синонимичные однонуклеотидные 6 203 (54) —
Несинонимичные однонуклеотидные 4 961 (43,19) 219 (90,87)
Замены со сдвигом рамки считывания 78 (0,67) 10 (4,15)
Нонсенс-замены 41 (0,34) 3 (1,24)
Замены без сдвига рамки считывания 190 (1,7) 9 (3,73)
Замены, нарушающие старт-кодон и стоп/кодон 12 (0,1) —
Всего: 11 485 241
Таблица 2
Характеристика нуклеотидных замен генов SHH, МиС5В, SH2B3, ассоциированных
с развитием респираторных осложнений
Ген Замена Патогенность dbSNP
БНН с.в869А p.Gly290Asp Патогенный (HGMD) ге104894047
МПС5В С.С7882Т р^2628С Неопределенного значения ге200675933
МПС5В С.С11126Т р.Т3709М Неопределенного значения ге199858725
БН2В3 с.С639А р.Б2т Неопределенного значения ге111360561
и требует энхансерной функции для своей активности. Энхансерная область, специфичная для легких, картирована на ~ 270 т. п. н. выше по течению гена FOXF1, содержит гены длинных некодирующих РНК (ЬШС01081 и КТМС01082), которые регулируют его экспрессию. Кроме того, найден еще один эн-хансер, расположенный внутри интрона гена FOXF1 [5]. Помимо патогенных вариантов в локусе FOXF1, причиной развития АКД могут быть мутации в генах, вовлеченных в SHH-или другие сигнальные пути, необходимые для развития легких (Р1ШВ2, DOCK8, МРШР,
ESRP1, SLC50A1, ZMYND11 и др.).
Обнаруживаемые у пациентов с АКД деле-ции, затрагивающие область энхансера гена FOXF1, могут быть различной протяженности (рис. 3).
По результатам проведенного полноэкзом-ного секвенирования патогенных вариантов (точечных мутаций) в гене FOXF1 не обнаружено. Протяженной делеции, затрагивающей как ген FOXF1, так и близлежащие гены, выявлено не было. О ее наличии можно было бы судить по отсутствию гетерозиготных полиморфных вариантов в этих генах.
Рис. 3. Делеции, ассоциированные с АКД (представлены черными полосами). Карта региона гена FOXF1: КТЫС01081 и КТЫС01082 — длинные некодирующие РНК, L17941 и L29692 — микросателлиты [9]
К ограничениям метода NGS относится неспособность выявления делеций и вставок больше 50 п. о., а использованной в работе панели — некодирующих вариантов, расположенных глубже 20 п. о. от границы экзон-интрон. Поэтому исключать наличие делеции в области энхансера гена FOXF1 нельзя. Учитывая ограничения метода секвенирования для определения делеции в области энхансера, гистологическое исследование легочной ткани
остается золотым стандартом обследования младенцев, рожденных с АКД. В качестве альтернативного метода выявления делеции в области энхансера используется также метод определения комплекса микросателитных повторов в этом регионе.
Микросателлитный анализ на наличие протяженной делеции в области энхансера гена FOXF1 у пробанда и его родителей дал отрицательный результат (рис. 4).
Рис. 4. Результаты микросателлитного анализа: у пробанда отсутствуют делеции в исследуемой области
Заключение
Ведущую роль в танатогенезе тяжелой дыхательной недостаточности сыграло наличие у ребенка альвеолярно-капиллярной диспла-зии, что подтверждено морфологическими данными. Генетический анализ не выявил патогенных вариантов в генах FOXF1, PLXNB2, DOCK8, МРШР, ESRP1, SLC50A1, ZMYND11, а также делеции в области L17941 и L29692 q24.1 хромосомы 16. Для определения делеций иГЫС01081 и КТМС01082 необходима разработка дополнительных биоинформатических алгоритмов.
Список использованных источников
1. Федоров, И. А. Врожденная альвеолярно-
капиллярная дисплазия легких у новорожденного ребенка / И. А. Федоров, О. Г. Степанов, Ю. Э. Пушкарева // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. - 2012. - № 42. - С. 127-128.
2. Alveolar capillary dysplasia / B. Naomi [et al.] // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. - 2011. - Vol. 184. -P. 172-179.
3. Expanding the phenotype of alveolar capillary dysplasia (ACD) / P. Sen [et al.] // J. Pediatr. -2004. - Vol. 145. - P. 646-651.
4. Bishop, N. B. Alveolar capillary dysplasia / N. B. Bishop, P. Stankiewicz, R. H. Steinhorn // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2011. - Vol.
184. - P. 172-179.
5. Pathogenetics of alveolar capillary dysplasia with misalignment of pulmonary veins / P. Szafranski [et al.] // Hum. Genet. - 2016. -Vol. 135. - P. 569-586.
6. Genomic and genic deletions of the FOX gene cluster on 16q24.1 and inactivating mutations of FOXF1 cause alveolar capillary dysplasia and other malformations / P. Stankiewicz. [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 2009. - Vol. 84. - P. 780-791.
7. Novel FOXF1 mutations in sporadic and familial cases of alveolar capillary dysplasia with misaligned pulmonary veins imply a role for its DNA binding domain / P. Sen [et al.] // Hum. Mutat. - 2013. - Vol. 34. - P. 801-811.
8. Chang, X. wANNOVAR: annotating genetic
variants for personal genomes via the web / X. Chang, K. Wang // J. Med. Gen. - 2012. - Vol. 49. - P. 433-436.
9. A 16q deletion involving FOXF1 enhancer is associated to pulmonary capillary hemangiomatosis / P. D. Russo [ et al.] // BMC Med. Gen. - 2015. - Vol. 16. - P. 1-6.
10. Alveolar capillary dysplasia with misalignment of the pulmonary veins: clinical, histological, and genetic aspects / E. Slot [et al.] // Pulm. Circ. - 2018. - Vol. 8. - P. 1-8.
11. A familial case of alveolar capillary dysplasia with misalignment of the pulmonary veins: the clinicopathological features and unusual glomeruloid endothelial proliferation / A. Kitano [et al.] // Diagn. Pathol. - 2020. - Vol. 15. - P. 1-7.
A. P. Mikhalenka1, V. M. Malyshava1, I. V. Sakharau2, А. Y. Gordeeva3, M. V. Artsiusheuskaya4, V. А. Shostak3, А. B. Sushcheuski3, G. A. Shyshko4, A. V. Kilchevsky1
A CLINICAL CASE OF CONGENITAL ALVEOLAR CAPILLARY DYSPLASIA: USE OF HIGH THROUGHPUT SEQUENCING TO VERIFY
A DIAGNOSIS
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: michalenko75@mail.ru 2Health Care Institution "City Clinical Pathology Bureau" 8/8 Semashko St., 220045 Minsk, Republic of Belarus 3Health Care Institution "5th City Clinical Hospital" 9 Filatova St., 220026 Minsk, Republic of Belarus 4State Educational Institution "Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education" 3/3 P. Brovka St., 220013 Minsk, Republic of Belarus
The aim of the study was to establish the role of pathological clinical and laboratory characteristics of the course of the neonatal period, the data of morphological and molecular genetic studies in the thanatogenesis of a case of alveolar capillary dysplasia (ACD) in a newborn. ACD is a rare lethal neonatal lung developmental disorder, the development of which is caused in most cases by point mutations in the FOXF1 gene or deletion in the q24.1 region of chromosome 16. High-throughput whole-exome sequencing was performed in the child Sh. using the Illumina-IDT Exome Enrichment Protocol on the NextSeq 550 sequencer. A key role in the thanatogenesis of severe respiratory failure was existing alveolocapillary dysplasia in a child, which was confirmed by morphological data. Genetic analysis did not reveal pathogenic variants in FOXF1, PLXNB2, DOCK8, MPRIP, ESRP1, SLC50A1, and ZMYND11 genes, as well as deletions in regions L17941 and L29692 q24.1 of chromosome 16. In order to identify LINC01081 and LINC01082 deletions, it is necessary to develop additional bioinformatic algorithms.
Keywords: alveolar capillary dysplasia, newborn, respiratory failure, histology, molecular genetic diagnostics.
Дата поступления в редакцию: 10 марта 2022 г.
