CC BY
105
УДК 612.017:616-092.9
С.А. Витязева 1, Т.П. Старовойтова 1, В.И. Дубровина 1, Л.А. Грищенко 2 , Г.Б. Мухтургин 1
КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ТИМУСА И КРАСНОГО КОСТНОГО МОЗГА БЕЛЫХ МЫШЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ YERSINIA PESTIS EV В СОЧЕТАНИИ С АРАБИНОГАЛАКТАНОМ
1 Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»
Роспотребнадзора (Иркутск) 2 Иркутский институт химии СО РАН (Иркутск)
Проведены исследования по изучению влияния Yersinia pestis EVв сочетании с иммуномодулятором растительного происхождения. — арабиногалактаном на клеточный состав красного костного мозга и. тимуса белых мышей. Количественную оценку клеточного состава коркового и. мозгового вещества тимуса и клеточного состава красного костного мозга проводили с помощью компьютерной программы. «Морфометрия». Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют, о высокой чувствительности этих органов к воздействию арабиногалактана.
Ключевые слова: арабиногалактан, Yersinia pestis EV, костный мозг, миелограмма, тимус
CELL COMPOSITION OF THYMUS AND RED BONE MARROW OF WHITE MICE IMMUNIZED WITH YERSINIA PESTIS EV IN THE COMBINATION WITH ARABINOGALACTANE
S.A. Vityazeva 1, T.P. Starovoitova 1, V.I. Dubrovina 1, L.A. Grishchenko 2, G.B. Mukhturgin 1
11rkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk
2 Irkutsk Institute of Chemistry SB RAMS, Irkutsk
Influence of Yersinia pestis EV in combination, with a phytogenous immunomodulator, arabinogalactane, on cellular structure of red bone marrow and thymus of white mice was studied. Quantitative estimation of the cellular composition, both thymus cortical and. medullary substance and. red bone marrow was conducted, using the computer program. «Morphometry». The data obtained in experiments indicate high sensitivity of these bodies to arabinogalactane influence.
Key words: arabinogalactane, Yersinia pestis EV, bone marrow, myelogram, thymus
ВВЕДЕНИЕ
Центральные иммунокомпетентные органы, к которым относятся тимус и костный мозг, выполняют в организме целый ряд общих функций. Они создают оптимальное микроокружение для созревания лимфоцитов из их предшественников, регулируют взаимодействие разных классов лимфоцитов, обеспечивая максимальную эффективность клеточных взаимодействий, и осуществляют своевременную поставку эффекторных элементов иммунной системы [4].
Участие костного мозга и тимуса в реализации иммунных реакций и особенности течения вакцинального процесса, вызванного применением живой чумной вакцины и иммуномодуляторов природного происхождения, до настоящего времени мало исследованы.
Приоритетным направлением вакцинопрофи-лактики и иммунопрофилактики остается поиск средств, повышающих эффективность вакцин при одновременном снижении иммунизирующей дозы и уменьшении побочного действия [2, 6]. Одним из таких средств является арабиногалактан (АГ) — полисахарид растительного происхождения, полученный из клеточных стенок древесины лиственницы сибирской, который обладает иммуномодулирующим действием, стимулируя фагоцитарную систему. Известно также, что АГ
оказывает влияние на все звенья кроветворной системы, нормализует показатели миелограммы при вакцинальном процессе [3, 5].
В связи с чем, изучение клеточного состава центральных органов иммуногенеза весьма актуально и может служить прогностическим критерием действия иммунобиологических препаратов на макроорганизм.
Целью работы явилось изучение влияния Yersinia pestis EV в сочетании с арабиногалактаном на клеточный состав красного костного мозга и тимуса белых мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальной моделью в опытах служили 75 беспородных, но стандартных по условиям содержания и весу (16—18 г) белых мышей. Животных I группы иммунизировали подкожно однократно (в правую заднюю лапу) Y. pestis EV в дозе 104 КОЕ (ИД50), II группы — АГ (2 мг/кг), III группы — Y. pestis EV в сочетании с АГ (2 мг/кг). Контролем служили интактные животные.
Животных выводили из эксперимента под наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», 2003 г., Приложением к Приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г. на 3-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки с момента иммунизации. Для исследования
П1111111111111111111ПIIIIII 1111ГП □ I I I I I I III □ П11 I I I I I I
187
забирали тимус в 10% нейтральном формалине и извлекали бедренную кость для изготовления мазка красного костного мозга (ККМ). Тимус заливали в целлоидин, тканевые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином [8]. Фиксированные мазки костного мозга окрашивали по стандартным методикам [7].
Количественную оценку клеточного состава коркового и мозгового вещества тимуса проводили с использованием морфометрии (100 измерений клеточных элементов в различных участках на 5 срезах при помощи 25-узловой сетки на условной единице площади гистологического среза равной 2500 мкм2 с использованием масляной иммерсии при увеличении окуляра — 7, объектива — 90) [1].
Все полученные данные обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента с применением стандартного пакета программ «Statistica», версия 6 (Copyright©Stat Soft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: М — среднее арифметическое, m — ошибка среднего. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки была меньше 0,05 (р < 0,05) по отношению к контролю.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
При оценке мазка костного мозга важное значение имеет количественное отношение элементов лейкопоэза к числу элементов эритробла-стического ряда (Л : Э), а также индекс созревания нейтрофилов (ИСН — соотношение между молодыми и более зрелыми формами клеток) и индекс созревания эритроцитов (ИСЭ — отношение количества гемоглобинсодержащих нормобластов к количеству всех клеток эритробластического ряда).
Клеточный состав красного костного мозга у контрольных животных на протяжении всего опыта характеризовался относительным постоянством, ИСН составил 0,55 ± 0,02 у.е., ИСЭ —
0,82 ± 0,03 у.е., Л : Э - 4 : 1.
В мазках ККМ животных I опытной группы на 3-е сутки эксперимента отмечалось уменьшение числа зрелых клеток лейкопоэза и эритроцитарно-го ряда, в связи с чем, ИСН в 1,7 раза, ИСЭ — в 1,4 раза (р < 0,05) превышали показатели у интактных животных. Соотношение Л : Э в пределах нормы. Начиная с 7-х суток, показатели индексов уменьшаются и к 21-м суткам соответствуют значениям контрольных животных.
У животных, получивших инъекцию арабинога-лактана, на 3—14-е сутки наблюдения имело место незначительное уменьшение ИСЭ, что связано с выходом зрелых эритроцитов в периферическую кровь и относительным повышением количества бластных форм клеток эритрона в ККМ. Это подтверждается и изменением соотношения Л:Э в сторону увеличения клеток эритропоэза. На 21-е сутки эксперимента ИСЭ и соотношение Л : Э не отличались от контрольных. ИСН в течение всего опыта находился в пределах нормы, однако, общее число
клеток гранулоцитарного и лимфоцитарного рядов в миелограмме опытных животных незначительно превышало показатели у интактных животных.
При анализе миелограммы белых мышей, иммунизированных Y. pestis EV в сочетании с АГ, установлено отсутствие угнетения эритроцитарного ростка, наблюдаемое у животных I опытной группы. Индекс созревания нейтрофилов и индекс созревания эритроцитов во все сроки эксперимента характеризовались относительным постоянством и их значения были приближены к контрольным. При этом отмечалось пролиферативная активность гранулоцитарного и лимфоцитарного ростка, усиление процесса созревания клеток, на что указывало увеличение числа зрелых форм на 21-е сутки эксперимента.
При изучении клеточного состава структурнофункциональных зон тимуса было установлено, что в корковом веществе мышей (табл. 1), иммунизированных Y. pestis EV, с 3-х по 14-е сутки имеет место увеличение количества бластных клеток (в 1,3 — 1,6 раза по сравнению с контролем) с последующим снижением к 21-м суткам, причем в этом случае показатель был ниже, чем в контроле. Как показал детальный анализ, повышение содержания лимфоцитов отмечается с 7-х суток и к 14 — 21-м суткам достигает максимальных значений (в 1,3 раза выше, чем в контроле).
Установлено, что в мозговом слое тимуса у животных подопытной группы достоверно увеличивается число эпителиальных клеток в 1,4 раза на 3 — 7-е сутки с последующим снижением к 21-м суткам до контрольных значений. Содержание макрофагов в этой зоне у привитых Y. pestis EV белых мышей во все сроки наблюдения практически не отличались от контроля, а лимфоцитов — имело низкие показатели.
У экспериментальных животных II группы на
3 — 7-е сутки имеет место увеличение бластных форм клеток в субкапсулярной зоне коры в 1,6 — 2,1 раза, на 14-е сутки — в 1,4 — 1,6 раза по сравнению с контролем и с последующим снижением до контрольных значений. Абсолютное содержание лимфоцитов во все сроки наблюдения не отличалось от таковых в контроле.
Количество лимфоцитов в мозговом слое тимуса на 3 — 7-е сутки было ниже, чем у интактных, что может быть связано с уменьшением повреждающего действия рецепторов лимфоцитов и, соответственно, снижением популяции дефектных клеток, задерживающихся в органе. К 21-м суткам содержание этих клеток в тимусе приближалось к показателю в контроле. По содержанию макрофагов в контрольной и подопытной группе различий не установлено. На 7-е сутки наблюдения в опытной группе имело место увеличение количества эпителиальных клеток (в 1,5 раза), на 14-е сутки — в 1,2 раза, а на 21-е сутки соответствовало контролю.
У мышей, иммунизированных комплексом Y. pestis EV с АГ, во все сроки наблюдения в субкапсулярной зоне коркового вещества тимуса имеет место увеличение в пределах в 1,2 — 2,0 раза (р < 0,05)
188
пмимппииимп ммпммгп □ I i i i ii iii □ nil iiiii
Таблица 1
Клеточный состав коркового и мозгового вещества тимуса экспериментальных животных (М ± m)
Антиген Зона Клетки Сроки наблюдения, сутки
3-є 7-е 14-е 21-е
У. ревґів EV КВ БК 7,1 ± 0,5* 8,2 ± 0,7* 6,7 ± 0,7* 4,9 ± 0,7
Л 52,9 ± 0,5 64,4 ± 0,3 75,3 ± 0,5 85,2 ± 0,9*
РЭК 1,4 ± 0,1 1,4 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,3 ± 0,1
МВ Л 39,8 ± 0,3 32,4 ± 0,5* 32,1 ± 0,5* 33,5 ± 0,4*
МФ 2,0 ± 0,7 2,8 ± 0,7 2,9 ± 0,7 1,8 ± 0,7*
РЭК 4,8 ± 0,7* 4,8 ± 0,8* 3,5 ± 0,7 2,8 ± 0,4
У. ревґів EV +АГ КВ БК 8,6 ± 0,1* 10,6 ± 0,2* 9,1 ± 0,3* 6,2 ± 0,4
Л 82,6 ± 0,8* 77,1 ± 0,3 76,6 ± 0,9 88,2 ± 0,3
РЭК 1,7 ± 0,1 1,9 ± 0,2 2,1 ± 0,1* 2,2 ± 0,1*
МВ Л 36,9 ± 0,9* 35,1 ± 0,5* 36,5±0,3 41,0 ± 0,3*
МФ 2,0 ± 0,5 4,9 ± 0,7* 3,0 ± 0,4 2,9 ± 0,2*
РЭК 7,8 ± 0,5* 7,6 ± 0,4* 5,2 ± 0,7* 4,9 ± 0,7*
АГ КВ БК 8,5 ± 0,2* 9,7 ± 0,3* 7,3 ± 0,2* 5,6 ± 0,1
Л 58,9 ± 0,4 68,7 ± 0,5 67,2 ± 0,3 67,7 ± 0,7
РЭК 1,5 ± 0,1 1,7 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,1
МВ Л 34,3 ± 0,4* 36,8±0,3* 41,8 ± 0,2 45,9 ± 0,6
МФ 2,2 ± 0,3 2,9 ± 0,1 2,6 ± 0,3 2,5 ± 0,1
РЭК 3,4 ± 0,2 4,7 ± 0,2* 3,9 ±0,4* 3,4 ± 0,2
Контроль КВ БК 5,2 ± 0,2
Л 66,8 ± 0,5
РЭК 1,3 ± 0,1
МВ Л 46,5 ± 0,6
МФ 2,6 ± 0,2
РЭК 3,1 ± 0,1
Примечание: КВ - корковое вещество; МВ - мозговое вещество; БК - бластные формы клеток; Л - лимфоциты; МФ -макрофаги; РЭК - ретикулоэпителиальные клетки; * - р < 0,05; ** - р < 0,01 (по сравнению с контролем).
количества малодифференцированных бластов по сравнению с животными, привитыми Y. pestis EV. Таким образом, последующая дифференцировка и созревание бластных форм клеток приводит к повышению к 14 — 21-м суткам содержания зрелых лимфоцитов, как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса животных опытной группы. Установлено, что на 14 — 21-е сутки эксперимента количество ретикулоэпителиальных клеток в корковом веществе тимуса повышается в 1,5 — 1,6 раза, в отличие от белых мышей I группы. В мозговом веществе тимуса число этих клеток с 7-х по 21-е сутки возрастает. Причем, содержание ретикулоэпителиальных клеток у животных, иммунизированных Y pestis EV в сочетании с АГ, по сравнению с I опытной группой в 1,6 раза больше (р < 0,05).
Количество макрофагов в мозговом веществе тимуса к 7-м суткам в 1,6 раза превышает показатели у белых мышей, привитых Y. pestis EV, что указывает на функциональную перестройку органа. Однако к 21-м суткам наблюдается тенденция к снижению их содержания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, введение арабиногалактана в сочетании с Y. pestis EV экспериментальным животным предупреждает истощение бластных форм клеток в костномозговом пуле, стимулирует созревание эритроцитов, гранулоцитов и лимфоцитов, а также нормализует количество зрелых клеток.
Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют о том, что для всех изменений в тимусе характерна двухфазность. Так, наблюдаемое в первые сроки после введения Y. pestis EV в сочетании с АГ увеличение количества малодифференцированных бластов сменяются активизацией пролиферативных процессов, увеличением количества лимфоцитов, активированных макрофагов и ретикулоэпителиальных клеток. Сравнительный анализ показал, что тимус экспериментальных животных обладает высокой чувствительностью к воздействию иммуномодулятора растительного происхождения — араби-ногалактана.
ПІІІІІІІІІІІІІІІІІІІПІІІІІІ ІІІІГП □ I I I I I I III □ ПІ ІІІІІ I
189
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфоме-трия. — М.: Медицина, 1990. — 384 с.
2. Витязева С.А. Закономерности формирования иммунного ответа макроорганизма на введение Yersinia pestis EV с иммуномодуляторами: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Иркутск, 2009. — 22 с.
3. Гаврилова О.В. Патогенетическое обоснование коррекции нарушений в эритроидном звене системы крови при экзоинтоксикациях и стрессе с помощью арабиногалактана: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Иркутск, 2007. — 27 с.
4. Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник. — М.: РИЦ МДК, 2000. — 487 с.
5. Глушкова Т. Г. Морфофункциональные показатели эритроидных элементов красного костного мозга и периферической крови при де-симпатизации: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Саранск, 2004. — 24 с.
6. Дубровина В. И. и др. Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных. — Иркутск: Аспринт, 2007. — 145 с.
7. Меньшиков В.В. и др. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник. — М.: Медицина, 1987. — 364 с.
8. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. — Л.: Медицина, 1969. — 423 с.
Сведения об авторах
Витязева Светлана Александровна - к.м.н., научный сотрудник отдела микробиологии чумы Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Старовойтова Татьяна Пантелеевна - научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40)
Дубровина Валентина Ивановна - д.б.н., старший научный сотрудник, зав. лабораторией патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Грищенко Людмила Анатольевна - к.х.н., научный сотрудник Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН Мухтургин Геннадий Борисович - м.н.с. даборатории экспериментальных животных Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40)
190
niiiiiiMiiiiiiiiiiin ммпмигп □ I и I г □ nil I II ii
