Клеточный состав печени и селезенки в фетальном периоде Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

I I I I I I

ГЕ^КШ

Ш

Тема выпуска: трансплантация фетальных клеток и тканей

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточный состав печени и селезенки в фетальном периоде

K.M. Абдулкадыров, B.A. Балашова

Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург

Human fetal liver and spleen (Cell composition]

K.M. Abdulkadyrov, V.A. Balashova

Scientific research institute of Hematology and Transfusiology, St.Petersburg, Russia

Изучен клеточный состав 76 отпечатков фетальной печени человека в сроки от 6 до 27 недель гестации. На протяжении всего периода печеночного кроветворения преобладал эритропоэз. В течение 6-7 недель первичные эритробласты составляли 25% всей эритроидной популяции, а в 22-27 недель их содержание снизилось до 1,5%. Содержание нейтрофильных лейкоцитов колебалось в пределах 1-1,5%. Недифференцированные бластные клетки составили от 2,9±0,5 до 5,1±1,01 % от всей клеточной популяции. Наибольшее их количество было отмечено в 6-8 недель и в 18-21 неделю. Клеточный состав фетальной селезенки был изучен у 10 плодов 10-25 недель гестации. В этот период лимфоциты составили 85% от всех клеток органа, из них 2,9±0,4% оценены как лимфобласты и 0,3±0,1% - как недифференцированные бласты. Исследование колониеобразующей способности гемопоэтических клеток также подтверждает, что самое высокое содержание миелоидных предшественников в фетальной печени и селезенке имеет место в период 9-21 недели развития плода, когда, вероятно, можно ожидать наибольший эффект от трансплантации этого органа.

Ключевые слова: фетальная печень, фетальная селезенка, клеточный состав.

Cell composition has been studied in hepatic reprints of 76 human fetuses between 6-27 weeks of development. Erythropoiesis predominates during the whole period of hepatic hemopoiesis. During 6-7 weeks primary erythroblasts make 25% of all erythroid cells, and by the 22d-27th weeks their content does not even reach 1,5%. Content of neutrophilic leucocytes is 1 - 1,5%. Nondifferentiated blast cells make 2,9±0,5 - 5,1 ± 0,1%. Their greatest amount is observed between 6 - 8 and 18 and more weeks. The cell composition of the fetal spleen has been studied in 10 fetuses 19-25-week-old. Lymphoid forms make 85% of all cells of the organ's hemopoietic tissue, of them 2,9±0,4% are lymphoblasts, 0,3±0,1% - nondifferentiated blasts. The investigations studying colonyforming properties of the hematopoietic cells confirmed that the highest content of myeloid precursors in the fetal liver and spleen is noted between 9-21 weeks of age. Therefore, it is possible to expect the greatest effect of these organ's transplantation during this time.

Key words: fetal liver, fetal spleen, cell composition.

Введение

Клетки эмбриональных и фетальных органов человека, как и клетки пуповинной крови, давно привлекают внимание исследователей и практиков как богатый источник гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Большой интерес представляет эмбриональная печень [ЭП), уникальность которой заключается в том, что в период от 4 до 16 недель гестации в ней происходит активное кроветворение, и она в этот период содержит большое количество ГСК и их потомков. Низкая иммуногенность стволовых клеток ЭП делает их использование для нужд трансплантации еще более привлекательным [1-6].

Первые гемопоэтические клетки наблюдаются у 3-х-не-дельного зародыша человека в стенке желточного мешка. Недифференцированные клетки эмбриона - «мезобласты» -дифференцируются в первичные примитивные эмбриональные эритробласты с мегалобластическими чертами и в первичные эндотелиальные клетки, образующие сосудистую сеть желточного мешка. Несколько позже в желточном мешке из «мезобластов» возникают другие бластные клетки, дающие начало вторичным или окончательным эритробластам и эритроцитам [7, 8]. Здесь же, на 3-4 неделе развития, выявляются первые CD34+ клетки-предшественники гемопоэза.

Печень закладывается на 4 неделе гестации. Из желточного мешка в неё мигрируют ГСК, так что к 4-6 неделе в эмбриональной печени начинается гемопоэз, и она становится

главным местом кроветворения, в то время как в желточном мешке гемопоэз редуцируется [9-12]. Это печеночный или гепато-лиенальный период кроветворения. Гемопоэз в селезенке начинается на 8-10 неделе эмбриогенеза и максимум её гемопоэтической активности приходится на 16-ю неделю развития [13, 14]. Печеночная ткань представлена гепатоцитами - производными энтодермы и кроветворными клетками - производными мезодермы. Первичные элементы крови в печени представляют собою полипотентные стволовые клетки (ПСК), которые дифференцируются в первичные эритробласты и недифференцированные бластные элементы - предшественники лейкоцитов и нормобластической ветви эритрона [15]. Преобладание эритропоэза в период печеночного кроветворения отмечают все исследователи, изучавшие гемопоэз в ЭП [6, 16, 17]. В то же время, уже на ранних стадиях развития эмбриона выявляются скопления цитохимически недифференцированных бластных клеток, окруженных первичными эритроидными элементами и клетками нормобластического эритропоэза [4, 17-21]. Довольно рано в ЭП появляются немногочисленные гранулоциты, моноциты, макрофаги.

Соотношение эритроидных и гранулоцитарных элементов равно 5:1 у 5-6-недельных зародышей и 2:1 у 24-недельных [22]. Более зрелые дефинитивные эритроидные клетки обнаруживаются в печени уже на 6-й неделе гестации, а к 21-й неделе примитивные эритроидные элементы

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 1, 2008

I I I I I I

ГЕ^КШ

Тема выпуска: трансплантация фетальных клеток и тканей

уже почти полностью в ней отсутствуют [21]. Согласно M. Tavian, В-лимфоцитопоэз начинается в ЭП около 9-й недели гестации [8], но по данным других исследователей иммунофенотипический анализ не выявил фенотипически и функционально зрелых В- и Т-лимфоцитов в печени 9-10-недельных эмбрионов [23]. Лишь у 13-22-недельных плодов человека в клеточной суспензии печени были обнаружены Т-лимфоциты [23, 24]. Авторы делают вывод, что в печени эмбрионов первых трех месяцев жизни не содержатся клетки, способные вызвать реакцию «трансплантат против хозяина» [РТПХ) при трансплантации.

Клиническое применение криоконсервированных клеток человеческой ЭП является актуальным [6]. Деконсервиро-ванная суспензия клеток ЭП содержит большое количество гликофорин А+-позитивных эритроидных клеток - предшественников различных уровней коммитирования и созревания. Содержание CD45+ клеток в печени плодов 6-12 недель гестации составляет более 2% [6, 23].

Изучение фенотипа и функциональной активности ГСК эмбриональной и фетальной печени показало, что этот орган во втором триместре является богатым источником CD34+ клеток [6, 25]. Содержание CD34+ и АС-133+ - гемопоэти-ческих клеток - предшественников составляет, по некоторым данным, 0,9±0,1 и 0,4±0,1% соответственно [6]. При культивировании деконсервированных клеток ЭП в культуральной среде на основе метилцеллюлозы в присутствии ростовых факторов получено более 500 колоний - КОЕ-ГЭММ, БОЕ-Э, КОЕ-ГМ - на 1х105 мононуклеаров [6]. Показано, что колониеобразующая способность [КОС) клеток ЭП 6-12-недельных эмбрионов значительно выше, чем таковая у клеток костного мозга взрослого человека и пуповинной крови [6, 26, 27]. На колониеобразующую способность клеток ЭП влияет возраст эмбрионов и плодов. Деконсер-вированные клеточные суспензии ЭП 6-9-недельных эмбрионов содержат в 3 раза большее количество КОЕ-ГЭММ, чем образцы печени 10-12-недельных зародышей [6], то есть с увеличением гестационного возраста КОС клеток печени снижается.

Согласно культуральным исследованиям, проведенным в нашем институте, пик пролиферативной активности стволовых клеток (СК) эмбриональной печени приходится на 9-10-ю неделю, а второй подъем на 21-ю неделю [26, 28].

Таким образом, криоконсервированные клетки ЭП содержат гемопоэтические СК, способные к мультилинейной дифференцировке in vitro. Из этого следует, что ГСК эмбриональной печени являются перспективным источником для трансплантации [2, 6, 29, 30].

Принимая во внимание перспективы использования клеток ЭП для трансплантации, мы изучали клеточный состав фетальной печени и селезенки человека [31]. Целью исследования было выявить наиболее активные периоды гемо-поэза в печени и селезенке эмбриона и плода в различные сроки гестации.

Материал и методы

Органы получали от эмбрионов и плодов человека в возрасте 6-27 недель внутриутробного развития. Клеточный состав органов изучали в отпечатках на предметных стеклах; окрашивали по Май-Грюнвальду. Гепатограммы и спле-нограммы подсчитывали в световом микроскопе на 1000 клеток, результат выражали в процентах. Цифровые данные подвергали вариационно-статистической обработке по Стьюденту-Фишеру. Изучены 76 отпечатков эмбриональной и фетальной печени в период 6-27 недель развития. Образцы селезенки исследованы у 10 плодов в возрасте 19-25 недель.

Результаты и обсуждение

При изучении 76 отпечатков печени от 76 эмбрионов и плодов были выделены следующие возрастные группы: 6-7 недель [1 группа), 8-9 недель [2 группа), 10-11 недель [3 группа), 12-13 недель [4 группа), 17-21 неделя [5 группа), 22-27 недель [6 группа).

Из таблицы видно, что на всём протяжении исследуемых периодов в печени преобладает эритропоэз. Общее содержание клеток эритроидного ростка составляет более 80%.

Первичные эритроидные элементы демонстрируют все морфологические стадии созревания, присущие мегалоб-ластам. Среди них были выделены следующие клетки:

1. Первичные проэритробласты - крупные бластные клетки с диаметром от 15 до 23 мкм с разреженной структурой ядерного хроматина, одним-двумя крупными нуклеолами, резко базофильной цитоплазмой.

2. Первичные базофильные эритробласты - клетки диаметром от 15 до 25 мкм, с «ажурным» ядром и базофиль-ной цитоплазмой. Ядрышки очерчены нечетко.

3. Первичные полихроматофильные эритробласты -клетки диаметром от 15 до 27 мкм с полихроматофильной цитоплазмой. Ядрышки не определяются.

4. Первичные оксифильные эритробласты - клетки диаметром от 18 до 27 мкм, с небольшим плотным, часто эксцентрически расположенным ядром и оксифильной цитоплазмой. В отпечатках встречаются также мегалоци-ты - утратившие ядра первичные эритробласты.

Количество первичных эритробластов с увеличением срока развития плода постепенно уменьшается. Так, если в 6-7 недель первичные эритробласты составляют четвертую часть всех эритроидных клеток, то в период 22-27 недель их содержание не достигает и 1,5%. Различия статистически достоверны для первичных проэритробластов в группах 1-3 [р < 0,05); 1-5, 1-6, 2-3, 2-5, 2-6, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 [р < 0,01). Содержание первичных эритробластов также достоверно снижается вплоть до 17-21-й недели развития. Соответственно общее содержание нормобластических эрит-роидных элементов с возрастом плода увеличивается, хотя имеет место снижение содержания эритробластов [достоверны различия в группах 2-5, [р < 0,001) и базофильных нормобластов [достоверны различия в группах 1 -5, [р < 0,01); 1 -6, [р < 0,001); 2-6, 2-7 [р < 0,001); 3-5, 3-6, [р < 0,01); 4-5, 4-6, [р < 0,05). В период от 17 и более недель эритроидное кроветворение в фетальной печени уже почти полностью нор-мобластическое. Кроме эритроидных элементов уже на ранних стадиях развития отмечены клетки нейтрофильного ряда.

Содержание нейтрофилов в рассматриваемых группах колеблется в пределах 1 -1,5%. Наблюдается некоторая тенденция к увеличению содержания клеток нейтрофильного ряда с увеличением срока развития плода. Статистически достоверные различия получены для промиелоцитов в группах 1-2 [р < 0,05) и 2-5 [р < 0,05), для метамиелоцитов в группах 1-6 [р < 0,01) и 5-6 [р < 0,05), для палочкоядерных нейтро-филов в группах 1-4 [р < 0,05), 1- 5 [р < 0,05) и сегментоядерных нейтрофилов в группах 2-6 [р < 0,05) и 4-6 [р < 0,05).

Подобная картина наблюдается и в отношении эозинофи-лов и базофилов, содержание которых повышается с увеличением возраста плода. Для эозинофилов статистически достоверные различия получены в группах 1-5 [р < 0,05), 1-6 [р < 0,01), 2-6 [р < 0,01), 3-6 [р < 0,01), 4-6 [р < 0,05).

Также имеет место увеличение содержания моноцитов для групп 1-5 [р < 0,05), 1-6 [р < 0,01), 2-6 [р < 0,01), 3-6 [р < 0,05), 4-6 [р < 0,01).

Содержимое макрофагов и мегакариоцитов в период от 6 до 27 недель остается стабильным.

Наиболее выраженная динамика наблюдается в содержании лимфоцитов, которое увеличивается от 0 в период

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 1, 2008

■ И I II II

Тема выпуска: трансплантация фетальных клеток и тканей

6-7 недель до 10,0 ±1,5% в период 22-27 недель. Различия для всех групп, кроме 2-4 и 3-4, статистически достоверны [р < 0,01 и < 0,001). По морфологическим признакам это малые лимфоциты диаметром 6-7мкм.

Таким образом, около 95% всех гемопоэтических клеток в фетальной печени - это дифференцирующиеся и зрелые элементы, подавляющую часть которых составляют клетки эритроидного ряда. Представляет интерес группа бластных клеток, названных нами недифференцированными. Их содержание колеблется от 2,9±0,5 до 5,1±1,01%. Различия статистически достоверны для групп 1-2 и 1-4. Наибольшее количество недифференцированных бластных клеток наблюдается в период 6-8 и 17-21 недель, что соответствует данным А.А. Ракова с соавт. [28], изучавших КОС гранулоцитомоноцитарных предшественников фетальной печени человека и показавших, что на 9-й и 21-й неделе в печени плода отмечается наиболее высокое содержание миелоидных предшественников.

В определенной степени можно судить о пролиферативном потенциале этих клеток на основании изучения КОС гемопоэтических клеток ЭП. При помощи таких экспериментов, проведенных в нашем институте [26], было установлено, что относительное содержание коммитированных стволовых клеток миелоидного ряда в эмбриональной печени в несколько раз выше, чем в костном мозге взрослого человека. Отсюда можно заключить, что ЭП в период до 27 недель - орган очень активного кроветворения.

Нами был изучен клеточный состав фетальной селезенки у 10 плодов в возрасте 19-25 недель. Небольшой

материал не позволил нам провести исследования в различных возрастных группах. Клеточный состав фетальной селезенки плодов в возрасте от 19 до 25 недель внутриутробного развития уже довольно однороден - 85,0% всего клеточного состава приходится на лимфоидные клетки, среди которых 2,9±0,4% составляют лимфобласты, 4,7±0,7% пролимфоциты и 77,4±1,5% - лимфоциты. Содержание гранулоцитов невелико и не превышает 4,2%, из них 1,7±0,3% и 0,9±0,2% приходится, соответственно, на долю эозинофилов и базофилов. Эритроидные элементы составляют 9,4%. Содержание недифференцированных бластов составило 0,3% диаметром от 14,3±0,44 до 15,85±0,2мкм. Они характеризуются высоким ядерноцитоплазматическим соотношением, нежно-зернистой структурой ядерного хроматина, наличием 1-4 ядрышек. Цитоплазма от светло-голубой до базофильной, включений не содержит.

Изучение КОС миелоидных предшественников эмбриональной селезенки показало, что содержание СК в селезенке плода 18-21 недель развития значительно превышает их содержание в костном мозге взрослого человека [26].

Это дает основание рассматривать также и фетальную селезенку как возможный источник стволовых полипотентных клеток.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют считать, что в фетальной печени и селезенке человека содержатся СК клетки, и эти органы могут рассматриваться как перспективные источники выделения ГСК в целях трансплантации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kelemen E. Recovery from chronic idiopathic bone marrow aplasia of a young mother after intravenous injections of unprocessed cells from the liver [and yolk sac) of her 22 mm CR-length embryo. A preliminary report. Scand. J. Haematol. 1973а; 10 [2): 305-8.

2. Touraine I.L. Transplantation of stem cells from fully mismatched donors. Bone marrow transplant. 2007; 39 suppl 1: 42-3.

3. Kansal V., Soоd S.K., Barta A.K. et al. Fetal liver transplantation in aplastic anemia. Acta Haematol. 1979; 62 [3): 128-36.

4. Fukuda T. Fetal hemopoiesis II. Electron microscopic studies on human hepatic hemopoiesis. Virchows Arch. B. Cell. Pathol. 1974; 16[3): 249-70.

5. Fukuda T. Ultrastructure of fetal hemopoiesis. Acta Haematol. 1978; 41[6): 1204-13.

6. Tarasov A.I., Petrenko A.Yu.., Jones D.R.E., Grischenko V.I. Phenotypic analysis and colony - forming activity of cryopreserved hemopoietic cells in human fetal liver. Experimental Oncol. 2002; 24: 180-3.

7. Orkin S.H., Zon L.I. Hematopoiesis and stem cells: plasticity versus developmental heterogeneity. Nature immunol. 2002; 3[4): 323-8.

8. Tavian M., Cortes F., Charbord P. et al. Emergence of the haematopoietic system in the human embryo and fetus. Haematologica. 1999; 84 Suppl EHA-4:1: 1-3.

9. Яновский Д.Н. Руководство по клинической гематологии. Киев, УССР: Госмедиздат; 1962.

10. Migliaccio G., Migliaccio A.R., Petti S. et al. Human embryonic hemopoiesis[ Kinetics of progenitors and precursors underlying the yolk -sac ? liver transition. J. Clin. Invest. 1986; 78: 51-60.

11. Приндул Г. Гемопоэз в желточном мешке. Гематол. и трансфузиол. 1999; 43 [3): 14-5.

12. Чертков И.Л., Дризе Н.И., Воробьев А.И. и соавт. Кроветворение. В кн.: Руководство по гематологии. [ред. А.И.Воробьев). М., 2002; 1: 28-43.

13. Kelemen E., Calvo W., Fliedner T.M. Atlas of human hemopoietic development. Berlin: Springer Verlag; 1979.

14. Ichikawa H. Differentiation of red pulp and evaluation of hemopoietic role of human prenatal spleen. Arch. Histol. Jap. 1985; 48[2): 183-97.

15. Oguro M., Koizumi F., Sasagawa S. Blood cells in the peripheral blood and hematopoietic organs of the human fetus during hepatic hematopoiesis. Acta Haematol. 1978; 41[6): 1231-41.

16. Герасимова Л.П. Колониеобразующая способность различных кроветворных и лимфоидных органов в процессе эмбрио- и фетогенеза человека. Пробл. гематол. 1980; 5: 45-8.

17. Глузман Д.Ф. Диагностическая цитохимия гемобластозов. Киев: Наукова думка; 1978.

18. Козинец Г.И., Шиш^нова З.Г., Сарычева Т.Г. и соавт. Клетки крови и костного мозга. Атлас. М. 2004.

19. Kelemen E., Petranyi Yu.Ir., Puskas E. Haemopoietic cell clusters too immature to permit classification in early human embryonic liver. A preliminary report. Haematologia 1973b; 3-4: 419-20.

20. Kelemen E., Light microscopy of scattered unprocessed hemopoietic precursor cells in liver smears of a 6,35 mm crown rump length human embryo. Exp. Hematol. 1974; 2[3): 118-27.

21. Глузман Д.Ф., Бебешко В.Г., Надгорная В.А. и др. Эмбриональное кроветворение и гемобластозы у детей. Киев: Наукова думка; 1988.

22. Алексеев И.В., Замараева И.В., Владимирская Е.Б., Курмашева Н.А. Развитие системы кроветворения у плода человека. Гематол. и трансфузиол. 1995; 4[5): 26-9.

23. Петренко Ю.А. Иммунорегуляторные свойства клеток фетальной печени человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007; II[3): 57-61.

24. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина; 1999.

25. Golfier F., Barcena A., Cruz J. et al. Mid-trimester fetal livers are a rich source of CD34+/++ cells for transplantation. Bone Marrow Transplant. 1999; 24: 451-61.

26. Раков А.А., Блинова Т.С., Бубнов А.Н. Коммитированные грануломоноцитарные предшественники в эмбриональных органах человека. Цитология 1981, 23[4): 427-31

27. Grischenko V.I., Tarasov A.I., Rudenko S.V., Petrenko A.Yu. The sensitivity of human fetal liver cells of 7-12 weeks of gestation to programmed freesing and cyclic freeze-thawing. Probl. Cryobil. 2000; 4: 37-44.

28. Раков А.А., Блинова Т.С., Афанасьев Б.В. и др. Особенности миелопоэза в эмбриональной печени человека. Бюлл. экспер. биол. 1982; 94 [11): 92-4.

29. Touraine J.L., Raudrant D., Laplace S. Transplantation of hemopoietic cells from the fetal liver to treat patient with congenital diseases postnatally or prenatally. Transplant Proc. 1997; 29: 712-3.

30. Touraine J.L. Perinatal fetal-cell and gene therapy. Int. J. Immunopharmacol. 2000; 22: 1033-40.

31. Каргин В.Д., Абдулкадыров К.М. Применение трансплантаций эмбриональных гемопоэтических и лимфоидных органов и клеток при лечении заболеваний системы крови. Гематол. и трансфузиол. 1983; 7: 16-22.

Поступила 24.10.2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 1, 2008