CC BY
0
УДК 617.713-001.37:615.355:1-092.9
DOI: 10.31549/2542-1174-2023-7-1-89-109
Клеточный состав экспериментальной химической раны роговицы после воздействия пегилированными ферментами гиалуронидазы и субтилизина
В.Е. Забанова1' 2, К.И. Ершов1' 2, М.С. Селякова1, Н.П. Леонов2, Г.И. Байкалов1' 2, А.Ж. Фурсова1' 2, А.П. Надеев1' П.Г. Мадонов1' 2
ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Новосибирск, Россия
2Институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия
АННОТАЦИЯ
Введение . В условиях химического повреждения роговицы существенно нарушается ее клеточная структура' нуждающаяся в экстренной высокодифференцированной регенерации без выраженного пролиферативного компонента воспаления и экспансии иммунокомпетентных клеток для создания антимикробного потенциала. С целью фармакологической инициации этих процессов патогенетически обосновано исследование локального применения ферментных препаратов противовоспалительного действия' таких как субтилизин и гиалуронидаза. Цель . Изучить влияние гиалуронидазы и субтилизина' пегилированных по технологии электронно-лучевого синтеза на полиэтиленгликоле (ПЭГ)' на количество иммунокомпетентных клеток в области химической раны роговицы при их субконъюнктивальном и местном введении.
Материалы и методы . На 28 кроликах выполнено экспериментальное исследование влияния ферментов гиалуронидазы и субтилизина' пегилированных по технологии радиационного синтеза' на клеточный состав химической раны роговицы. Травму роговицы моделировали' используя методику щелочного ожога Обен-берга. В правый глаз животного местно или субконъюнктивально вводился ПЭГ-субтилизин или ПЭГ-гиалуронидаза в зависимости от группы распределения' левый глаз животного использовался как контроль - в него вводили 0.9% ЫаС1. После проведения эксперимента выполнена энуклеация глаз животных. Полученный биоматериал использовали для приготовления гистологических препаратов с последующим их морфологическим изучением. Результаты . Общее количество клеток в группах местного и субконъюнктивального применения ПЭГ-субтилизина составило 43 (40; 52) и 73 (33; 92)' а субконъюнктивального применения ПЭГ-гиалуронидазы - 46 (37; 61)' что оказалось выше количества клеток при применении 0.9% ЫаС1 в этих группах (р < 0.01) и выше (р < 0.0001) количества клеток в группе местного применения ПЭГ-гиалуронидазы. Общее количество клеток при местном введении ПЭГ-гиалуронидазы составило 15 (13; 16)' при местном применении 0.9% ЫаС1 в данной группе -также 15 (14; 18) (р = 0.38). Количество нейтрофилов при применении ПЭГ-субтилизина составило 1 (1; 2) при местном и 0 (0; 1) при субконъюнктивальном применении' а при применении ПЭГ-гиалуронидазы - 0 (0; 0) как при местном' так и субконъюнктивальном пути введения.
Заключение . Введение ПЭГ-гиалуронидазы субконъюнктивально и ПЭГ-субтилизина как местно' так и субконъюнктивально приводит к усиленной миграции иммунокомпетентных клеток в зону химического повреждения роговицы' при этом миграция нейтрофилов незначительна. Она полностью отсутствует при применении ПЭГ-гиалуронидазы субконъюнктивально. Местное применение ПЭГ-гиалуронидазы не вызывает выраженного клеточного ответа иммунокомпетентных клеток в области химической раны роговицы' и эффект применения сравним с применением 0.9% ЫаС1.
Ключевые слова: пегилированная гиалуронидаза' пегилированный субтилизин химическая травма глаза' клеточный состав раны.
Образец цитирования: Забанова В.Е., Ершов К.И., Селякова М.С., Леонов Н.П., Байкалов Г.И., Фурсова А.Ж., Надеев А.П., Мадонов П.Г. Клеточный состав экспериментальной химической раны роговицы после воздействия пегилированными ферментами гиалуронидазы и субтилизина // Journal of Siberian Medical Sciences. 2023;7(1):89-109. DOI: 10.31549/2542-1174-2023-7-1-89-109
Поступила в редакцию 23.01.2023 Прошла рецензирование 31.01.2023 Принята к публикации 14.02.2023
Автор, ответственный за переписку
Забанова Виктория Евгеньевна: ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России. 630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52. E-mail: vikazabanova@gmail.com
Received 23.01.2023 Revised 31.01.2023 Accepted 14.02.2023
Corresponding author
Viktoriya E. Zabanova: Novosibirsk State Medical University, 52, Krasny prosp., Novosibirsk, 630091, Russia. E-mail: vikazabanova@gmail.com
Cellular composition of an experimental chemical injury to the cornea after exposure to PEGylated hyaluronidase and subtilisin enzymes
V.E. Zabanova1' 2, K.I. Ershov1' 2, M.S. Selyakova1, N.P. Leonov2, G.I. Baykalov1' 2, A.Zh. Fursova1' 2, A.P. Nadeev1, P.G. Madonov1' 2
Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia
2Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia
ABSTRACT
Introduction. Under conditions of chemical damage to the cornea' its cellular structure is significantly disrupted' requiring emergency highly differentiated regeneration without an expressed proliferative component of inflammation and expansion of immunocompetent cells to gain an antimicrobial potential. For the purpose of pharmacological initiation of these processes' the study of the topical administration of anti-inflammatory enzyme preparations' such as subtilisin and hyaluronidase' is pathogenetically justified.
Aim. To study the effect of hyaluronidase and subtilisin' PEGylated (polyethylene glycol - PEG) using the technology of electron beam synthesis on the number of immunocompetent cells in the area of the corneal chemical injury during their subconjunctival and topical administration.
Materials and methods. An experimental study of the effect of PEGylated hyaluronidase and subtilisin enzymes' on the cellular composition of the corneal chemical injury was performed on 28 rabbits. Corneal injury was modeled using the Obenberger alkali burn technique. PEG-subtilisin or PEG-hyaluronidase was applied topically or subcon-junctivally into the right eye of the animal' depending on the group' the left eye of the animal was used as a control - it was treated with 0.9% NaCl. After the experiment' enucleation was performed. The biomaterial obtained was used to prepare tissue specimens for morphological examination.
Results. The total count of cells in the groups of topical and subconjunctival administration of PEG-subtilisin was 43 (40; 52) and 73 (33; 92)' and subconjunctival injection of PEG-hyaluronidase - 46 (37; 61)' which was higher than the count of cells when using 0.9% NaCl in these groups (p < 0.01) and higher (p < 0.0001) cell numbers in the group of topical administration of PEG-hyaluronidase. The total count of cells with topical application of PEG-hyaluronidase was 15 (13; 16)' with topical application of 0.9% NaCl of this group - also 15 (14; 18) (p = 0.38). The neutrophil count with the use of PEG-subtilisin was 1 (1; 2) with topical and 0 (0; 1) with subconjunctival administration' and with the use of PEG-hyaluron-idase - 0 (0; 0) both with topical and subconjunctival administration.
Conclusion. The administration of PEG-hyaluronidase subconjunctivally and PEG-subtilisin both topically and subconjunctival^ leads to an increased migration of immunocompetent cells to the area of the corneal chemical injury' while the migration of neutrophils is insignificant. It is completely absent when PEG-hyaluronidase is injected subconjunc-tivally. Topical administration of PEG-hyaluronidase does not induce a pronounced cellular response of immunocompe-tent cells in the area of the corneal chemical injury' and the effect of the application is comparable to that of 0.9% NaCl. Keywords: PEGylated hyaluronidase' PEGylated subtilisin' chemical eye injury' cellular composition of a wound.
C itation example: Zabanova V.E., Ershov K.I., Selyakova M.S., Leonov N.P., Baykalov G.I., Fursova A.Zh., Nadeev A.P., Madonov P.G. Cellular composition of an experimental chemical injury of the cornea after exposure to PEGylated hyaluronidase and subtilisin enzymes. Journal of Siberian Medical Sciences. 2023;7(i):89-109. DOI: 10.31549/2542-1174-2022-7-1-89-109
ВВЕДЕНИЕ
Роговица - это часть фиброзной оболочки глаза, которая не имеет ни кровеносных, ни лимфатических сосудов и выполняет функцию химического, физического и биологического барьера. Кровеносные сосуды перилимбальной сети, представляющие собой гематоофтальмический барьер, являются своего рода входными и выходными воротами для иммунных клеток. Их мигра-
INTRODUCTION
The cornea is a part of the fibrous membrane of the eye that has neither blood nor lymphatic vessels, and functions as a chemical, physical and biological barrier. The perilimbal network, which is the blood-ocular barrier, is a kind of entrance and exit gates for immune cells. Their migration into the cornea provides antimicrobial protection and antiinflammatory processes following its damage. According to
ция в роговицу обеспечивает антимикробную защиту и противовоспалительные процессы после ее повреждения. По современным представлениям поверхность роговицы и конъюнктивы связана с лимфоидной тканью ^ucosa-associated lymphoid tissue - MALT). MALT поверхности глаза поддерживает баланс между воспалительной иммунной реакцией на патогенные агенты и толерантностью к непатогенным факторам, предотвращая, таким образом, развитие постоянной воспалительной реакции. Системой MALT опосредуются воспаление глазной поверхности, синдром сухого глаза, аллергические заболевания, травма. Клеточное представительство MALT-системы происходит из костного мозга и тимуса.
Регенерация эпителия роговицы происходит за счет эпителиальных стволовых клеток, которые располагаются в лимбальной нише (палисады Фогта). Регенерации роговицы способствует активный синтез интерлейкинов (IL-6 и IL-10), который осуществляется эпителиальными и иммунными клетками [1]. В экспериментах установлено, что IL-6 усиливает миграцию клеток и заживление ран эпителиальных клеток роговицы кроликов [2-4]. IL-10 подавляет продукцию провоспалительных цитокинов, интерферона, пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, а также секрецию активированными моноцитами IL-1-бета, ФНО-альфа (фактора некроза опухоли) и IL-6 [2].
Химическая травма роговицы является одним из самых распространенных повреждений глаза. По своей патофизиологической сущности этот процесс проходит все три стадии воспаления. При этом есть несколько весьма важных особенностей, которые, в отличие от химического повреждения мягких тканей и слизистых, обусловливают высокий риск инвалидизирующих осложнений. При эпителиостромальных повреждениях роговицы цитокины, высвобождаемые из поврежденного эпителия, включая IL-1 и ФНО-альфа, опосредуют гибель кератоцитов через систему лигандов Fas-Fas. Выжившие керато-циты, которые не подверглись апоптозу, модулируются поступающим в строму IL-1 для производства хемокинов, включая моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (MCAF), гранулоцитарный колониестимулирую-щий фактор (G-CSF), нейтрофильный активирующий пептид (ENA-78) и моноцитарный нейтрофильный хемотаксический фактор (MDNCF). Кератоциты подвергаются митозу через 12-24 ч после травмы с дальнейшей способностью диф-
modern concepts, the surface of the cornea and conjunctiva is bound with lymphoid tissue (mucosa-associated lymphoid tissue - MALT). Ocular surface MALT maintains a balance between the inflammatory immune response to pathogens and tolerance to non-pathogenic factors, thus preventing the development of a permanent inflammatory response. The MALT system mediates inflammation of the ocular surface, dry eye syndrome, allergic diseases, and trauma. The cell subset of the MALT system originates from the bone marrow and thymus.
Regeneration of the corneal epithelium occurs due to epithelial stem cells which are located in the limbal niche (palisades of Vogt). Corneal regeneration is facilitated by the active expression of interleu-kins (IL-6 and IL-10), which is carried out by epithelial and immune cells [1]. Experiments have shown that IL-6 enhances cell migration and wound healing of rabbit corneal epithelial cells [2-4]. IL-10 suppresses the production of pro-inflammatory cyto-kines, interferon, the proliferative response of T cells to antigens and mitogens, as well as the secretion of IL-1 beta, TNF-alpha (tumor necrosis factor) and IL-6 by activated monocytes [2].
Chemical injury of the cornea is one of the most common eye injuries. Pathophysiologically, this process goes through all three stages of inflammation. At the same time, there are several very important features that, in contrast to chemical injury of soft tissues and mucous membranes, determine a high risk of disabling complications. In epithelial-stromal injuries of the cornea, cytokines released from the damaged epithelium, including IL-1 and TNF-alpha, mediate keratocyte apoptosis via the Fas-Fas ligand system. Keratocytes that evaded the apoptosis are modulated by stromal IL-1 to produce chemokines, including monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), neutrophil activating peptide 78 (ENA-78), and monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (MDNCF). Keratocytes undergo mitosis 12-24 h after injury with a further ability to differentiate into fibroblasts and myofibroblasts and express a less organized collagen-fibrillar structure of the stroma, which contributes to scar formation [5].
Under conditions of chemical damage to the cornea, its cellular structure is significantly disrupted, requiring emergency highly differentiated regeneration without a pronounced proliferative component of inflammation and expansion of immunocompe-tent cells to gain an antimicrobial potential. For the purpose of pharmacological initiation of these processes, the topical application of enzyme preparations, which are actively used in surgical and thera-
ференцироваться в фибробласты и миофибро-бласты и экспрессировать менее организованную коллагеново-фибриллярную структуру стромы, что способствует формированию рубца [5].
В условиях химического повреждения роговицы существенно нарушается ее клеточная структура, нуждающаяся в экстренной высоко-дифференцированной регенерации без выраженного пролиферативного компонента воспаления и экспансии иммунокомпетентных клеток для создания антимикробного потенциала. С целью фармакологической инициации этих процессов весьма перспективно выглядит локальное применение ферментных препаратов, которые активно используются в хирургической и терапевтической практике [6, 7]. Препараты гиалуронидазы и субтилизина являются ферментными лекарственными средствами, которые в настоящий момент не получили широкого применения в лечении заболеваний роговицы. Однако эти ферменты широко используются в урологии, гинекологии, а также в лечении заболеваний легких и печени благодаря своим анти-пролиферативным и фибринолитическим свойствам. В последние годы появилось много отечественных публикаций о применении нового класса протеолитических ферментных препаратов - субтилизинов [8]. За рубежом статьи о применении субтилизинов появились 18 лет назад [9]. Из всего многообразия протеолитических ферментов субтилизины выделяются двумя основными свойствами: 1) они не обладают сайт-специфичностью по отношению к сочетанию аминокислот в белковой молекуле, которая, в свою очередь, существенно ограничивает возможности применения терапевтического протео-лиза; 2) субтилизины преимущественно гидро-лизуют те белковые молекулы, которые утратили свою нативную глобулу, либо вследствие разрушения четвертичной и третичной структуры и превращения в белковый детрит, либо вследствие полимеризации, как например, фибриноген, превратившийся в фибрин [10].
В настоящее время существует несколько офи-цинальных препаратов гиалуронидазы (гиалуро-нат-эндо-Р-М-ацетилгексозаминидазы - код фермента (КФ) 3.2.1.35). Широкое распространение получили Лидаза, Лонгидаза, Ронидаза. Данные препараты получают из семенников крупного рогатого скота (тестикулярная гиалурони-даза). Тестикулярная гиалуронидаза является 4-гликаногидролазой, а ее специфические субстраты - гликозаминогликаны (гиалуроновая кислота, хондроитин, хондроитин-4-сульфат,
peutic practice, looks very promising [6, 7]. Hyaluronidase and subtilisin preparations are enzyme drugs that are not currently widely used in the treatment of corneal diseases. However, these enzymes are widely used in urology, gynecology, and in the treatment of lung and liver diseases due to their antiproliferative and fibrinolytic properties. In recent years, many domestic publications have appeared on the use of a new class of proteolytic enzyme preparations, subtilisins [8]. Abroad, the articles on the use of subtilisins appeared 18 years ago [9]. Of the variety of proteolytic enzymes, subtilisins are distinguished by two main properties: 1) they do not have site-specificity for the combination of amino acids in a protein molecule which, in turn, significantly limits the possibilities of using therapeutic proteolysis; 2) subtilisins predominantly hydrolyze those protein molecules that have lost their native globule, either due to the destruction of the quaternary and tertiary structure and transformation into protein detritus or due to polymerization, such as fibrinogen, which has turned into fibrin [10].
Currently, there are several officinal preparations of hyaluronidase (hyaluronate-endo-ß-N-acetylhe-xosaminidase - Enzyme Commission number 3.2.1.35). Lydase, Longidaza, Ronidaza are widely used. These drugs are obtained from the testes of cattle (testicular hyaluronidase). Testicular hyaluronidase is a 4-glycanohydrolase, and its specific substrates are glycosaminoglycans (hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate), which form the basis of the connective tissue matrix. As a result of depolymerization (breaking the bond between C^1 acetylglucosamine and C^4 glucuronic or iduronic acids), under the influence of hyaluronidase, glycosaminoglycans lose their basic properties: viscosity, the ability to bind water, metal ions, the formation of collagenous proteins into fibers becomes more difficult, the permeability of tissue barriers increases, the movement of fluid in the intercellular space is facilitated, the elasticity of the connective tissue increases. The chemical properties of hyaluronidase are very successfully converted into pharmacological effects and allow us to consider it as a promising pharmaceutical substance for the treatment of traumas and degenerative diseases [11-19].
The pathogenetic rationale for the use of subtili-sin in chemical injury of the eye lies in the proteolysis of the cellular and protein detritus of the wound, a kind of general cleaning of the wound bed for subsequent repair of the cellular subset de novo. The role of hyaluronidase is the modification of the intercellular matrix for migration and facilitated homing of
хондроитин-6-сульфат), составляющие основу матрикса соединительной ткани. В результате деполимеризации (разрыва связи между С^-1 ацетилгюкозамина и С^4 глюкуроновой или идуроновой кислот) под влиянием гиалурони-дазы гликозаминогликаны теряют свои основные свойства: вязкость, способность связывать воду, ионы металлов, затрудняется формирование коллагеновых белков в волокна, увеличивается проницаемость тканевых барьеров, облегчается движение жидкости в межклеточном пространстве, увеличивается эластичность соединительной ткани. Химические свойства гиалурони-дазы весьма успешно конвертируются в фармакологические эффекты и позволяют рассматривать ее в качестве перспективной фармацевтической субстанции для лечения травматических и дегенеративных заболеваний [11-19].
Патогенетическое обоснование применения субтилизина при химической травме глаза заключается в протеолизе клеточно-белкового детрита раны, своего рода генеральной уборке раневого ложа для последующей репарации клеточного массива de novo. Роль гиалуронидазы -модификация межклеточного матрикса для миграции и облегченного хоминга клеток-предшественников для восполнения посттравматического тканевого дефекта.
Применение белковых лекарственных препаратов имеет ряд общеизвестных ограничений -низкая системная и тканевая биодоступность, аллергогенность, иммуногенность. Эти недостатки успешно устраняются при иммобилизации белковых препаратов на инертных носителях, например, на полиэтиленгликоле (ПЭГ) -пегилировании. Одним из методов пегилирова-ния является электронно-лучевой синтез, когда в потоке ускоренных электронов, образованном импульсным линейным ускорителем, происходит конъюгация белковой молекулы с полимерным носителем [20, 21]. Белковые препараты, подвергшиеся электронно-лучевому пегилиро-ванию, сохраняют свою нативную фармакологическую активность, при этом существенно улучшают свои фармакокинетические и токсикологические характеристики.
Субтилизин и гиалуронидаза могут проявлять плюрипотентные эффекты на тканевом уровне, особенно в условиях патологического процесса. Поскольку химическая травма глаза будет инициировать несколько саногенных процессов, представляется необходимым оценить влияние изучаемых ферментов на клеточный состав раны в части представительства основных иммуноком-
progenitor cells to compensate for a post-traumatic tissue defect.
The use of protein drugs has a number of well-known limitations - low systemic and tissue bioavailability, allergenicity, immunogenicity. These shortcomings are successfully eliminated by immobilization of protein preparations on inert carriers, for example, on polyethylene glycol (PEG) -PEGylation. One of the PEGylation methods is electron beam synthesis, when a protein molecule is conjugated with a polymer carrier in a stream of accelerated electrons generated by a pulsed linear accelerator [20, 21]. Protein preparations undergoing electron-beam PEGylation retain their native pharmacological activity, while significantly improving their phar-macokinetic and toxicological characteristics.
Subtilisin and hyaluronidase can exhibit pluripo-tent effects at the tissue level, especially under pathological conditions. Since chemical injury to the eye will initiate several sanogenic processes, it seems necessary to evaluate the effect of the studied enzymes on the cellular composition of the wound in terms of the pool of the main immunocompetent cells, the local presence of which will determine the final success of damage regeneration.
AIM OF THE RESEARCH
To study the effect of hyaluronidase and subtilisin PEGylated by the electron beam synthesis technology, on the number of immunocompetent cells in the area of the corneal chemical injury with their sub-conjunctival and topical administration.
MATERIALS AND METHODS
The studied preparations PEG-hyaluronidase and PEG-subtilisin were provided by Siberian Center of Pharmacology and Biotechnology, JSC (Novosibirsk, Russia). Electron beam PEGylation of both enzymes was carried out on polyethylene oxide (Macro-gol-1500) under a beam of accelerated electrons at a dose of 1.5 Mrad, generated by a pulsed linear accelerator ILU-10 (manufactured by the Budker Institute of Nuclear Physics, Novosibirsk). PEG-subtilisin is a light yellow lyophilized powder with an enzymatic activity of 5400 IU per 1 g of dry matter, easily soluble in crystalloid and colloidal solutions. Experimental dose - 300 IU/ml. PEG-hyaluronidase is a light gray lyophilized powder with an enzymatic activity of 2800 IU per 1 g of dry matter, easily soluble in crystalloid and colloidal solutions. Experimental dose - 150 IU/ml.
Laboratory rabbits are a conventional experimental test system for studying the specific activity of ophthalmic drugs. The study was performed with 28
петентных клеток, локальное присутствие которых будет обусловливать конечный успех регенерации повреждения.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучить влияние гиалуронидазы и субтили-зина, пегилированных по технологии электронно-лучевого синтеза, на количество иммуноком-петентных клеток в области химической раны роговицы при их субконъюнктивальном и местном введении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследуемые препараты ПЭГ-гиалуронидаза и ПЭГ-субтилизин предоставлены АО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии» (Новосибирск, Россия). Электронно-лучевое пеги-лирование обоих ферментов проведено на полиэ-тиленоксиде (Макрогол-1500) под пучком ускоренных электронов в дозе 1.5 Мрад, создаваемым импульсным линейным ускорителем ИЛУ-10 (производство - Институт ядерной физики имени Г.И. Будкера СО РАН, Новосибирск). ПЭГ-субтилизин представляет собой лиофилизиро-ванный порошок светло-желтого цвета с ферментативной активностью 5400 ЕД в 1 г сухого вещества, легко растворяющийся в кристаллоидных и коллоидных растворах. Экспериментальная доза - 300 ЕД/мл. ПЭГ-гиалуронидаза представляет собой лиофилизированный порошок светлосерого цвета с ферментативной активностью 2800 ЕД в 1 г сухого вещества, легко растворяющийся в кристаллоидных и коллоидных растворах). Экспериментальная доза - 150 ЕД/мл.
Лабораторные кролики являются общепринятой экспериментальной тест-системой по изучению специфической активности офтальмологических препаратов. Исследование выполнено на 28 беспородных кроликах массой 3.5-4 кг. Процедура распределения на экспериментальные группы путем чередования 1/1. Схема исследования представлена на рис. 1. В правый глаз животного вводился ПЭГ-субтилизин или ПЭГ-гиалуронидаза в зависимости от группы распределения, левый глаз животного использовался как контроль - в него вводили 0.9% МаС1.
В экспериментальной офтальмологии для исследования химической травмы роговицы используют щелочной ожог по Обенбергеру. Патологические процессы, развивающиеся у кроликов после щелочной травмы роговицы, соответствуют таковым у человека [22]. Эту модель широко применяют во всем мире для изучения репаративных процессов в глазе и разра-
outbred rabbits weighing 3.5-4 kg. Distribution procedure to experimental groups is 1/1 alternation. The scheme of the study is shown in Fig. 1. PEG-subtilisin or PEG-hyaluronidase were applied to the right eye of the animal; the left eye of the animal was used as a control - it was treated with 0.9% NaCl.
In experimental ophthalmology, the Obenberger alkali burn is used to study the chemical injury of the cornea. Pathological processes in rabbits following an alkali injury to the cornea correspond to those in humans [22]. This model is widely used all over the world to study reparative processes in the eye and develop new methods of treatment. In our study, we reproduced this classic technique using an 8 mm filter paper disk impregnated with 2.5% sodium hydroxide (NaOH) solution. After local anesthesia with 0.4% oxybuprocaine, disk with NaOH is applied to the cornea. The exposure time is 5 s, after which the conjunctiva cavity is washed with normal saline (0.9% NaCl). The study drugs were administered depending on the distribution group and the study design 4 hours after the injury: with topical administration, instillations were performed on the surface of the cornea, 0.1 ml 8 times after 15 min; with subconjunctival administration, the injections of 0.1 ml were performed once. Animals were removed from the experiment after 24 hours in accordance with modern methods of euthanasia of laboratory animals (according to Directive 2010/63/EU on the protection of animals used for scientific purposes, of the European Parliament and the Council of the Euro-peam Union, of September 22, 2010), followed by enucleation of both eye. Lethal cases were recorded during the experiment. Cases of complete damage to the eye and the absence of the possibility of taking a tissue specimen were also recorded.
In this study, we evaluate the cell landscape taking into account the specific biological activity of each subset of cells. Immunocompetent cell subsets make it possible to assess the course of the inflammatory process and predict the effect of the study drugs on the processes of corneal wound repair. The design of the experiment provided for two routes of administration - instillations on the wound surface and subconjunctival injection. The need for two routes of administration is justified by the following circumstances. To achieve pharmacological efficacy with topical administration, the molecules of the study drugs are not required to overcome the blood-ocular barrier, and this, at the first glance, is a positive aspect. However, it should be taken into account that in this experimental chemical injury the colli-quative processes take place in the cornea with a damage to its morphological structure. And this, in
s -
s! sj H
a i
в .2
ä e
Рч
Отобрано 28 животных (n = 28) 28 animals were selected
Местное введение
Topical administration
ПЭГ-субтилизин (n = 7) ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7)
PEG-subtilisin PEG-hyaluronidase
Субконъюнктивальное введение Subconjunctival administration
ПЭГ-субтилизин (n = 7) PEG-subtilisin ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7) PEG-hyaluronidase
Химическая травмы роговицы правого глаза (щелочной ожог по Обенбергеру) и левый глаз в качестве контроля Corneal chemical injury of the right eye (Obenberger alkali burn) and left eye as a control
в
« И £
о £ s
jj Й ¡^ s
h и a.S
3 S « 'S
ES 3« §
S в S .Si
й ai Ö aj
S s S -a
s-M«
и « £ = K8|e
Экспозиция 4ч/ Exposure 4 h
Местное введение Topical administration Правый глаз: ПЭГ-препарат / Right eye: PEG-drug Левый глаз / Left eye: 0.9% NaCl Субконъюнктивальное введение Subconjunctival administration Правый глаз: ПЭГ-препарат / Right eye: PEG-drug Левый глаз / Left eye: 0.9% NaCl
ПЭГ-субтилизин (n = 7) PEG-subtilisin ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7) PEG-hyaluronidase ПЭГ-субтилизин (n = 7) PEG-subtilisin ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7) PEG-hyaluronidase
Наблюдение в течение 1 дня / Observation for a day
в s в
сз sa
о
g
ч
о
0 В
1
Местное введение Topical administration
ПЭГ-субтилизин (n = 7) PEG-subtilisin ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7) PEG-hyaluronidase
Правый глаз: ПЭГ-субтилизин Right eye: PEG-subtilisin - 6 глазных яблок сохранено 6 eyeballs were saved - перфорация глаза (n = 1) perforation of the eye Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl - 7 глазных яблок сохранено 7 eyeballs were saved Правый глаз: ПЭГ-гиалуронидаза Right eye: PEG-hyaluronidase - 7 глазных яблок сохранено 7 eyeballs were saved Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl - 7 глазных яблок сохранено 7 eyeballs were saved
Субконъюнктивальное введение Subconjunctival administration
ПЭГ-субтилизин (n = 7) PEG-subtilisin ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7) PEG-hyaluronidase
Правый глаз: ПЭГ-субтилизин Right eye: PEG-subtilisin - 6 глазных яблок сохранено 6 eyeballs were saved Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl - 7 глазных яблок сохранено 7 eyeballs were saved Правый глаз: ПЭГ-гиалуронидаза Right eye: PEG-hyaluronidase - 7 глазных яблок сохранено 7 eyeballs were saved Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl - 7 глазных яблок сохранено 7 eyeballs were saved
Эвтаназия, энуклеация глаз, подготовка срезов, выполнение гистоморфологического исследования Euthanasia, enucleation, preparation of histologic sections, histomorphological study
«
о
s.
4 i?
5 «
a M
m S в я
в
«с
Местное введение Topical administration
ПЭГ-еубтолизин (n = PEG-subtilisin
7)
Правый глаз: ПЭГ-субтилизин Right eye: PEG-subtilisin
- 30 срезов / 30 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl
- 30 срезов / 30 sections Исключено: 5 срезов животных с перфорированным правым глазом
Excluded: 5 animal sections with the perforated right eye
ПЭГ-гиалуронидаза (n = 7) PEG-hyaluronidase
Правый глаз: ПЭГ-гиалуронидаза Right eye: PEG-hyaluronidase -35 срезов / 35 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl -35 срезов / 35 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
Субконъюнктивальное введение Subconjunctival administration
ПЭГ-субтилизин (n = PEG-subtilisin
Правый глаз: ПЭГ-субтилизин Right eye: PEG-subtilisin
- 35 срезов / 35 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl
- 35 срезов / 35 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
ПЭГ-гиалуронидаза (n : PEG-hyaluronidase
Правый глаз: ПЭГ-гиалуронидаза Right eye: PEG-hyaluronidase
- 35 срезов / 35 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
Левый глаз: 0.9% NaCl Left eye: 0.9% NaCl
- 35 срезов / 35 sections
- исключено: 0 срезов excluded: 0 sections
Рис. 1. Экспериментальные группы и схема исследования Fig. 1. Experimental groups and study design
ботки новых методов лечения. В нашем исследовании мы воспроизвели эту классическую методику, используя диск фильтровальной бумаги диаметром 8 мм, пропитанный 2.5% раствором гидроксид натрия (NaOH). После местной анестезии 0.4% инокаина диск с NaOH посредством аппликации наносится на роговицу. Время экспозиции - 5 с, после чего конъюнктивальная полость промывается физиологическим раствором (0.9% NaCl). Исследуемые препараты вводились в зависимости от группы распределения и дизайна эксперимента через 4 ч после травмы: при местном введении выполнялись инстилля-ции на поверхность роговицы по 0.1 мл 8-кратно через 15 мин, при субконъюнктивальном -выполнены инъекции по 0.1 мл однократно. Выведение животных из эксперимента осуществлялось через 24 ч в соответствии с современными методами эвтаназии лабораторных животных (согласно Директиве 2010/63/EU по охране животных, используемых в научных целях, Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г.) с последующей энуклеацией обоих глаз. Летальные случаи в ходе эксперимента фиксировались. Случаи полного повреждения глаза и отсутствие возможности выделения макропрепарата учитывались.
В данном исследовании мы проводим детализацию клеточного пейзажа с учетом специфической биологической активности каждой группы клеток. Популяции иммунокомпетентных клеток позволяют оценивать течение воспалительного процесса и прогнозировать воздействие изучаемых препаратов на процессы репарации роговицы. Дизайном эксперимента предусматривалось два пути введения - инстилляции на раневую поверхность и субконъюнктивальное введение. Обоснование необходимости двух способов введения обусловлено следующими обстоятельствами. При местном применении для достижения фармакологической эффективности не требуется преодоления молекулами исследуемых препаратов офтальмогематического барьера, и это, на первый взгляд, является положительным качеством. Однако следует принимать во внимание, что в данной экспериментальной химической ране имеют место быть колликвационные процессы в роговице с нарушением ее морфологической структуры. А это, в свою очередь, затрудняет диффузионные процессы лекарственных препаратов в области поврежденной ткани. Также следует учитывать эффект смывания препаратов. Субконъюнктивальное введение с учетом короткого трафика в область лимба и после-
turn, hinders the diffusion processes of drugs in the damaged tissue. The effect of washing off drugs should also be taken into account. Subconjunctival administration, in the context of a short traffic to the limbus region and subsequent diffusion into the wound from the area of intact cornea, can be considered as a tissue depot of drugs.
The biomaterial obtained was fixed in 10% neutral buffered formalin. Sections up to 5 |m thick were made on a rotary microtome, stained with hematoxy-lin and eosin according to the conventional method. For the preparation of histological sections, a TP1020 tissue processor (Leica, Germany), an EG1160 histo-embedder (Leica, Germany), a RM2235 rotary microtome (Leica, Germany), and an Autostainer XL automated slide stainer (Leica, Germany) were used. A morphometric study was performed using a grid of 121 points with a test area of 5.6X105 |m2 at 400 magnification. The numerical density (Nai) of inflammatory cell infiltrate and the number of cell types (neu-trophils, macrophages, plasma cells, eosinophils) were calculated. Histological sections were studied using a Leica DM2500 microscope equipped with a DFC295 digital color camera (Leica, Germany). For statistical processing, a morphological examination of samples was carried out; in each section, 10 fields of view were analyzed at 400 magnification.
Statistical analysis of the data was carried out using MedCalc v. 11.3.3 (MedCalc Software), STA-TISTICA 8 (StatSoft, Inc.) and Microsoft Office Excel 2007. The data on the absolute cell count in sections are presented as median and quartiles. Checking the normality of the distribution of variables (the number of cells) was carried out using the Shapiro-Wilk test (for n < 60). For normally distributed data, the F-test was used to check the assumption of homogeneity of the variances. The Kruskal-Wallis test was performed for intergroup analysis of quantitative indicators in 3 or more groups, followed by post-hoc comparison using the Dunn test, additionally adjusted using the False Discovery Rate (FDR) calculated by the Benjamini-Hochberg method. To compare the quantitative data of two related (correlated) samples, the Wilcoxon test was used to calculate p. Contingency table analysis was used to compare binary outcomes of eye integrity after chemical injury, treatment, and completion of the follow-up period. For unrelated (non-correlated) outcomes, the Fisher's exact test was used, since the number of outcomes (n) in one of the cells of fourfold contingency table was less than 5. For related (correlated) outcomes, fourfold contingency tables were built for paired proportions, and the McNemar's test was applied with the determination of the mean p value.
дующей диффузии в рану из зоны неповрежденной роговицы может рассматриваться как тканевое депо лекарственных препаратов.
Полученный биоматериал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. На ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной до 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином по стандартной методике. В работе для приготовления гистологических препаратов использовали аппарат ТР1020 (Leica, Германия), станцию для заливки EG1160 (Leica, Германия), ротационный микротом RM2235 (Leica, Германия), аппарат для окрашивания микропрепаратов Autostainer XL (Leica, Германия). Морфометри-ческое исследование проводили с помощью сетки из 121 точки тестовой площадью 5.6хю5 мкм2 при увеличении 400. Подсчитывали численную плотность (Nai) клеток воспалительного инфильтрата, количество типов клеток (нейтрофилы, макрофаги, плазмоциты, эозинофилы). Гистологические срезы изучали на световом микроскопе Leica DM2500, оснащенном камерой DFC295 (Leica, Германия). Для статистической обработки проводилось морфологическое изучение препаратов, в каждом срезе было проанализировано по 10 полей зрения при увеличении 400.
Статистический анализ данных проведен с использованием программ MedCalc v. 11.3.3 (MedCalc Software), STATISTICA 8 (StatSoft, Inc.) и Microsoft Office Excel 2007. Данные об абсолютном количестве клеток в срезах представлены как медиана и квартили. Проверка нормальности распределения количественных признаков (количества клеток) проводилась с использованием критерия Шапиро - Уилка (для n < 60). Для данных, имеющих нормальное распределение, использовался F-тест для проверки предположения об однородности дисперсий. Выполнен тест Кра-скела - Уоллиса для межгруппового анализа количественных показателей в 3 и более группах с последующим апостериорным сравнением с помощью теста Данна, дополнительно скорректированного с помощью коэффициента ложных открытий (FDR) Бенджамини - Хохберга. Для сравнения количественных данных двух связанных (коррелирующих) выборок использовали тест Вилкок-сона с нормальной аппроксимацией для расчета p. Для сравнения бинарных исходов целостности глазного яблока после химической травмы, применения терапии и завершения периода наблюдения применялся анализ таблиц сопряженности. Для несвязанных (некоррелирующих) исходов использован точный тест Фишера, так как число исходов (n) в одной из ячеек четырехпольной
Statistical hypotheses were considered confirmed at p < 0.05, for post-hoc comparisons at p < 0.0125.
RESULTS
There were no cases of non-survival to euthanasia. Among the study groups, no effect of the therapy for chemical eye injury on the frequency of corneal perforations was revealed (Fischer's exact test - 1.0). In the topical PEG-subtilisin administration group, the injection of PEG-subtilisin did not increase the incidence of corneal perforations compared with the administration of 0.9% NaCl (McNemar's mean p = 0.5).
The total number of cells (Fig. 2) in the groups of topical and subconjunctival administration of PEG-subtilisin was 43 (40; 52) and 73 (33; 92), respectively, and 46 (37; 61) with subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase which turned out to be higher than cell numbers with 0.9% NaCl treatment in these groups (p < 0.01) and higher (p < 0.0001) cell numbers than in the topical PEG-hyaluronidase administration group. The total number of cells in topical administration of PEG-hyaluronidase was 15 (13; 16) versus topical application of 0.9% NaCl -15 (14; 18) in this group (p = 0.38). The number of neutrophils in case of PEG-subtilisin was 1 (1; 2) with topical and 0 (0; 1) with subconjunctival administration, and in case of PEG-hyaluronidase 0 (0; 0) both with topical and subconjunctival route of administration (Table 1).
On Fig. 2 we see an increase in the total count of immunocompetent cells in eye tissues following the topical and subconjunctival administration of PEG-subtilisin and subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase compared with 0.9% NaCl (p < 0.05) in corneal chemical injury. Topical administration of PEG-hyaluronidase showed no pronounced cellular response to chemical injury to the eye compared with topical and subconjunctival administration of PEG-subtilisin and subconjun-ctival administration of PEG-hyaluronidase (p < 0.0001). With topical administration of PEG-hyaluronidase, the cellular response does not differ in comparison with the control (NaCl 0.9%).
On Fig. 3 we can see the effect of the studied drugs on the lymphocyte count in the eye tissues. PEG-sub-tilisin instillations did not cause an increase in the number of lymphocytes in the eye tissue (no difference compared to the control group - 0.9% NaCl, p = 0.3). Topical administration of PEG-hyaluroni-dase reduces the response of lymphocytes to chemical injury to the eye compared with the control group - 0.9% NaCl (p < 0.0001) and compared with all experimental groups (p < 0.0001). With subcon-junctival administration of PEG-subtilisin and PEG-
таблицы было меньше 5. Для связанных (коррелирующих) исходов построены четырехпольные таблицы для парных пропорций и применен критерий МакНемара с определением среднего значения р. Статистические гипотезы считались подтвержденными при уровне значимости р < 0.05, для апостериорных сравнений при p < 0.0125.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Случаев недожития до эвтаназии не зафиксировано. Среди групп исследования не выявлено влияние проводимой терапии при химической травме глаза на частоту перфораций глаза (точный тест Фишера - 1.0). В группе «Местное введение ПЭГ-субтилизина» введение ПЭГ-субти-лизина не повлияло на увеличение частоты перфораций глаза по сравнению с введением 0.9% №С1 (среднее p по МакНемару - 0.5).
Общее количество клеток (рис. 2) в группах местного и субконъюнктивального применения ПЭГ-субтилизина составило 43 (40; 52) и 73 (33; 92) соответственно, а субконъюнктивального применения ПЭГ-гиалуронидазы - 46 (37; 61), что оказалось выше количества клеток при применении 0.9% №С1 в этих группах < 0.01) и выше ( < 0.0001) количества клеток в группе местного применения ПЭГ-гиалуронидазы. Общее количество клеток при местном введении ПЭГ-гиалуронидазы составило 15 (13; 16) против местного применения 0.9% №С1 - 15 (14; 18) в данной группе ф = 0.38). Количество нейтрофи-лов при применении ПЭГ-субтилизина составило 1 (1; 2) при местном и 0 (0; 1) при субконъ-юнктивальном применении, а при применении ПЭГ-гиалуронидазы 0 (0; 0) как при местном, так и субконъюнктивальном пути введения (табл. 1).
На рис. 2 показано увеличение общего количества иммунокомпетентных клеток в тканях глаза после местного и субконъюнктивального применения ПЭГ-субтилизина и субконъюнкти-вального применения ПЭГ-гиалуронидазы по сравнению с 0.9% №С1 ^ < 0.05) при химической травме роговицы. При местном введении ПЭГ-гиалуронидазы нет выраженной клеточной реакции в ответ на химическую травму глаза по сравнению с местным и субконъюктивальным применением ПЭГ-субтилизина и субконъюн-ктивальным применением ПЭГ-гиалуронидазы ф < 0.0001). При местном введении ПЭГ-гиалуронидазы клеточный ответ по сравнению с контролем (ЫаС1 0.9%) не отличается.
На рис. 3 представлено влияние изучаемых препаратов на содержание лимфоцитов в тканях глаза. Инстилляции ПЭГ-субтилизина не вызы-
hyaluronidase, the response of lymphocytes was more pronounced compared with topical administration (p < 0.0001 and p < 0.0001, respectively) and the control (p < 0.0001 andp < 0.0001, respectively).
As can be seen from Fig. 4, both study drugs increase the plasma cell count (p = 0.01 for the group of topical administration of PEG-subtilisin, and p < 0.0001 for the rest groups compared with the corresponding control group - 0.9% NaCl). With subconjunctival administration of PEG-subtilisin and PEG-hyaluronidase, a larger plasma cell pool is formed compared with topical administration of the drugs (p < 0.0001 and p < 0.0001, respectively).
Topical and subconjunctival administration of PEG-subtilisin, as well as subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase, causes an expressed migration of eosinophils from blood flow (Fig. 5) compared with control groups (p = 0.008 compared with the group of topical administration of PEG-sub-tilisin and p < 0.0001 compared with the corresponding other experimental groups). This effect is most expressed with subconjunctival use of PEG-subtilisin. Topical administration of PEG-hyaluroni-dase not only does not cause such an effect (p < 0.0001 compared with other experimental groups), moreover, the eosinophil count is 2 times less than when using 0.9% NaCl (p < 0.0001).
The use of PEG-hyaluronidase and PEG-subtili-sin topically and subconjunctivally causes an increase in the macrophage count (Fig. 6) compared with the use of 0.9% NaCl (p = 0.004 andp < 0.0001, respectively). The greatest manifestation of this effect is observed with the subconjunctival administration of PEG-subtilisin (p < 0.0001 compared with topical administration of PEG-subtilisin, and p = 0.0001 and p = 0.005 compared with topical and subcon-junctival administration of PEG-hyaluronidase, respectively). Topical administration of PEG-hya-luronidase does not cause this effect (p < 0.0001 compared with other experimental groups and p = 0.0009 compared with 0.9% NaCl).
The neutrophil count in the administration of PEG-subtilisin was 1 (1; 2) with topical and 0 (0; 1) with subconjunctival, and with the use of PEG-hyal-uronidase 0 (0; 0) both with topical and subconjunc-tival route of administration (see Table 1). Analysis of these data revealed that PEG-subtilisin instillations lead to a significant increase in the neutrophil count (Fig. 7) compared with the administration of 0.9% NaCl (p = 0.01) and topical and subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase (p < 0.0001 and p = 0.0007, respectively). With topical administration of PEG-subtilisin, this effect is more pronounced (p < 0.0001 compared with its subconjunc-
140
о tu m S * c 120 о -
5 g 100
80
a) ui 40 ю
Ol^ 20
--
. g #2
© . 7" □ ■
J5 □
1
Ч0Р M LjjLI -1-1-1-1-1-1- * r¥
Мв ПЭГ-с Мв Ф/с Мв ПЭГ-г Мв Ф/г Св ПЭГ-с Св Ф/с Св ПЭГ-г Св Ф/г TaPEGs TaS/s TaPEGh TaS/h SaPEGs SaS/s SaPEGh SaS/h
180
160
60
0
Группа
Сравнение ПЭГ-групп: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 Comparison of PEG-groups: Kruskall-Wallis test, р < 0.0001
# post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate
Сравнение групп контроля 0.9% NaCl: тест Краскела - Уоллиса, р = 0.18 Comparison of control groups 0.9% NaCl: Kruskal-Wallis, р = 0.18
* Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р < 0.0125 (ПЭГ-группы и группы контроля 0.9% NaCl) Wilcoxon's test (for comparing paired samples), р < 0.0125 (PEG-groups and control groups 0.9% NaCl)
□ Median
□ 25%-75%
X Non-Outlier Range « Outliers ж Extremes
Рис. 2. Общее количество иммунокомпетентных клеток в области химической травмы роговицы после введения изучаемых препаратов (1 - группа «Местное введение ПЭГ-субтилизина»; 2 - группа «Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; 3 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина»; 4 - группа «Субконъюнкти-вальное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; Мв ПЭГ-с - местное введение ПЭГ-субтилизина; Мв Ф/с - местное введение 0.9% NaCl в группе 1; Мв ПЭГ-г - местное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Мв Ф/г - местное введение 0.9% NaCl в группе 2; Св ПЭГ-с - субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина; Св Ф/с - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 3; Св ПЭГ-г - субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Св Ф/г - субконъ-
юнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 4) Fig. 2. The total number of immunocompetent cells in the area of the corneal chemical injury after administration of the study drugs (1 - topical PEG-subtilisin administration group; 2 - topical PEG-hyaluronidase administration group; 3 -subconjunctival PEG-subtilisin administration group; 4 - subconjunctival PEG-hyaluronidase administration group; TaPEGs - topical administration of PEG-subtilisin; TaS/s - topical administration of 0.9% NaCl in group 1; TaPEGh -topical administration of PEG-hyaluronidase; TaS/h - topical administration of 0.9% NaCl in group 2; SaPEGs - subconjunctival administration of PEG-subtilisin; SaS/s - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 3; SaPEGh -subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase; SaS/h - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 4)
вают роста количества лимфоцитов в ткани глаза (нет отличий по сравнению с контрольной группой - 0.9% №01, p = 0.3). Местное применение ПЭГ-гиалуронидазы уменьшает лимфоцитарный ответ на химическую травму глаза по сравнению с контрольной группой - 0.9% №С1 ф < 0.0001) и по сравнению со всеми экспериментальными группами ф < 0.0001). При субконъюнктивальном применении ПЭГ-субтилизина и ПЭГ-гиалуронидазы лимфоцитарный ответ выражен сильнее по сравнению с местным применением ф < 0.0001 и p < 0.0001 соответственно) и контролем ^ < 0.0001 и p < 0.0001 соответственно).
Как видно из рис. 4, оба изучаемых препарата увеличивают содержание плазмоцитов ф = 0.01 для группы «Местное введение ПЭГ-субтили-зина» и p < 0.0001 для остальных групп по сравнению с соответствующей контрольной груп-
tival injection). The results of the use of PEG-hyaluronidase and 0.9% NaCl are comparable (no differences: p = 0.22 for local administration and p = 0.36 for subconjunctival one).
DISCUSSION
PEG-subtilisin, regardless of the route of its administration, and PEG-hyaluronidase in subcon-junctival injections leads to an increase in the immu-nocompetent cell count in the area of the corneal chemical injury compared with administration of 0.9% NaCl (see Fig. 2). With PEG-subtilisin instillation and subconjunctival adminisration of PEG-hyaluronidase, the immunocompetent cell count in the area of the corneal chemical injury increases by 3.5 times, and with subconjunctival administration of PEG-subtilisin, by 5 times (see Fig. 2). Characteristically, subconjunctival administration has a great
Таблица 1. Численная плотность (Na.) и клеточный состав химической раны роговицы после введения ПЭГ-субтилизина и ПЭГ-гиалуронидазы, Me (25 %; 75 %) Table 1. Numerical density (Na.] and cellular composition of the chemical injuiy to the cornea following the injection of PEG-subtilisin and PEG-hyaluronidase, Me (25%; 75%]
Группа
(количество животных) Group
(number of animals)
Терапия
(количество срезов) Therapy
(number of sections)
Морфологический вид клеток / Morphological type of cells
лимфоциты плазмоциты макрофаги эозинофилы нейтрофилы lymphocytes plasma cells macrophages eosinophils neutrophils
Общее ■ количество клеток Total number of cells
1. Местное введение ПЭГ-субтилизина (л = 7) Topical administration of PEG-subtilisin Правый глаз (л = 30) ПЭГ-субти-лизин Right eye (л = 30) PEG-subtilisin Левый глаз (л = 30) 0.9% NaCl Left eye (л = 30) 0.9% NaCl 6 (5; 7)#2'3'4 6 (4; 7)t34 12 (11; 15)* 5 (4; 7) 2 (1; 2)#2'3:* 1 (1; 1) 22.5 (21; 27)#24:* 3 (1; 3) 1 (1; 2)#2 34:* 0 (0; 0) 43 (40; 52)#2:* 14(13; 16)
2. Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы (л = 7) Topical administration of PEG-hyaluronidase Правый глаз (л = 35) ПЭГ-гиалуро-нидаза Right eye (л = 35) PEG-hyaluronidase Левый глаз (л = 35) 0.9% NaCl Left eye (л = 35) 0.9% NaCl 3 (2; 4)#13Л" 5 (4; 7)+34 11 (9; 12)#34:* 6 (4; 8) 1 (0; 1)#1'34:* 1 (1; 1) 1 (0; 1)#134:* 3 (2; 4) 0 (0; 0)#13 0 (0; 0) 15 (13; 16)#134 15 (14; 18)
3. Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина (л = 7) Subconjunctival administration of PEG-subtilisin Правый глаз (л = 35) ПЭГ-субти-лизин Right eye (л = 35) PEG-subtilisin Левый глаз (л = 35) 0.9% NaCl Left eye (л = 35) 0.9% NaCl 9 (6; 16)#12:* 4(2;5)+2 17 (8; 29)#2:* 6(5; 7) 4 (2; 9)#1.2.4:< 1 (0; 2) 33 (16; 44)#24:* 3 (2; 4) 0 (0; 1)#124:* 0 (0; 0) 73 (33; 92)#2:* 13.5 (10; 18)
4. Субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалурони-дазы (л = 7) Subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase Правый глаз (л = 35) ПЭГ-гиалу-ронидаза Right eye (л = 35) PEG-hyaluronidase Левый глаз (л = 35) 0.9% NaCl Left eye (л = 35) 0.9% NaCl 9 (5.5; 12)#11[" 3.5 (2; 5)+2 15.5 (12; 22) #2;* 6 (5; 8) 2 (1; 3)#2 3:* 1 (0; 2) 18 (15; 21.5)#1'2,3:* 3 (3; 4) 0 (0; 0)#13: 0 (0; 0) 46 (37; 61)#2:* 14.5 (10; 17)
Сравнение влияния ПЭГ-субтилизина и ПЭГ-гиалуронидазы в группах исследования* Comparison of the impacts of PEG-subtilisin and PEG-hyaluronidase in study groups # р< 0.0001 р< 0.0001 р< 0.0001 р< 0.0001 р< 0.0001 р< 0.0001
Сравнение влияния 0.9% NaCl в группах исследования1 Comparison of the impacts of 0.9% NaCl in study groups + р< 0.0001 р = 0.96 р = 0.92 р = 0.25 р = 0.79 р = 0.18
*f Тест Краснела - Уоллиса; post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга (FDR), р < 0.0125.
Kruskall-Wallis test; post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate, p < 0.0125. * Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р < 0.0125. Wilcoxon's test (to compare paired samples), p < 0.0125.
52
0 =3 -&ô
1 -9 с; <
32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2
SIJ
..........43,4..... ta,4
I
V,2
Мв ПЭГ-с Мв Ф/с Мв ПЭГ-г Мв Ф/г Св ПЭГ-с Св Ф/с Св ПЭГ-г Св Ф/г TaPEGs TaS/s TaPEGh TaS/h SaPEGs SaS/s SaPEGh SaS/h
Группа
Сравнение ПЭГ-групп: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 # post-hoc Comparison of PEG-groups: Kruskall-Wallis test, р < 0.0001 # post-hoc Сравнение групп контроля 0.9% NaCl: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 t post-hoc Comparison of control groups 0.9% NaCl: Kruskal-Wallis, р < 0.0001 t post-hoc post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга (FDR) post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate * Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р < 0.0125 (ПЭГ-группы и группы контроля 0.9% NaCl) Wilcoxon's test (for comparing paired samples), р < 0.0125 (PEG-groups and control groups 0.9% NaCl)
□ Median
□ 25%-75% ~J_ Mon-Qutlier Range
Outliers * Extremes
Рис. 3. Количество лимфоцитов в области химической травмы роговицы после введения изучаемых препаратов (1 - группа «Местное введение ПЭГ-субтилизина»; 2 - группа «Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; 3 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина»; 4 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; Мв ПЭГ-с - местное введение ПЭГ-субтилизина; Мв Ф/с - местное введение 0.9% NaCl в группе 1; Мв ПЭГ-г - местное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Мв Ф/г - местное введение 0.9% NaCl в группе 2; Св ПЭГ-с - субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина; Св Ф/с - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 3; Св ПЭГ-г - субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы;
Св Ф/г - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 4) Fig. 3. The lymphocyte count in the area of the corneal chemical injury after administration of the study drugs (1 - topical PEG-subtilisin administration group; 2 - topical PEG-hyaluronidase administration group; 3 - subconjunctival PEG-subtilisin administration group; 4 - subconjunctival PEG-hyaluronidase administration group; TaPEGs - topical administration of PEG-subtilisin; TaS/s - topical administration of 0.9% NaCl in group 1; TaPEGh - topical administration of PEG-hyaluronidase; TaS/h - topical administration of 0.9% NaCl in group 2; SaPEGs - subconjunctival administration of PEG-subtilisin; SaS/s - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 3; SaPEGh - subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase; SaS/h - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 4)
пой - 0.9% №01). При субконъюнктивальном введении ПЭГ-субтилизина и ПЭГ-гиалурони-дазы формируется больший пул плазмоцитов по сравнению с местным применением препаратов ф < 0.0001 и p < 0.0001 соответственно).
Местное и субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина, а также субконъюнктивальное применение ПЭГ-гиалуронидазы вызывает выраженную миграцию эозинофилов из кровотока (рис. 5) по сравнению с контрольными группами ф = 0.008 по сравнению с группой «Местное применение ПЭГ-субтилизина» и p < 0.0001 по сравнению с соответствующими другими экспериментальными группами). Наиболее выраженное проявление данного эффекта отмечается при субконъюнктивальном применении ПЭГ-субтилизина. Местное применение ПЭГ-гиалу-
stimulating effect on cell migration to the wound. The route of 0.9% NaCl administration has virtually no influence on cell migration. Thus, subconjunctival administration of the study drugs provides a tissue depot with a prolonged pharmacological effect.
When instilled on the wound surface, the study drugs virtually do not increase the lymphocyte count compared to the control, and subconjunctival administration of both enzymes increases their count by more than 2 times (see Fig. 3). At the same time, there is no difference between the drugs in terms of the effect on lymphocyte count. The fact of accumulation of lymphocytes is of positive importance, since these cells of the MALT system are endowed with immune memory without marked effects of alteration on tissues. Their presence in the area of tissue degeneration will provide antimi-
70
60
ов 50
40
& E
^ 1Л
S _çç I- Ci
§<>0
О з ? n
30
20
10
О sx
* __
*
à . %. , r. .................................
ф ..... i L T T
Мв ПЭГ-с Мв Ф/с Мв ПЭГ-г Мв Ф/г Св ПЭГ-с Св Ф/с Св ПЭГ-г Св Ф/г TaPEGs TaS/s TaPEGh TaS/h SaPEGs SaS/s SaPEGh SaS/h
Группа
Сравнение ПЭГ-групп: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 Comparison of PEG-groups: Kruskall-Wallis test, р < 0.0001
# post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга
# post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate Сравнение групп контроля 0.9% NaCl: тест Краскела - Уоллиса, р = 0.96 Comparison of control groups 0.9% NaCl: Kruskal-Wallis, р = 0.96
# Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р < 0.0125 (ПЭГ-группы и группы контроля 0.9% NaCl) Wilcoxon's test (for comparing paired samples), р < 0.0125 (PEG-groups and control groups 0.9% NaCl)
□ Median
□ 25%-75%
X Ыоп-Outlier Range о Outliers - Extremes
0
Рис. 4. Количество плазмоцитов в области химической травмы роговицы после введения изучаемых препаратов (1 - группа «Местное введение ПЭГ-субтилизина»; 2 - группа «Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; 3 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина»; 4 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; Мв ПЭГ-с - местное введение ПЭГ-субтилизина; Мв Ф/с - местное введение 0.9% NaCl в группе 1; Мв ПЭГ-г - местное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Мв Ф/г - местное введение 0.9% NaCl в группе 2; Св ПЭГ-с - субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина; Св Ф/с - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 3; Св ПЭГ-г - субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы;
Св Ф/г - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 4) Fig. 4. The plasma cell count in the area of the corneal chemical injury after administration of the study drugs (1 - topical PEG-subtilisin administration group; 2 - topical PEG-hyaluronidase administration group; 3 - subconjunctival PEG-subtilisin administration group; 4 - subconjunctival PEG-hyaluronidase administration group; TaPEGs - topical administration of PEG-subtilisin; TaS/s - topical administration of 0.9% NaCl in group 1; TaPEGh - topical administration of PEG-hyaluronidase; TaS/h - topical administration of 0.9% NaCl in group 2; SaPEGs - subconjunctival administration of PEG-subtilisin; SaS/s - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 3; SaPEGh - subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase; SaS/h - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 4)
ронидазы не только не вызывает такого эффекта ф < 0.0001 по сравнению с другими экспериментальными группами), более того, количество эозинофилов в 2 раза меньше, чем при применении 0.9% №01 ($ < 0.0001).
Применение ПЭГ-гиалуронидазы субконъюн-ктивально и ПЭГ-субтилизина субконъюнкти-вально вызывает увеличение количества макрофагов (рис. 6) по сравнению с применением 0.9% №С1 ^ = 0.004 и p < 0.0001 соответственно). Наибольшее проявление данного эффекта наблюдается при субконъюнктивальном введении ПЭГ-субтилизина ф < 0.0001 по сравнению с местным применением ПЭГ-субтилизина и p = 0.0001 и p = 0.005 по сравнению с местным и субконъюнктивальным применением ПЭГ-гиа-луронидазы соответственно). Местное примене-
crobial and anti-inflammatory effects which ultimately will not hinder the regeneration of the injured cornea.
Regardless of the administration route of both drugs, they increase the plasma cell count 2-3 times compared to 0.9% NaCl (see Fig. 4). An increase in plasma cell count can provide local implementation of acquired immunity which should also be regarded as a positive effect.
Both routes of administration of PEG-subtilisin lead to marked eosinophilia. PEG-hyaluronidase increases the eosinophil count only when administered subconjunctivally (see Fig. 5). It is likely that the presence of a drug with large molecules leads to a rapid migration of eosinophils from blood vessels. This is quite alarming for subtilisin, since eosinophils are capable of extracellular cytolysis and stimu-
70
60
iü 50
40
20
è 8 30
îl
о <
СО
Мв ПЭГ-с Мв Ф/с Мв ПЭГ-г Мв Ф/г Св ПЭГ-с Св Ф/с Св ПЭГ-г Св Ф/г TaPEGs TaS/s TaPEGh TaS/h SaPEGs SaS/s SaPEGh SaS/h
Группа
Сравнение ПЭГ-групп: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 Comparison of PEG-groups: Kruskall-Wallis test, р < 0.0001
# post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга
# post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate Сравнение групп контроля 0.9% NaCl: тест Краскела - Уоллиса, р = 0.25 Comparison of control groups 0.9% NaCl: Kruskal-Wallis, р = 0.25
# Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р < 0.0125 (ПЭГ-группы и группы контроля 0.9% NaCl) Wilcoxon's test (for comparing paired samples), р < 0.0125 (PEG-groups and control groups 0.9% NaCl)
□ Median
□ 25%-75%
X Non-Outlier Range Outliers Extremes
Рис. 5. Количество эозинофилов в области химической травмы роговицы после введения изучаемых препаратов (i - группа «Местное введение ПЭГ-субтилизина»; 2 - группа «Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; 3 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина»; 4 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; Мв ПЭГ-с - местное введение ПЭГ-субтилизина; Мв Ф/с - местное введение 0.9% NaCl в группе 1; Мв ПЭГ-г - местное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Мв Ф/г - местное введение 0.9% NaCl в группе 2; Св ПЭГ-с - субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина; Св Ф/с - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 3; Св ПЭГ-г - субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы;
Св Ф/г - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 4) Fig. 5. The eosinophil count in the area of the corneal chemical injury after administration of the study drugs (1 - topical PEG-subtilisin administration group; 2 - topical PEG-hyaluronidase administration group; 3 - subconjunctival PEG-subtilisin administration group; 4 - subconjunctival PEG-hyaluronidase administration group; TaPEGs - topical administration of PEG-subtilisin; TaS/s - topical administration of 0.9% NaCl in group 1; TaPEGh - topical administration of PEG-hyaluronidase; TaS/h - topical administration of 0.9% NaCl in group 2; SaPEGs - subconjunctival administration of PEG-subtilisin; SaS/s - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 3; SaPEGh - subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase; SaS/h - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 4)
ние ПЭГ-гиалуронидазы не вызывает данного эффекта (p < 0.0001 по сравнению с другими экспериментальными группами и p = 0.0009 по сравнению с 0.9% NaCl).
Количество нейтрофилов при применении ПЭГ-субтилизина составило 1 (1; 2) при местном и 0 (0; 1) при субконъюнктивальном применении, а при применении ПЭГ-гиалуронидазы 0 (0; 0) как при местном, так и субконъюнктивальном пути введения ( см. табл. 1). Анализ этих данных выявил, что инсталляции ПЭГ-субтилизина приводят к достоверному увеличению числа нейтрофилов (рис. 7) по сравнению с введением 0.9% NaCl (p = 0.01) и местным и субконъюнктивальным введением ПЭГ-гиалуронидазы (p < 0.0001 и p = 0.0007 соответственно). При местном применении ПЭГ-субтилизина данный эффект проявля-
lation of fibroblasts. From this point of view, the administration of PEG-hyaluronidase can be considered safe only in the form of instillations.
A marked effect of macrophage accumulation is observed only with subconjunctival administration of PEG-subtilisin (see Fig. 6). The migration of macrophages to the area of damage is aimed at primary phagocytosis, local production of nitric oxide from arginine, and enhancement of endothelial repair and angiogenesis. From this position, the effect of sub-conjunctival administration of PEG-subtilisin can be considered positive.
The use of PEG-hyaluronidase does not affect the migration of neutrophils when administered topically. PEG-subtilisin slightly increases the migration of neutrophils (see Fig. 7). Neutrophils are able to realize oxidative stress/respiratory burst with the release of a
О. (1) о w m tu
18
16
14
12
10
£ |
и c -&jS
о =з
2 <
-2
-1-r~
0
-ràl.............*.............•*.............*..... ..:...'..........X....................X..... it
1 ............Ы..........^ 0
Мв ПЭГ-с TaPEGs
Мв Ф/с TaS/s
Мв ПЭГ-г TaPEGh
Мв Ф/г TaS/h
Св ПЭГ-с SaPEGs
Св Ф/с SaS/s
Св ПЭГ-г SaPEGh
Св Ф/г SaS/h
Группа
Сравнение ПЭГ-групп: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 Comparison of PEG-groups: Kruskall-Wallis test, р < 0.0001
# post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга
# post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate Сравнение групп контроля 0.9% NaCl: тест Краскела - Уоллиса, р = 0.92 Comparison of control groups 0.9% NaCl: Kruskal-Wallis, р = 0.92
# Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р < 0.0125 (ПЭГ-группы и группы контроля 0.9% NaCl) Wilcoxon's test (for comparing paired samples), р < 0.0125 (PEG-groups and control groups 0.9% NaCl)
о Median □ 25%-75% X Non-Outlier Range о Outliers s Extrem.es
8
6
4
2
0
Рис. 6. Количество макрофагов в области химической травмы роговицы после введения изучаемых препаратов (1 - группа «Местное введение ПЭГ-субтилизина»; 2 - группа «Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; 3 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина»; 4 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; Мв ПЭГ-с - местное введение ПЭГ-субтилизина; Мв Ф/с - местное введение 0.9% NaCl в группе 1; Мв ПЭГ-г - местное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Мв Ф/г - местное введение 0.9% NaCl в группе 2; Св ПЭГ-с - субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина; Св Ф/с - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 3; Св ПЭГ-г - субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы;
Св Ф/г - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 4) Fig. 6. The macrophage count in the area of the corneal chemical injury after administration of the study drugs (1 - topical PEG-subtilisin administration group; 2 - topical PEG-hyaluronidase administration group; 3 - subconjunctival PEG-subtilisin administration group; 4 - subconjunctival PEG-hyaluronidase administration group; TaPEGs - topical administration of PEG-subtilisin; TaS/s - topical administration of 0.9% NaCl in group 1; TaPEGh - topical administration of PEG-hyaluronidase; TaS/h - topical administration of 0.9% NaCl in group 2; SaPEGs - subconjunctival administration of PEG-subtilisin; SaS/s - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 3; SaPEGh - subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase; SaS/h - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 4)
ется сильнее ф < 0.0001 по сравнению с субконъ-юнктивальным его введением). Результаты введения ПЭГ-гиалуронидазы и 0.9% №01 сопоставимы (нет отличий: p = 0.22 для местного применения и p = 0.36 для субконъюнктивального).
ОБСУЖДЕНИЕ
Присутствие ПЭГ-субтилизина независимо от пути его введения и ПЭГ-гиалуронидазы при суб-конъюнктивальном пути введения приводит к увеличению числа иммунокомпетентных клеток в области химической раны роговицы по сравнению с введением 0.9% №С1 (см. рис. 2). При инстилляции ПЭГ-субтилизина и субконъюнкти-вальном применении ПЭГ-гиалуронидазы количество иммунокомпетентных клеток в области химической раны роговицы увеличивается в
large amount of reactive oxygen species, and also have significant phagocytosis potential. Their presence in a corneal wound may have an adverse after-effect due to alteration of intact cells of the wound. Arguing from the standpoint of the effect of cytotoxicity on the cell subpopulation of the wound, the absence of the effect of enhancing neutrophil migration by the studied preparations, should be considered as a positive phenomenon, especially for PEG-hyaluronidase.
CONCLUSION
Administration of PEG-hyaluronidase subcon-junctivally and PEG-subtilisin both topically and subconjunctivally leads to increased migration of immunocompetent cells to the area of the corneal chemical injury, while the neutrophil migration is insignificant. It is completely absent when PEG-hyal-
-&-3 o ñ
'S if
0 <
1
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
.
Я.2.4
*
#1,3 #1,3
Мв ПЭГ-с TaPEGs
Мв Ф/с TaS/s
Мв ПЭГ-г TaPEGh
Мв Ф/г TaS/h
Св ПЭГ-с SaPEGs
Св Ф/с SaS/s
Св ПЭГ-г SaPEGh
Св Ф/г SaS/h
Группа
Сравнение ПЭГ-групп: тест Краскела - Уоллиса, р < 0.0001 Comparison of PEG-groups: Kruskall-Wallis test, р < 0.0001
# post-hoc: тест Данна с коэффициентом Бенджамини - Хохберга
# post-hoc: Dunn test with the Benjamini-Hochberg false discovery rate Сравнение групп контроля 0.9% NaCl: тест Краскела - Уоллиса, р = 0.79 Comparison of control groups 0.9% NaCl: Kruskal-Wallis, р = 0.79
# Тест Вилкоксона (для сравнения парных выборок), р <0.0125 (ПЭГ-группы и группы контроля 0.9% NaCl) Wilcoxon's test (for comparing paired samples), р < 0.0125 (PEG-groups and control groups 0.9% NaCl)
□ Median
□ 25%-75%
X Non-Outlier Range Outliers Extremes
Рис. 7. Количество нейтрофилов в области химической травмы роговицы после введения изучаемых препаратов (1 - группа «Местное введение ПЭГ-субтилизина»; 2 - группа «Местное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; 3 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина»; 4 - группа «Субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы»; Мв ПЭГ-с - местное введение ПЭГ-субтилизина; Мв Ф/с - местное введение 0.9% NaCl в группе 1; Мв ПЭГ-г - местное введение ПЭГ-гиалуронидазы; Мв Ф/г - местное введение 0.9% NaCl в группе 2; Св ПЭГ-с - субконъюнктивальное введение ПЭГ-субтилизина; Св Ф/с - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 3; Св ПЭГ-г - субконъюнктивальное введение ПЭГ-гиалуронидазы;
Св Ф/г - субконъюнктивальное введение 0.9% NaCl в группе 4) Fig. 7. The neutrophil count in the area of the corneal chemical injury after administration of the study drugs (1 - topical PEG-subtilisin administration group; 2 - topical PEG-hyaluronidase administration group; 3 - subconjunctival PEG-subtilisin administration group; 4 - subconjunctival PEG-hyaluronidase administration group; TaPEGs - topical administration of PEG-subtilisin; TaS/s - topical administration of 0.9% NaCl in group 1; TaPEGh - topical administration of PEG-hyaluronidase; TaS/h - topical administration of 0.9% NaCl in group 2; SaPEGs - subconjunctival administration of PEG-subtilisin; SaS/s - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 3; SaPEGh - subconjunctival administration of PEG-hyaluronidase; SaS/h - subconjunctival administration of 0.9% NaCl in group 4)
3.5 раза, а при субконъюнктивальном введении ПЭГ-субтилизина - в 5 раз (см. рис. 2). Характерно, что субконъюнктивальное введение обладает большим стимулирующим влиянием на миграцию клеток в область раны. На эффект миграции клеток путь введения 0.9% №01 практически не оказывает влияния. Таким образом, субконъюнктивальное введение исследуемых препаратов обеспечивает тканевое депо с пролонгированным фармакологическим воздействием.
При инстилляции на поверхность раны исследуемые препараты практически не увеличивают количество лимфоцитов по сравнению с контролем, а субконъюнктивальное введение обоих ферментов увеличивает их количество более чем в 2 раза (см. рис. 3). При этом по влиянию на число лимфоцитов между препаратами разницы нет.
uronidase is used subconjunctivally which characterizes this therapy regimen as safer and more effective in chemical injury of the cornea due to the absence of intact cell alteration.
Topical administration of PEG-hyaluronidase does not cause an expressed cellular response of immunocompetent cells in the area of the chemical injury of the cornea, and the effect is comparable to the use of 0.9% NaCl which differs from the effect of PEG-subtilisin and PEG-hyaluronidase administered subconjunctivally. The absence of its pharmacological effect when applied topically characterizes the safety profile of PEG-hyaluronidase for this route of administration.
The use of PEG-subtilisin subconjunctivally causes a pronounced response of immunocompetent cells which may be unsafe given the proteolytic effect of the drug.
Факт накопления лимфоцитов имеет позитивное значение, поскольку эти клетки МЛЬТ-системы наделены иммунной памятью без выраженных эффектов альтерации на ткани. Их присутствие в зоне тканевой дегенерации будет обеспечивать антимикробное и противовоспалительное действие, что в итоге не будет сдерживать процессы регенерации поврежденной роговицы.
Независимо от пути введения обоих препаратов они в 2-3 раза увеличивают содержание плазмоцитов по сравнению 0.9% №С1 (см. рис. 4). Рост количества плазмоцитов может обеспечивать локальную реализацию приобретенного иммунитета, что также следует расценивать как положительный факт.
Оба пути введения ПЭГ-субтилизина приводят к выраженной эозинофилии. ПЭГ-гиалуро-нидаза увеличивает содержание эозинофилов только при субконъюнктивальном введении (см. рис. 5). Вероятно, факт присутствия крупномолекулярного препарата приводит к быстрой миграции эозинофилов из кровеносных сосудов. Это достаточно тревожно выглядит в отношении суб-тилизина, поскольку эозинофилы способны к внеклеточному цитолизу и стимуляции фибро-бластов. С этой точки зрения и введение ПЭГ-гиалуронидазы можно считать безопасным только в виде инстилляций.
Выраженный эффект накопления макрофагов отмечается только при субконъюнктивальном введения ПЭГ-субтилизина (см. рис. 6). Миграция макрофагов в зону повреждения имеет цель осуществить первичный фагоцитоз, местную продукцию оксида азота из аргинина, усилить репарацию эндотелия и ангиогенез. С этой позиции эффект субконъюнктивального введения ПЭГ-субтилизина можно считать положительным.
Применение ПЭГ-гиалуронидазы не оказывают влияния на миграцию нейтрофилов при местном введении. ПЭГ-субтилизин незначительно увеличивает миграцию нейтрофилов (см. рис. 7). Нейтрофилы способны реализовывать оксидантный стресс/респираторный взрыв с выходом большого количества активных форм кислорода, а также обладают выраженным фагоцитозом. Их присутствие в ране роговицы может иметь неблагоприятное последствие из-за альтерации неповрежденных клеток раны. Рассуждая с позиции влияния цитотоксичности на клеточный массив раны, отсутствие воздействия исследуемых препаратов на усиление миграции ней-трофилов следует считать положительным эффектом, особенно в отношении ПЭГ-гиалуро-нидазы.
Author contribution to the writing of the paper (performing of experimental work -V.E. Zabanova, K.I. Ershov, G.I. Baikalov; writing the paper - P.G. Madonov; editing the paper -A.Zh. Fursova, A.P. Nadeev, P.G. Madonov; development of the study design - P.G. Madonov, N.P. Leonov; statistical data analysis, paper design -V.E. Zabanova, G.I. Baykalov).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Введение ПЭГ-гиалуронидазы субконъюнкти-вально и ПЭГ-субтилизина как местно, так и суб-конъюнктивально приводит к усиленной миграции иммунокомпетентных клеток в зону химического повреждения роговицы, при этом миграция нейтрофилов незначительна. Она полностью отсутствует при применении ПЭГ-гиалуронидазы субконъюнктивально, что характеризует данную схему терапии как более безопасную и эффективную при химической травме роговицы из-за отсутствия альтерации неповрежденных клеток.
Местное применение ПЭГ-гиалуронидазы не вызывает выраженного клеточного ответа имму-нокомпетентных клеток в области химической раны роговицы, а эффект сравним с применением 0.9% ЫаС1, что отличается от эффекта ПЭГ-субтилизина и ПЭГ-гиалуронидазы, введенных субконъюнктивально. Отсутствие ее фармакологического эффекта при местном применении характеризует профиль безопасности ПЭГ-гиа-луронидазы при данном типе введения.
Применение ПЭГ-субтилизина при субконъ-юнктивальном пути введения вызывает выраженный ответ иммунокомпетентных клеток, что может быть небезопасно, учитывая протеолити-ческое действие препарата.
Вклад в написание статьи (проведение экспериментальных работ - В.Е. Забанова, К.И. Ершов, Г.И. Байкалов; написание статьи -П.Г. Мадонов; редактирование статьи - А.Ж. Фурсова, А.П. Надеев, П.Г. Мадонов; разработка дизайна исследования - П.Г. Мадонов, Н.П. Леонов; статистический анализ данных, оформление статьи - В.Е. Забанова, Г.И. Байкалов).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chen C.C., Manning A.M. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells // Cytokine. 1996;8(i):58-65. DOI: io.ioo6/cyto.i995.ooo8.
2. Nakamura M., Nishida T. Differential effects of epidermal growth factor and interleukin 6 on corneal epithelial cells and vascular endothelial cells // Cornea. 1999^8(4^452-458. DOI: 1o.1o97/oooo3226-1999o7ooo-ooo11.
3. Ebihara N., Matsuda A., Nakamura S., Matsuda H., Murakami A. Role of the IL-6 classic- and trans-signaling pathways in corneal sterile inflammation and wound healing // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2o11;52(12):8549-8557. DOI: 1o.1167/iovs.11-7956.
4. Hafezi F., Gatzioufas Z., Angunawela R., Ittner LM. Absence of IL-6 prevents corneal wound healing after deep excimer laser ablation in vivo // Eye (Lond). 2o18;32(1):156-157. DOI: 1o.1o38Zeye.2o17.238.
5. Wilson S.E. Corneal wound healing // Exp. Eye Res. 2o2o;197:1o8o89. DOI: 1o.1o16/j.exer.2o2o.1o8o89.
6. Бубнова Н.А., Стернин Ю.И. Системная энзимоте-рапия в хирургической практике: учеб. пособие для врачей. СПб.: ИнформМед, 2o11. 44 с.
7. Лысикова М., Вальд М., Масиновски З. Механизмы воспалительной реакции и воздействие на них с помощью протеолитических энзимов // Цитокины и воспаление. 2oo4;3(3):48-53.
8. Мадонов П.Г., Мишенина С.В., Киншт Д.Н., Ких-тенко Н.В. Химические и фармакологические свойства субтилизинов // Сиб. науч. мед. журн. 2o16;36(3):13-22.
9. Omura K., Hitosugi M., Zhu X. et al. A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects // J. Pharmacol. Sci. 2oo5;99(3):247-251. DOI: 1o.1254/jphs.fpoo5o4o8.
10. Мадонов П.Г., Мишенина С.В., Киншт Д.Н., Ких-тенко Н.В. Таргетная фармакодинамика субтилизинов // Сиб. науч. мед. журн. 2o16;36(4):15-24.
11. Дыгай А.М., Першина О.В., Крупин В.А. и др. Изучение антифибротической активности модифицированной и нативной гиалуронидазы при пневмофиброзе // Сиб. науч. мед. журн. 2o17;37(4):5-1o.
12. Ермолаева Л.А., Фомина Т.И., Дубская Т.Ю. и др. Исследование безопасности и оценка местнораз-дражающего действия фармакологической субстанции на основе полоксамер-гиалуронат-эндо-В^-ацетилгексозаминидазы при ее многократном эндотрахеальном введении // Современная лекарственная токсикология: фундаментальные и прикладные аспекты: материалы II Всерос. науч. конф (Томск, 13-15 июня 2o17 г.) / под ред. акад. РАН А.М. Дыгая. - Томск: Печатная мануфактура, 2o17. С. 11.
13. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Крупин В.А. и др. Эффекты и механизм действия пегилирован-ной гиалуронидазы у мышей C57BL/6 в условиях блеомицин-индуцированного фиброза легких // Патогенез. 2o15;13(3):56-64.
14. Skurikhin E.G., Pershina O.V., Reztsova A.M. et al. Modulation of bleomycin-induced lung fibrosis by pegylated hyaluronidase and dopamine receptor
REFERENCES
1. Chen C.C., Manning A.M. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells. Cytokine. 1996;8(i):58-65. DOI: io.ioo6/cyto.i995.ooo8.
2. Nakamura M., Nishida T. Differential effects of epidermal growth factor and interleukin 6 on corneal epithelial cells and vascular endothelial cells. Cornea. 1999^8(4^452-458. DOI: 10.1097/00003226-1999o7ooo-ooo11.
3. Ebihara N., Matsuda A., Nakamura S., Matsuda H., Murakami A. Role of the IL-6 classic- and trans-signaling pathways in corneal sterile inflammation and wound healing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2o11;52(12):8549-8557. DOI: 1o.1167/iovs.11-7956.
4. Hafezi F., Gatzioufas Z., Angunawela R., Ittner LM. Absence of IL-6 prevents corneal wound healing after deep excimer laser ablation in vivo. Eye (Lond). 2o18;32(1):156-157. DOI: 1o.1o38Zeye.2o17.238.
5. Wilson S.E. Corneal wound healing. Exp. Eye Res. 2020^97:108089. DOI: 1o.1o16/j.exer.2o2o.1o8o89.
6. Bubnova N.A., Sternin Yu.I. (2o11). Systemic Enzyme Therapy in Surgical Practice: Manual for Doctors. Saint Petersburg. 44 p. (In Russ.)
7. Lysikova M., Wald M., Masinovsky Z. The mechanisms of the inflammatory response and the impact on them using proteolytic enzymes. Cytokines and Inflammation. 2004^(3^48-53. (In Russ.)
8. Madonov P.G., Mishenina S.V., Kinsht D.N., Kikht-enko N.V. Chemical and pharmacological properties of subtilisins. The Siberian Scientific Medical Journal. 2o16;36(3):13-22. (In Russ.)
9. Omura K., Hitosugi M., Zhu X. et al. A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both anti-thrombotic and fibrinolytic effects. J. Pharmacol. Sci. 2oo5;99(3):247-251. DOI: 1o.1254/jphs. fpoo5o4o8.
10. Madonov P.G., Mishenina S.V., Kinsht D.N., Kikhtenko N.V. Targeted pharmacodynamic of subtilisins. The Siberian Scientific Medical Journal. 2016;36(4):15-24. (In Russ.)
11. Dygay А.М., Pershina О.V., Krupin V.A. et al. Study of antyfibrotic activity of modified and native hyaluroni-dase at pulmonary fibrosis. The Siberian Scientific Medical Journal. 2017;37(4):5-10. (In Russ.)
12. Ermolaeva L.A., Fomina T.I., Dubskaya T.Yu. et al. (2o17). Safety study and assessment of the local irritation effect of a pharmacological substance based on poloxamer-hyaluronate-endo-B-N-acetylhexosamin-idase with multiple endotracheal administration. In Current Drug Toxicology: Essential and Practical Aspects. Proceedings of the 2nd All Russian Scientific Conference (Tomsk, 13-15 june 2o17) / ed. А.М. Dygay. Tomsk. P. 11. (In Russ.)
13. Skurihin E.G., Pershina O.V., Krupin V.A. et al. Effects and mechanism of pegylated hyaluronidaze in C57BL/6 mice under bleomycin induced pulmonary fibrosis. Pathogenesis. 2015^3(3^56-64. (In Russ.)
14. Skurikhin E.G., Pershina O.V., Reztsova A.M. et al. Modulation of bleomycin-induced lung fibrosis by pegylated hyaluronidase and dopamine receptor antagonist in mice. PLoS One. 2015^0(4)^0125065. DOI: 10.1371/journal.pone.0125065.
antagonist in mice // PLoS One. 2015;10(4):е01250б5. DOI: I0.i37i/j0urnal.p0ne.0i25065.
15. Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V. et al. Specific activity of electron-beam synthesis immobilized hyaluronidase on G-CSF induced mobilization of bone marrow progenitor cells // Stem Cell Rev. Rep. 2013;9(2):140-147. DOI: 10.1007^12015-012-9423-2.
16. Mccann M. Intravenous hyaluronidase for visual loss secondary to filler injection: a novel therapeutic approach // J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2019;12(12):25-
27.
17. Pereira P.A.T., Bitencourt C.S., Reis M.B. et al. Immu-nomodulatory activity of hyaluronidase is associated with metabolic adaptations during acute inflammation // Inflamm. Res. 2020;69(1):105-113. DOI: 10.1007/s00011-019-01297-x.
18. Kalandar A., Williams J., Lalonde D. Can we restore vision? A cadaveric study using hyaluroni-dase for retinal artery occlusion // Plast. Reconstr. Surg. Glob. Open. 2019;7(9):e2412. DOI: 10.1097/ GOX.0000000000002412.
19. Washington P.M., Lee C., Dwyer M.K.R. et al. Hyaluronidase reduced edema after experimental traumatic brain injury //J. Cereb. Blood Flow Metab. 2019;40(10):271678X19882780. DOI: 10.1177/0271678X19882780.
20. Дыгай А.М., Артамонов А.В., Бекарев А.А. и др. Нанотехнологии в фармакологии. М.: Изд-во РАМН, 2011. 136 с.
21. Мадонов П.Г., Ершов К.И., Дубровин А.В. и др. Электронно-лучевая модификация препаратов белковой природы для улучшения их фармакологических свойств // Медицина и образование в Сибири. 2013^:83.
22. Obenberger J. Paper strips and rings as simple tools for standartization of experimental eye injuries // Ophthalmol. Res. 1975;7:363-366.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Забанова Виктория Евгеньевна - ассистент кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной и клинической фармакологии Института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия. ORCID: 0000-0001-9879-8986.
Ершов Константин Игоревич - канд. биол. наук, доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; научный сотрудник лаборатории фармацевтических технологий Института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия. ORCID: 0000-0003-41399-036x.
Селякова Мария Сергеевна - канд. мед. наук, старший преподаватель кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО «Новосибирский государ-
15. Dygay A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V. et al. Specific activity of electron-beam synthesis immobilized hyaluronidase on G-CSF induced mobilization of bone marrow progenitor cells. Stem Cell Rev. Rep. 2013;9(2):140-147. DOI: 10.1007^12015-012-9423-2.
16. Mccann M. Intravenous hyaluronidase for visual loss secondary to filler injection: a novel therapeutic approach. J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2019;12(12):25-
27.
17. Pereira P.A.T., Bitencourt C.S., Reis M.B. et al. Immu-nomodulatory activity of hyaluronidase is associated with metabolic adaptations during acute inflammation. Inflamm. Res. 2020;69(1):105-113. DOI: 10.1007/ s00011-019-01297-x.
18. Kalandar A., Williams J., Lalonde D. Can we restore vision? A cadaveric study using hyaluroni-dase for retinal artery occlusion. Plast. Reconstr. Surg. Glob. Open. 2019;7(9):e2412. DOI: 10.1097/ GOX.0000000000002412.
19. Washington P.M., Lee C., Dwyer M.K.R. et al. Hyaluronidase reduced edema after experimental traumatic brain injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2019;40(10):271678X19882780. DOI: 10.1177/0271678X19882780.
20. Dygay A.M., Artamonov A.V., Bekarev A.A. et al. (2011). Nanotechnologies in Pharmacology. Moscow. 136 p. (In Russ.)
21. Madonov P.G., Ershov K.I., Dubrovin A.V. et al. Electron-beam modification of preparations of the albuminous nature for improvement of their pharmacological properties. Medicine and Education in Siberia. 2013;4:83. (In Russ.)
22. Obenberger J. Paper strips and rings as simple tools for standartization of experimental eye injuries. Ophthalmol. Res. 1975;7:363-366.
ABOUT THE AUTHORS
Viktoriya E. Zabanova - Assistant, Department of Ophthalmology, Novosibirsk State Medical University; Junior Researcher, Laboratory of Experimental and Clinical Pharmacology, Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0001-9879-8986.
Konstantin I. Ershov - Cand. Sci. (Bio.), Associate Professor, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University; Researcher, Laboratory of Pharmaceutical Technology, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0003-4139-036X.
Maria S. Selyakova - Cand. Sci. (Med.), Senior Lecturer, Department of Pathological Anatomy, Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-9521-2641.
Nikolai P. Leonov - Cand. Sci. (Med.), Researcher, Laboratory of Pharmaceutical Technology, Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-00024364-8937.
ственный медицинский университет» Минздрава России, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-00029521-2641.
Леонов Николай Петрович - канд. мед. наук, научный сотрудник лаборатории фармацевтических технологий Института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-0002-4364-8937.
Байкалов Герман Игоревич - клинический ординатор ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; младший научный сотрудник лаборатории фармакологического моделирования и скрининга биоактивных молекул Института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-0002-5445-9920.
Фурсова Анжелла Жановна - д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой офтальмологии ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; ведущий научный сотрудник ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-00016311-5452.
Надеев Александр Петрович - д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-00030400-1011.
Мадонов Павел Геннадьевич - д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; руководитель отдела экспериментальной фармакологии Института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-0002-1093-8938.
German I. Baykalov - Resident, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University; Junior Researcher, Laboratory of Pharmacological Modeling and Screening of Bioactive Molecules, Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: 00000002-5445-9920.
Anzhella Zh. Fursova - Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Head, Department of Ophthalmology, Novosibirsk State Medical University; Leading Researcher, Institute Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: oooo-ooo1-6311-5452.
Aleksander P. Nadeev - Dr. Sci. (Med.), Professor, Head, Department of Pathological Anatomy, Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia. ОRCID: 0000-0003-0400-1011.
Pavel G. Madonov - Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Head, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University; Head, Department of Experimental Pharmacology, Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-1093-8938.
•-•-•
