CC BY
60
УДК 581:14
ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ВЕРХУШЕЧНОЙ МЕРИСТЕМЫ ПОБЕГА И ОСОБЕННОСТЕЙ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КУЛЬТУРАХ IN VITRO РАСТЕНИЙ РАЗНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП
О.А. Чурикова
(лаборатория биологии развития растений)
Одна из наиболее интересных общебиологических проблем — изучение возникновения и становления новых форм и структур как в онтогенезе, так и в филогенезе организмов. Характерной чертой такого формообразования, или морфогенеза, у растений является наличие постоянно действующих локализованных меристем, в результате чего рост растения может продолжаться в течение всего онтогенеза.
Изучение основных закономерностей морфогенеза — одно из важных современных направлений морфологии растений. Все растение в целом и каждый его орган начинают свое развитие в онтогенезе с меристематического состояния. Любые побеговые системы представляют собой результат деятельности апикальной меристемы. Для каждой жизненной формы характерна, в частности своя продолжительность деятельности верхушечной меристемы в онтогенезе и сроки перехода растения от вегетативного состояния к репродуктивному (Ростовцева, 1969). Все эти вопросы и являются предметом исследований в лаборатории биологии развития растений на основе принципа этапности органообразования у растений с использованием оригинальных разработанных методик, применяемых для изучения ранних периодов развития и при переходе побега в генеративное состояние (Ростовцева, 1982). Среди множества направлений исследований в лаборатории особое место всегда занимало изучение цитогистологических особенностей апикальной меристемы. В онтогенезе растения основную функцию роста и органо-образования выполняют верхушечные меристемы. Основное функциональное различие между стеблевой верхушечной меристемой и меристемой корневых окончаний заключается в большем многообразии органообразовательных возможностей первой.
В связи с вышесказанным, на наш взгляд, следует более подробно остановиться на работах З.П. Ростовцевой (и ее учеников), посвященных таким вопросам, как цитофизиологические и биохимические характеристики функциональности верхушечной меристемы в связи с органогенезом, функционирование верхушечной меристемы на разных его этапах, качественные изменения, проис-
ходящие в меристеме при переходе побега к генеративному состоянию и многим другим.
Цитологические и анатомические особенности меристемы конуса нарастания рассматриваются автором как синтетическое выражение физиолого-биохимических изменений, происходящих в метаболизме. Структура, свойства, физиологический статус и деятельность верхушечной меристемы изменяются соответственно морфофизиологическому состоянию растения и находятся в большой зависимости не только от условий его выращивания, внутренней направленности биосинтетических процессов, качества метаболитов, но и от коррелятивных связей между различными частями растения и под их влиянием (Ростовцева, 1961, 1969, 1976). Так, в работе "Некоторые признаки дифференциации клеток верхушечной меристемы" автор отмечает, что "...свойства верхушечной меристемы зависят от морфогенетического процесса в целом, где развитие на основе определенных природных качеств протоплазмы переплетается со своеобразием прохождения стадийных и возрастных этапов в различных условиях среды при наличии взаимодействия тканей и органов организма, развивающегося как целостная система" (Ростовцева, 1961).
Первичные процессы органогенеза влияют на становление и последующее формирование морфо-генетических признаков. Таким образом, особенности цитогистологической структуры конуса нарастания и первичных процессов органогенеза являются отражением, и, в конечном счете, предпосылкой морфогенетического типа побега (Ростовцева, 1961, 1975а, 1976).
В онтогенезе растения образование каждого органа происходит из меристематической ткани. При нормальном прохождении органогенеза, в зависимости от периодов роста и развития, в верхушечной меристеме происходит то усиление, то ослабление митотической активности и прироста меристематических слоев, в конусе нарастания при этом клетки изменяются либо в сторону большей "меристематизации", либо в нем усиливается процесс "паренхиматизации". Направленность обмена, сопровождающаяся повышением синтеза нуклеиновых кислот и белков при определенном качест-
ве их реализации в клетке, приводит к "меристе-матизации", омоложению тканей верхушки побега. Накапливающиеся в клетках нуклеиновые кислоты являются исходным материалом для струк-турообразования (Сабинин, 1963). Подавление же такого типа синтеза приводит к "паренхиматиза-ции", к разной степени старения клеток, уменьшению объема меристемы в конусе нарастания (Ростовцева, 1969).
Клетки меристемы характеризуются определенным диапазоном обратимого изменения биосинтеза как в сторону "меристематизации", так и возврата к "паренхиматизации". Верхушечная меристема может длительное время сохранять орга-нообразовательную способность при крайне замедленном развитии.
В период активного роста конус нарастания значительно увеличивается по сравнению с периодом первоначальной фазы роста, форма и размеры его могут служить показателями способности верхушечной меристемы к выполнению ор-ганообразовательной функции и критериями для оценки роста и развития растений еще на самых ранних этапах, а также для характеристики роста данной жизненной формы, что, несомненно, имеет большое практическое значение при выращивании растений, особенно культурных (Ростовцева, 1969).
В своих работах автор подробно освещает вопросы цитофизиологической и биохимической характеристики состояния клеток меристемы, первичной клеточной дифференциации в связи со строением верхушки побега и цитофизиологиче-скими особенностями различных ее меристемати-ческих зон. Так, автор отмечает, что существенное значение для возникновения первоначальных различий между клетками имеет их местоположение в ткани. В процессе дифференциации меристе-матической клетки в ней происходят значительные изменения в обмене: изменяется соотношение определенных классов веществ, усиливается обводнение цитоплазмы, повышается ферментативная активность различных систем и интенсивность физиологических функций. При этом уменьшается соотношение объема ядра к общим размерам клетки, изменяется его структура, объем ядрышково-го аппарата и т.д. (Ростовцева, 1969).
В лаборатории биологии развития растений разрабатывались и вопросы эволюции апикального нарастания, классификации типов гистогенеза меристем вегетативного ветвления, образования почковых комплексов, роста и дифференциации органов растения, связи верхушечного роста с прикрепленным образом жизни, анализ особенностей роста и размножения растения в связи с его утратой (Ростовцева, 1967б, 1981б, 1982) и многие другие.
Отдельно следует остановиться на проблеме влияния различных факторов на реализацию ор-ганообразовательной функции верхушечной меристемы побега, а также изменения первичных процессов органогенеза под влиянием регуляторов роста и оценки регенерационных особенностей верхушечной меристемы в культурах in vitro (Ростовцева, 1954, 19756, 1981а; Ростовцева и др., 1981, 1983). Верхушечная меристема может в течение продолжительного времени оставаться в вегетативном или префлоральном состоянии, что является обычным при осенне-зимнем вегетировании. Длительное время верхушечная меристема остается также жизнеспособной при выращивании растений в несоответствующих климатических условиях и в искусственных условиях с недостатком света и необходимых для полного развития температур. В таких случаях конус нарастания сохраняет качества и функциональные свойства, характерные для того этапа органогенеза, на котором произошла задержка развития. Задержка в развитии всегда вызывает проявление разнокачественно-сти не только в морфологических признаках, но и в ритме развития (Ростовцева, 1959, 1963).
На всех этапах органогенеза растения способны к образованию дополнительных метамеров. Примером этого явления может служить развитие растений яровой пшеницы и ярового ячменя при коротком дне (Куперман, Ростовцева, 1951; Ростовцева, 1954, 1967а). Эти скрытые при нормальном ритме развития максимальные количественные возможности органогенеза являются следствием приспособления к изменяющимся условиям естественной среды. Такое свойство растений позволяет путем искусственных воздействий выявить максимальные количественные возможности при органогенезе тех органов, ради которых они воз-делываются (Ростовцева, 1972).
В развивающемся растении объем органогенной деятельности верхушечной меристемы, ее органогенные потенции значительно выше, чем конечный результат продуктивности, который мы получаем у культурных растений. Это придает определенную значимость решению вопросов о возможностях более полной реализации указанных потенций. Поэтому изучение закономерностей апикального нарастания и образования меристема-тических зачатков органов — одна из важнейших задач морфогенеза растений.
Всякому процессу гистогенной дифференциации и органогенеза, происходящему в верхушечной меристеме, предшествует накопление вторичных метаболитов (чаще всего в виде отложения вторичного крахмала), которые реализуются в ходе различных процессов структурообразования. Способность клеток верхушечной меристемы к накоплению вторичных запасов метаболитов обеспечивает в определенных пределах продвижение в раз-
витии и в неблагоприятных условиях. Однако следует отметить, что глубокое несоответствие условий полностью приостанавливает развитие. Ми-тотическая деятельность верхушечной меристемы прекращается, происходит паренхиматизация клеток конуса нарастания и последних зачатков органов либо они полностью разрушаются (Ростовцева, 1972).
Под влиянием физиологических процессов, происходящих в растении, первичные верхушечные меристемы проходят в онтогенезе цикл качественных изменений, среди которых различают три основных состояния: вегетативное, префлоральное и флоральное. В условиях дефицита таких важнейших экологических факторов, как свет и температура, отклонения наблюдаются на каждом из указанных органогенных уровней, при этом существенно либо полностью задерживается переход верхушечной меристемы к органогенезу следующего уровня. Вегетативная меристема при этом получает возможность перейти к дополнительному вегетативному органогенезу. Дополнительные вегетативные метамеры могут в большей своей части получать полное развитие. Но количественные показатели ряда морфогенетических признаков указывают на то, что дополнительный органогенез не является простым продолжением основного органогенного цикла. Органогенез дополнительных ме-тамеров осуществляется как самостоятельный органогенный цикл. Таким образом, по внешнему проявлению дополнительная метамерия в вегетативном органогенезе обнаруживает как бы реверсию (Ростовцева, 1975б).
В 1950—1960-х гг. в ряде работ на разных объектах было показано, что индивидуальное развитие растения определяется взаимодействием внутренних факторов, контролируемых геномом, и факторами внешней среды (интенсивность и спектральный состав света, фотопериод, температура и др.), оказывающими многостороннее влияние на характер энергетического и пластического обмена в растении, а также на направленность развития растения в целом в зависимости от этапов органогенеза. Поиск эффективных способов воздействия на растения не ограничивается изучением влияния на реализацию генетической программы факторов внешней среды. Значительный теоретический и практический интерес представляет возможность регулирования роста и развития растений с помощью физиологически активных веществ различной природы. В 1970—1980-х гг. в лаборатории были опубликованы работы, посвященные влиянию регуляторов роста на ритм и особенности органогенеза некоторых растений. Так, изучение состава низкомолекулярных соединений в один из критических периодов онтогенеза пшеницы — начале дифференциации генеративных органов (Егоров, Куперман, 1982) — позволило впервые
выделить и идентифицировать для этой культуры фталевую кислоту и некоторые ее эфиры. Проверка физиологической активности этих соединений показала, что при определенной технологии применения фталаты оказывают специфическое действие на направленность половой дифференциации у растений. Было показано, что обработка растений дикалиевой солью фталевой кислоты нарушает синхронность развития мужских и женских органов в цветке салата. При этом в нераскрывшемся цветке уже на ранних стадиях его развития происходят процессы дегенерации тычиночной трубки. Распустившиеся химически кастрированные цветки представляют собой однополые женские цветки (Куперман и др., 1982).
Изучение влияния фталевой кислоты и ее эфи-ров на процесс сексуализации, проведенное на раздельнополых однодомных растениях (огурец, кукуруза) и на растениях с обоеполыми цветками (салат, картофель), позволило установить ярко выраженную тенденцию к усилению женской сферы и ослаблению мужской сферы у всех исследованных растений после их обработки фталатами. Такая тенденция после соответствующей разработки применения может быть использована для увеличения валового сбора урожая за счет дополнительной закладки женских цветков и соцветий. У растений с обоеполыми цветками (салат, картофель) и раздельнополого однодомного растения кукурузы фталаты могут быть использованы для стерилизации пыльцы. Эти эффекты могут найти широкое применение в гибридном семеноводстве, а также в селекционно-генетической практике.
Были также предприняты исследования, направленные на изучение влияния регуляторов роста на ритм и особенности органогенеза верхушечной меристемы не только в обычных условиях, но и в культуре in vitro. Так, например, изучалась зависимость образования безвирусных реге-нерантов картофеля от регуляторов роста и ритма органогенеза апексов (Ростовцева, Морозова, Ме-лик-Саркисов, Прозорова, 1981). Однако полученные данные не позволили авторам сделать заключение о наличии зависимости между изменениями в органогенезе апексов, связанных с наличием регуляторов роста в составе питательной среды и инактивацией вирусной инфекции.
В лаборатории проводились работы по оценке регенерационных особенностей верхушечной меристемы in vitro. При этом изучалась зависимость органогенеза изолированных верхушек побегов картофеля от состава среды при культивировании их в течение 26 дней (Ростовцева, Морозова, Ма-рюха, 1983). В первые 3—4 дня культивирования рост происходил за счет увеличения зачатков ме-тамеров субапикальной меристемы, заложивших-ся ранее. В этот период наблюдались изменения в тканях основания экспланта. По всей его ши-
рине был заметен слой клеток, стенки и цито-плазматические структуры которых окрашивались значительно слабее, чем клетки всех остальных тканей экспланта, а клеточные ядра были более структурированными. Появление такого слоя клеток позволило авторам предположить, что он находится в особом цитофизиологическом состоянии в связи с приспособительной реакцией экс-плантов к росту in vitro. Органообразовательная деятельность конуса нарастания в первые дни была замедленной. При этом ритм роста эксплан-тов был разным и зависел от сорта и состава питательной среды. Различия наблюдались в приросте меристематических слоев конуса нарастания и в зачатках метамеров. В период начального роста было характерно преобладание радиального прироста меристематических слоев. В опыте это особенно ярко было выражено у сорта картофеля Истринский по сравнению с гибридом 474. При этом различался и ритм органогенеза у эксплантов. Так, у гибрида 474 первый новый листовой примор-дий на среде с гибберелловой кислотой появлялся в среднем на 5—7 дней раньше, чем в других вариантах.
К сожалению, начатые в лаборатории исследования по изучению функционирования изолированных меристем и органогенезу в условиях in vitro были приостановлены. И только спустя несколько лет к проблемам экспериментального морфогенеза вновь было обращено внимание исследователей.
Известный русский ученый К.А. Тимирязев возлагал большие надежды на развитие этого научного направления. "Пробиваясь одинокими струйками во второй половине XIX века, оно сольется в широкий поток уже за порогом XX века..." — писал он. Предпосылки к созданию такой науки действительно появились во второй половине XX в., когда началось изучение биохимических процессов на молекулярном уровне и были получены данные о роли различных факторов (регуляторов роста, ионизирующей радиации, гербицидов, интенсивности и качества света и др.) в ходе роста и развития растений.
В настоящее время открываются широкие возможности не только для изучения влияния различных факторов внешней среды, но и для плодотворных исследований путем экспериментального изменения самого процесса развития. Активное использование метода культуры растительных клеток, тканей и органов in vitro вновь возбудило интерес к ряду нерешенных проблем морфогенеза и выдвинуло в свою очередь новые вопросы, которые имеют не только теоретическое, но и практическое значение и требуют, как отмечала Т.Б. Ба-тыгина (Батыгина, Васильева, 2002), пристального внимания разных специалистов (морфологов, эмбриологов, генетиков, физиологов и др.).
В начале 1990-х гг. на кафедре высших растений были начаты исследования по изучению морфогенеза в культуре растительных клеток, тканей и органов in vitro (Чурикова и др., 1991; Чурикова, 1993; Чурикова и др., 1994; Чурикова, Барыкина, 1995; и др.). В последнее время метод культуры изолированных апикальных меристем широко используется для решения целого ряда практических вопросов: ускоренного размножения ценных и редких растительных форм, оздоровления и получения безвирусных растений, а также теоретических вопросов: изучения закономерностей роста и морфогенеза растений. В связи с этим определенный интерес представляет анализ морфофи-зиологических изменений в апикальных меристемах побегов in vitro, обусловленных прохождением последовательных этапов органогенеза. Объектами исследований послужили Lilium formosanum Thunb. и Triticum aestivum L. (Седова, Скрипников, Любез-нова, Чурикова, 1997; Любезнова, 2002). В качестве эксплантов у лилий использовали апикальную меристему зародыша (I этап органогенеза) и верхушечной почки удлиненного побега (II этап). Практически все (за исключением небольшого выпада) экспланты успешно культивировались и были доведены в культуре до стадии луковицы. Органогенез при этом проходил по прямому пути без формирования каллуса. В экспериментах были использованы два варианта питательных сред: MS (Murashige, Skoog, 1962) и MS с добавлением 1 мг/л кинетина и 0,02 мг/л нафтилуксусной кислоты. Был проведен морфометрический анализ луковиц, полученных из меристемы I этапа.
При высадке конусов нарастания пшеницы с двумя-тремя заложившимися листовыми примор-диями продолжения нормального органогенеза не наблюдалось. Зачатки листьев росли, образуя, чаще всего, тератные формы. В пазухах разросшихся примордиев формировались почки (обычно од-на-две, реже больше, на эксплант), они трогались в рост, в результате чего развивался побег с чешуевидными листьями. После образования корней их рост усиливался, развертывались нормальные листья.
При высадке префлоральных (IV этап) и фло-ральных (V этап) меристем дальнейшего развития колосков и цветков не наблюдалось, а развивались тератные формы. Из пазушных меристем узлов переходной зоны нормальные побеги образовывались очень редко. При этом наблюдались реверсии ко II этапу органогенеза, а развития элементов соцветия не происходило.
Одним из способов решения задач, связанных с развитием растений, является создание модели, более простой, чем растительный организм. Использование метода культивирования органов, тканей, клеток и протопластов растений позволяет создать требуемую модель для проведения фун-
даментальных исследований в области развития растений и его регуляции. Использование в качестве моделей изолированных меристемных комплексов предоставляет возможность решать вопросы, связанные с детерминацией развития растений, оценивать регенерационные возможности и степень автономности возникающих структур, изучать цитологические, гистологические, физиологические и биохимические изменения, происходящие в конусах нарастания в процессе дифференциров-ки (Бутенко, 1975; Rastogi, Sawhney, 1989). Немаловажной является и возможность выбора условий культивирования и контроля над ними (Бутенко, 1999). Такая модель, в частности, была использована при изучении развития апикальных комплексов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. в зависимости от морфофизиологического состояния первичного экспланта (Криницына, 2003). Достаточно благополучная регенерация меристемных комплексов происходила при условии наличия субапикальной части конуса нарастания с двумя-тремя флоральными или листовыми примордиями. В результате исследований было показано, что путь морфогенеза экспланта in vitro тесно связан с возрастным состоянием.
В лаборатории проводятся исследования по изучению особенностей клонального микроразмножения и морфогенетических процессов in vitro у растений разных таксономических групп. Наряду с травянистыми представителями, объектами наших исследований являются также и древесные. Так, в экспериментальной работе нами были использованы интродуцированные сорта сирени обыкновенной коллекции отдела декоративных растений ГБС им. Н.В. Цицина РАН и Ботанического сада МГУ им. М.В. Ломоносова, занимающей доминирующее положение в декоративном садоводстве среди основных 28 видов сирени. Культурные формы сирени традиционно размножают только вегетативным путем. При семенном размножении сорта сирени расщепляются и не повторяют родительских признаков, давая неоднородное и чаще всего непригодное для использования в декоративных целях потомство. Сортовая сирень (около 1,5 тыс. сортов) в основном сосредоточена в коллекциях ботанических садов и крупных интродукционных пунктах, что связано с отсутствием эффективной, экономически выгодной технологии ее размножения. Решить эту проблему помогает использование биотехнологических приемов, при помощи которых удается в сравнительно короткие сроки создавать большое количество корнесобственного сортового материала. Разработанные способы длительного хранения регенерантов позволяют создать банк стерильных культур сирени и поддерживать генофонд ценных сортов.
Для индукции культуры в качестве эксплан-тов использовали апикальные и латеральные поч-
ки зрелых и молодых побегов с небольшим участком стебля, а также фрагменты стебля с 1—2 пазушными почками в период активного роста. С целью выяснения влияния генотипа исходного растения на коэффициент размножения в культуре in vitro было изучено более 20 сортов сирени.
В результате проведенных нами исследований была разработана и усовершенствована технология клонального микроразмножения более 50 сортов сирени обыкновенной, пополнены коллекции ГБС РАН и БС МГУ редкими и ценными сортами. Было выявлено, что на регенерационную способность в культуре in vitro, а также на коэффициент размножения сирени обыкновенной наиболее существенное влияние оказывают генетические особенности размножаемого сорта. Коэффициент размножения у изученных сортов варьировал от 2 до 13,8. По интенсивности пролиферации испытанные сорта были условно разделены на три группы. Наибольшей способностью к регенерации отличались сорта Экселлент, Ами Шотт, Валентина Гризодубова, Индия. Наименьший коэффициент размножения был отмечен у сортов Сенсация и Огни Донбасса. Основное количество сортов (55%) оказалось в средней группе.
Культивирование эксплантов, изолированных с участком стебля, способствовало лучшему росту и развитию побегов. Органогенез в данном случае наблюдался у 67% эксплантов, в то время как при использовании эксплантов без участка стебля — лишь у 15%. Это, вероятно, связано с наличием определенного запаса энергопластических веществ в клетках его тканей. При помещении эксплантов на среду уже через 7 дней разрасталась их базальная часть, они увеличивались в размерах, приобретали более интенсивную зеленую окраску. Становились заметными и трогались в рост уже имеющиеся на момент начала эксперимента зачатки дочерних почек в пазухах чешуй материнской почки. Морфолого-анатоми-ческий анализ эксплантов показал, что образующиеся in vitro побеги являются по происхождению аксиллярными, т.е. развиваются из уже существующих на момент начала эксперимента пазушных меристем растений. Сходные результаты были получены нами у гладиолусов (Чурикова, 1993).
В нашем эксперименте при культивировании вегетативных почек каллусообразования не наблюдалось. У сирени имеется огромный резерв спящих почек. В культуре in vitro происходит реализация развития зачатков пазушных почек, большая часть которых при обычных условиях остается спящими. Крупные почки, характеризующиеся большей емкостью, отличаются и более высокими регенерационными потенциями. При помещении в условия in vitro наблюдается их интенсивное
Рис. 1. Растения-регенеранты: Gladiolus hybridus сорт Grand Waltz (А); многочисленные адвентивные побеги на луковичных че-
шуях Lilium pardalinum (Б) и Scilla sibirica (В)
развитие, они претерпевают внутрипочечное ветвление, что приводит к образованию множества побегов. Формирования de novo разветвленной гид-роцитной системы здесь не наблюдается, почки соединяются между собой посредством обычных проводящих элементов.
На основании изучения морфогенетических процессов в эксплантах сирени показано, что в культуре in vitro происходит реализация органогенного потенциала зачатков пазушных почек, а также активизация деятельности клеток пазушной меристемы через прямой органогенез, минуя стадию каллусообразования (Чурикова, Молканова, 2001а, б; Молканова и др., 2002). Укорененные и адаптированные в теплице растения после высадки в открытый грунт за весенне-летний период дости-
гали высоты 0,5—0,7 м, успешно перезимовывали и на третий год вступали в цветение.
С 1988 г. нами проводятся исследования морфогенеза в культуре тканей у декоративных луковичных и клубнелуковичных однодольных растений (Чурикова, 1993, 1999; Чурикова и др., 1991, 1994). Особенности жизненного цикла и морфогенеза этих растений прежде всего определяются их принадлежностью к геофитам. Введение этих растений в культуру и продвижение в районы с умеренным климатом резко повысило их способность к вегетативному размножению. Одновременно сложное гибридное происхождение многих сортов тюльпанов, гладиолусов, гиацинтов и представителей ряда других родов стало препятствием к семенному воспроизведению в культуре, при котором, как правило, не сохраняются сортовые осо-
бенности этих растений (Куперман, Ржанова, Му-рашёв и др., 1982). Семенное размножение многих луковичных и клубнелуковичных нецелесообразно (если речь не идет о селекционном получении новых сортов) и потому, что у многих из этих растений ювенильный период весьма длительный. Так, при посеве семян тюльпаны зацветают впервые на 3—4-й год, нарциссы и безвременники — на 5—б-й год, гиацинты — на б-й год. Для ряда видов этих растений необходимым условием дружного прорастания семян является воздействие на них пониженными температурами. Высеянные летом свежесобранные семена мускари дают дружные всходы только на следующую весну. Использование же метода микроклонального размножения несомненно имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения растений: значительно более высокие коэффициенты размножения, возможность проведения работ в течение круглого года, оздоровление растений от различных инфекций, вирусов, грибов и бактерий, размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами. Применение этого метода открывает возможности создания банка культур in vitro c целью сохранения генофонда и, в конечном счете, биоразнообразия растений. Наряду с этим при микроклональном размножении наблюдается значительное ускорение темпов развития. Так, полученные in vitro регене-ранты гладиолусов (рис. 1, À), высаженные в открытый грунт весной, зацветают значительно раньше (через б месяцев), чем растения, выращенные in vivo (Чурикова, 1993).
При изучении морфогенеза in vitro у луковичных и клубнелуковичных однодольных мы анализировали развитие новых структур в эксплантах из вторичных меристем. Последние возникают в результате изменения (дедифференциации) клеток дифференцированных тканей стебля, листа, корня, где появляются группы клеток — "очаги" вторичных меристем. Как отмечал Синнот (19б3), несмотря на изменения, приобретаемые в процессе дифференцировки, все клетки, по-видимому, идентичны генетически. Потенциально меристематиче-ские клетки служат "зародышевой плазмой" или генетическим резервом, который может направлять процессы регенерации и дальнейшего развития. Каждая клетка, по крайней мере теоретически, способна образовать целый организм. Изучение морфогенеза из вторичных меристем in vitro открывает новые возможности и подходы к пониманию формирования и функционирования меристем вообще.
Объектами наших исследований послужили: Lilium regale Wils., L. longiflorum Thunb., L. specio-sum Thunb., сорт Uchida; L. pardalinum Kellogg., L. candidum L., L. martagon L., Hyacinthus orientalis L., сорт Anna Marie (сем. Liliaceae); Gladiolus
hybridus, сорт Dixilend (сем. Iridaceae); Narcissus hybridus hort., сорт Geranium (сем. Amaryllidaceae). Основное внимание было уделено сравнительному анализу последовательного хода морфогенеза от первых делений инициальных клеток до формирования адвентивных почек и корней в эксп-лантах разной морфологической природы (листьев низовой и срединной формаций, стебля, почек) in vitro. Первая ответная реакция на поранение — формирование защитной пленки и раневой пробки, предохраняющих живые ткани эксплантов от внешней инфекции и создающих благоприятную среду для проявления меристематической активности отдельных клеток. Во всех вариантах опыта каллусообразования мы не наблюдали.
Морфогенетические процессы в эксплантах листьев низовой и срединной формации у лилий и гиацинтов протекали, в целом, сходно. Практически все живые ткани эксплантов (мезофилл, запасающая паренхима, клетки обкладки проводящих пучков) проявляли регенерационную активность. Меристематическая активность сначала была ограничена 1—3 наружными слоями клеток мезофилла преимущественно адаксиальной стороны экспланта, наиболее богатых питательными веществами и отличающихся способностью к дедиф-ференциации. Первые клеточные перегородки были ориентированы всегда периклинально. Однако упорядоченность делений вскоре утрачивалась, под общей оболочкой инициальной клетки возникала группа мелких клеток с густым цитоплазматиче-ским содержимым и четко различимыми ядрами — полиада (рис. 2, А). Волна клеточных делений от поверхности постепенно распространялась в глубь экспланта, в результате чего возникали обширные зоны меристемы. В них впоследствии дифференцировались зачатки побегов, а также разветвленная гидроцитная система (гидроцитные узлы и тяжи). Относительно слабо выраженная меристе-матическая активность эпидермы, видимо, обусловлена ее более ранней и глубокой специализацией по сравнению с мезофиллом, быстрой утратой способности клеток к возобновлению ме-ристематической деятельности, а также отсутствием достаточного энергетического источника в виде запасных питательных веществ. Формирующаяся во всех эксплантах и наиболее мощно развитая в луковичных чешуях гидроцитная система обеспечивает перераспределение и мобилизацию энергопластических, а также биологически активных веществ, необходимых для дифференциации и дальнейшего развития зачатков почек. Они имеют исключительно эндогенное происхождение, быстро наращивают число метамеров и относительно рано укореняются. Эндогенность заложения обеспечивает не только защиту, но и лучшие условия питания развивающихся de novo адвентивных структур (рис. 1, Б). Чешуи, служащие
Рис. 2. Первые деления клеток субэпидермальных слоев мезофилла и формирование полиад в луковичной чешуе Lilium regale (А); внешний вид трихом (Б) и деление клеток сердцевины цветоноса (Г) Narcissus hybridus сорта Geranium и клеток обкладок проводящих пучков в цветоносе Hyacinthus orientalis сорта Anna Marie (В)
преимущественно запасающими структурами, отли- Морфогенетические процессы в эксплантах осе-
чаются более высокой способностью к формиро- вой природы (цветоносах) in vitro у гиацинта и
ванию de novo зачатков адвентивных побегов и нарцисса при их большом сходстве относительно
корней. рано обнаруживают и некоторые различия. Так,
если у гиацинта на поврежденной поверхности дисков цветоноса образуется исключительно лишь защитная пленка, то у нарцисса первой реакцией эксплантов на поранение становится формирование наряду с ней многочисленных длинных 2—4 клеточных трихом (рис. 2, Б). Они развиваются в результате гипертрофированного роста и деления живых оставшихся неповрежденными околораневых клеток. Образование таких же трихом и на эксплантах листьев у нарцисса при культивировании in vitro, видимо, можно рассматривать в качестве диагностического признака. Анализируя особенности строения трихом, можно предположить, что они несут определенную функциональную нагрузку. Оболочки могут ослизняться и, набухая, впитывать влагу. Не исключено их гормональное воздействие на клетки первичной коры и сердцевины, стимулирующее деления последних, на что указывал в своих экспериментальных работах Биго (Bigot, 1970).
Способность к дедифференциации и восстановлению меристематической активности в цветоносах гиацинта и нарцисса проявляют прежде всего клетки неповрежденного субэпидермального и нескольких прилегающих к нему наружных слоев первичной коры. Клеточные деления постепенно распространяются в глубь экспланта, вовлекая в этот процесс внутренние слои первичной коры, а также клетки обкладок проводящих пучков (гиацинт) (рис. 2, В) и даже сердцевины (нарцисс) (рис. 2, Г). Однако меристематические потенции клеток от периферии к центру цветоноса заметно уменьшаются.
Использование у гладиолуса в качестве первичного экспланта почки, представляющей собой сложную интегрированную систему, обусловливает его отличную от других объектов морфогенетиче-скую реакцию. В процессе регенерации у гладиолуса наряду с ускоренным ростом и развитием уже имеющихся зачатков пазушных срединных и добавочных почек в результате интенсификации деятельности протяженной зоны вставочной меристемы происходит множественное заложение в пазушном комплексе новых добавочных почек с последующим их внутрипочечным ветвлением. Интенсификация процессов новообразования почек in vitro сопровождается ускорением последующего развития побегов. Как уже отмечалось выше, рас-тения-регенеранты, высаженные в открытый грунт весной, зацветают значительно раньше растений, выращенных in vivo.
Анализ морфогенетических процессов в эксп-лантах отдельных частей побега — луковичных че-шуй, представленных метаморфизированными основаниями листьев низовой и срединной формации, безлистного цветоноса — у исследованных видов лилий, гиацинта и нарцисса, а также в почках гладиолуса выявил наличие некоторых общих
черт. Развитие протекает по типу гемморизогене-за. В образование очагов меристемы в эксплантах как листовой, так и осевой природы могут вовлекаться практически все живые ткани. Незначительные различия в морфогенетической реакции in vitro обусловлены в основном морфологической природой органа — источника эксплантов, его функциональной нагрузкой и в меньшей степени зависят от таксономической принадлежности объекта.
Изучение морфогенеза in vitro у мелколуковичных, в частности пролесок Scilla sibirica Andr., S. italica L. и S. rosenii C. Koch., показало, что в целом у всех трех видов морфогенетические процессы протекают одинаково (Чурикова, 1999; Барыкина, Чурикова, 2001). Клеточные деления, начинаясь в субэпидермальных слоях мезофилла абак-сиальной поверхности эксплантов луковичных че-шуй и листьев срединной формации, охватывают и более глубокие слои, вовлекая в меристемати-ческую активность все новые и новые живые клетки, включая паренхимные обкладки проводящих пучков. В то же время наблюдаются и первые деления в субэпидермальных слоях адаксиальной поверхности, в результате чего возникают две встречные волны клеточных делений, постепенно затухающие в центральной части экспланта. Несмотря на относительно более позднее проявление мери-стематической активности клеток адаксиальной поверхности, именно здесь в дальнейшем наиболее интенсивно происходит репродукция адвентивных структур (рис. 1, В).
Отмеченная высокая регенеративная способность у изученных пролесок in vitro, по-видимому, свойственна и другим видам этого рода, среди которых есть редкие и исчезающие. В связи с этим полученные результаты могут быть использованы при разработке технологии микрокло-нального размножения как пролесок, так и других мелколуковичных растений.
В настоящее время нами проводятся исследования особенностей морфогенеза при микрокло-нальном размножении in vitro хост и лилейников. Они являются одними из самых перспективных многолетних растений с высокими декоративными качествами и большим разнообразием форм и окраски цветков, а также листьев. Изученные нами виды лилейника и хосты успешно ввелись в культуру in vitro, при этом на эксплантах — бутонах размером 0,3—0,7 см с небольшим участком цветоножки — формировались многочисленные зачатки побегов. При помещении их на среду для размножения за счет продолжающейся деятельности апикальной меристемы наблюдался их верхушечный рост, который проявлялся в акро-петальном заложении новых метамеров побегов с последующим их растяжением. Наряду с этим происходило формирование почек второго порядка
сначала в пазухах нижних, а впоследствии и более молодых листовых зачатков, т.е. ветвление почек.
В большинстве случаев параллельно с этими процессами наблюдалось разрастание базальной части зачатков побегов и образование выростов неправильной формы. Впоследствии они в свою очередь давали начало одному или нескольким зачаткам адвентивных побегов. При анатомическом анализе срезов именно в этой области были отмечены очаги меристематических клеток и поли-ады (рис. 3, А). Таким образом, проведенный мор-фолого-анатомический анализ морфогенетических процессов у лилейников и хосты in vitro показал, что они проходят по типу гемморизогенеза, минуя стадию каллусообразования. Нами была выявлена более высокая регенерационная активность хосты по сравнению с лилейником, что обусловлено множественным заложением коллатерально расположенных почек (до трех-четырех) в пазухе одного листа экспланта хосты (рис. 3, Б), образующих аксиллярный комплекс.
Одной из характерных особенностей гистологической дифференциации при регенерации у растений является, в частности, развитие гидро-цитной системы. Она часто наблюдается в ходе вегетативного размножения, например, у корнеот-прысковых растений при экзо- и эндогенном заложении придаточных почек. Ее образование весьма обычно в местах соприкосновения поверхностей срезов подвоя и привоя, в зоне естественного
Рис. 3. Формирование полиады в первичном экспланте Heme-rocallis fulva L. (А) и множественные коллатеральные почки в экспланте Hosta sieboldiana (Hook) Engl. (Б)
срастания корней и др. Формирование такой вас-кулярной системы наблюдается и в культивируемых in vitro эксплантах вегетативных органов разной морфологической природы. Посредством ее происходит перемещение энергопластических веществ и гормональных регуляторов роста, проведение их в очаги меристематической активности клеток. Гидроцитные узлы появляются или вслед за образованием очагов меристемы, часто выступая в качестве центров дальнейшей морфогене-тической дифференциации, или васкулярные элементы формируются уже при первых делениях инициальных клеток, на стадии полиад, стимулируя деление прилегающих к ним клеток с последующим образованием побеговых конусов. Вышеуказанные процессы могут идти и параллельно. Наконец, васкулярные элементы возникают также в основании адвентивных почек (Барыкина, Чурикова, 2002, 2004; Чурикова, Барыкина, 1995).
Не ставя перед собой специальной задачи детального изучения столь интересной проблемы, как развитие апопластной и симпластной систем транспорта in vitro, мы сочли целесообразным остановиться лишь на некоторых аспектах их дифференциации с применением светового и трансмиссионного электронных микроскопов. Объектом более тщательного анализа элементов васкулярной системы послужили экспланты цветоносов нарцисса сорта Geranium. Установлено, что водопро-водящие элементы представлены в основном гид-роцитами-трахеидами с лестничными и спиральными утолщениями боковых стенок (отсюда и название "гидроцитная система"). На электронных микрографиях видна их первичная оболочка в виде тонкой сети целлюлозных микрофибрилл, оставшейся после воздействия гидролаз в процессе дифференциации клетки, и неравномерно утолщенная вторичная оболочка. Проведение пластических веществ обеспечивается члениками ситовидных трубок с простыми ситовидными пластинками на горизонтальных (рис. 4, А), а в единичных случаях и боковых стенках с клетками-спутницами (рис. 4, Б).
В культуре in vitro функциональная нагрузка проводящих элементов относительно невелика, а поэтому здесь, как у водных растений, паразитов и суккулентов, нет необходимости в формировании высокоспециализированных водопроводящих структур. Дифференциация же более подвинутых в эволюционном отношении флоэмных элементов, видимо, обусловлена важной ролью энергопластических и гормональных веществ в обеспечении успешного хода процесса регенерации.
Таким образом, результаты проведенных оригинальных исследований и анализ данных литературы позволяют заключить, что развитие так называемой "гидроцитной системы", довольно часто
Рис. 4. Электронные микрографии срезов цветоноса Narcissus hybridus сорта Geranium (А, Б)
встречающейся у семенных растений, особенно цветковых, и наиболее ярко проявляющееся при регенерации как in vivo, так и in vitro, запрограммировано генетически. Она представляет собой сложную в структурно-функциональном отношении васкулярную систему, обеспечивающую в первую очередь апопластный и симпластный транспорт веществ. В ее состав могут входить также
живые трахеидальные па-ренхимные элементы, выполняющие разнообразные функции, в том числе опорную, проводящую, накопления и хранения запасных и бросовых веществ. Следовательно, так называемую "гидроцитную систему" можно рассматривать как своеобразную разновидность проводящей системы семенного растения.
Итак, использование культивирования растительных клеток, органов и тканей in vitro открывает огромные возможности более глубокого и всестороннего изучения и понимания многих общебиологических проблем. Значительные результаты, достигнутые ранее экспериментальной ботаникой, с успехом могут и должны быть расширены путем дополнения старых методов исследования новыми современными научными технологиями.
На наш взгляд, именно сочетание огромной теоретической базы знаний по классической морфологии и новых возможностей, предоставляемых методом культуры клеток, тканей и органов растений in vitro, и послужит решению многих спорных и наиболее интересных вопросов в разных областях ботаники, а также развитию "междисциплинарных дисциплин", перебрасывающих, как отмечал А.Л. Тахтаджан (1998), мосты между традиционными специальностями и, в конечном счете, созданию универсальной науки, призванной служить своего рода каркасом, объединяющим раздробленные науки в единое целое.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Барыкина Р.П., Чурикова О.А. 2001. Барыкина Р.П., Чурикова О.А. 2002.
Особенности морфогенеза некоторых видов Scilla L. // Гидроцитная система: структура и функции//Тр. II Меж-Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 20—23.
дунар. конф. по анат. и морфологии растений, Санкт-Петербург, 14—18 октября 2002 г. СПб. C. 21.
Барыкина Р.П., Чурикова О.А. 2004. Развитие, структура и функции гидроцитной системы у растений // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 23—31.
Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. 2002. Размножение растений. СПб.
Бутенко Р.Г. 1975. Дифференцировка и морфогенез в культуре тканей, клеток и протопластов // Биология развития растений. М. С. 48—65.
Бутенко Р.Г. 1999. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.
Егоров И.В., Куперман Ф.М. 1982. Регуляторы роста, выделенные из пшеницы и их действие на генеративное развитие растений: Проспект ВДНХ.
Криницина А.А. 2003. Развитие апикальных комплексов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. в зависимости от морфофизиологического состояния экспланта: Ав-тореф. дис. ... канд. биол. наук. М.
Куперман Ф.М., Ржанова Е.И., Мурашов В.В. и др. 1982. Биология развития культурных растений. М.
Куперман Ф.М., Ростовцева З.П. 1951. О формировании метелки у проса // Докл. ВАСХНИЛ. № 3. 16—18.
Любезнова Н.В. 2002. Особенности роста и морфогенеза изолированных апикальных меристем Triti-cum aestivum L. на искусственной питательной среде // Тр. II Междунар. конф. по анат. и морфологии растений. Санкт-Петербург, 14—18 октября. СПб. C. 369.
Молканова О.И., Чурикова О.А., Коновалова Л.Н., Окунева И.Б. 2002. Клональ-ное микроразмножение интродуцированных сортов Syrin-ga vulgaris L. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 8—14.
Ростовцева З.П. 1954. Об изменениях в конусе нарастания пшеницы в связи с прохождением световой стадии: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.
Ростовцева З.П. 1959. Реакция сортов проса на изменения температурного режима // Агробиология. № 6. 883—887.
Ростовцева З.П. 1961. Некоторые признаки дифференциации клеток верхушечной меристемы // Морфогенез растений. 11. М. С. 126—131.
Ростовцева З.П. 1963. О морфофизиологи-ческой изменчивости биологических форм в пределах вида // Экспериментальный морфогенез. 1. М. С. 343—350.
Ростовцева З.П. 1967а. Изменение цитофи-зиологического состояния верхушечной меристемы побега в связи с фотопериодической реакцией растения // Физиол. раст. 14. Вып. 3. 486—493.
Ростовцева З.П. 1967б. Органогенез и особенности анатомического строения вольфии (Wolffia arriza (L) Wimm.) в вегетативном периоде ее жизни // Бот. журн. 52. № 8. 1177—1184.
Ростовцева З.П. 1969. Верхушечная меристема. М.
Ростовцева З.П. 1972. Функциональность верхушечной меристемы в процессе органогенеза // Экспериментальный морфогенез цветковых растений. М.
Ростовцева З.П. 1974. Методические указания по изучению верхушечной меристемы в связи с органогенезом. М.
Ростовцева З.П. 1975а. Первичные процессы органогенеза однолетних крестоцветных в связи с формированием морфогенетического типа метамера // Биол. науки. № 8. 60—65.
Ростовцева З.П. 19756. Анатомическая структура конуса нарастания побега при нарушениях орга-нообразовательных процессов // Проблемы онкологии и тератологии растений. Л.
Ростовцева З.П. 1976. Цитогистологическая характеристика функциональности верхушечной меристемы в связи с органогенезом. М.
Ростовцева З.П. 1981а. Ускорение развития и активация ветвления под действием ГК в фотонеиндуктивных условиях // Регуляторы роста и развития растений: I Всесоюз. конф. Тез. докл. М. С. 132.
Ростовцева З.П. 19816. К эволюции апикального нарастания // Морфологическая эволюция высших растений. М. С. 106—108.
Ростовцева З.П. 1982. Типы гистогенеза меристем вегетативного ветвления в однолетнем побеге двудольных // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 16—26.
Ростовцева З.П., Морозова С.Е., Марюха Е.Е. 1983. Оценка регенерационных особенностей верхушечной меристемы картофеля при культивировании in vitro // Биол. науки. № 6. 67—72.
Ростовцева З.П., Морозова С.Е., М е -лик-Саркисов О.С., Прозорова Т.В. 1981. Влияние регуляторов роста в составе среды на ритм органогенеза апексов картофеля in vitro и инактивацию вирусной инфекции // Регуляторы роста и развития растений. М. С. 169.
Сабинин Д.А. 1963. Физиология развития растений. М.
Седова Е.А., Скрипников А.Ю., Любезнова Н.В., Чурикова О.А. Изучение мор-фофизиологических изменений в апикальных меристемах побегов, обусловленных прохождением этапов органогенеза с помощью культуры изолированных меристем in vitro // Тр. Междунар. конф. по анатомии и морфологии растений, посвящ. 150-летию со дня рождения И.П. Бородина, 2—6 июня 1997 г. СПб. С. 2.
С и н н о т Э . 1963. Морфогенез растений. М.
Тахтаджан А.Л. 1998. Принципы организации и трансформации сложных систем: эволюционный подход. СПб.
Чурикова О. А. 1993. Морфогенетические процессы при массклональном размножении некоторых декоративных луковичных и клубнелуковичных растений: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.
Чурикова О.А. 1999. Морфогенез в культуре тканей некоторых видов рода Scilla L. (сем. Lilia-ceae) in vitro // Тез. докл. Междунар. конф. "Физиология растений — наука третьего тысячелетия". ИФР РАН. 4—9 января 1999 г. Т. 2. М. С. 737.
Чурикова О.А., Молканова О.И. 2001а. Некоторые аспекты клонального микроразмножения сирени in vitro // Ботанические проблемы регионального природопользования. Рязань. C. 88—89.
Чурикова О.А., Барыкина Р.П. 1995. Ре-генерационная способность некоторых луковичных и клубнелуковичных однодольных in vitro. Морфогенетиче-ский аспект//Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 58-66.
Чурикова О.А., Молканова О.И. 2001б. Использование метода культуры изолированных тканей и органов для ускоренного размножения сирени обыкновенной // Регуляция роста, развития и продуктивности растений. Минск. С. 215-216.
Чурикова О.А., Румынин В.А., Барыкина Р.П., Слюсаренко А.Г. 1991. Некоторые особенности морфогенеза при массклональном размножении лилий // Бюл. ГБС АН СССР. Вып. 159. 43-49.
Чурикова О.А., Румынин В.А., Барыкина Р.П., Слюсаренко А.Г. 1994. Морфоге-
нетические процессы в луковичных чешуях некоторых видов лилий при массклональном размножении // Бюл. ГБС АН СССР. Вып. 169. 7.
Bigot C. 1970. Position privilegiee des noyaux des cellules epidermiques donnant naissance aux bourgeons epi-phylles d'un clone de Begonia rex Putz. Observations sur les proteues basiques au niveau de l'epiderme // C.R. Acad. Sci. D. 271. N 17. 1526-1529.
Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 15. 473-497.
Rastogi R., Sawhney V.K. 1989. In vitro development of angiosperm floral buds and organs // Plant cell, tissue and organ culture. 16. P. 145—174.
THE STUDY OF APICAL MERISTEM FUNCTIONING PECULIARITIES AND MORPHOGENETICAL PROCESSES IN VITRO OF PLANTS BELONGING TO DIFFERENT TAXONOMICAL GROUPS
O.A. Churikova
The review of investigations have been carried out in Laboratory of plant developmental biology since the midst of XX century with application of original elaborated methods based on the principle of stage organ formation in plants is adduced. The influence of different factors to realization of organogenic function of shoot apical meristem is discussed. The results of morphogenesis study in tissue cultures of plants from different taxonomical groups are adduced.
УДК 581.143.21
КЛЕТОЧНЫЕ МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ В ФИЗИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
А.Ю. Скрипников
(лаборатория биологии развития растений)
Изучение прохождения жизненного цикла семенным растением обычно начинают с анализа процесса прорастания семян. Жизненный цикл растения можно рассматривать и в другом аспекте, допуская, что "исходный пункт онтогенеза семенного растения — это не семя, являющееся уже довольно сложным организмом, а яйцеклетка зародышевого мешка. Но, к сожалению, физиологическое изучение еще почти не затронуло этого важнейшего отрезка жизненного цикла — от зародышевого мешка до семени" (Сабинин, 1963). Возможно, повышенное внимание исследователей к генеративному развитию обусловлено практическими интересами, связанными с семенной продуктивностью и со способностью растений к пло-дообразованию. Из двенадцати этапов органоге-
неза покрытосеменных растений выделяют только два вегетативных этапа — I и II, а остальные десять этапов с III по XII связаны формированием генеративной сферы (Куперман, 1977). К настоящему времени формирование цветков Arabidopsis и Antirinum наиболее глубоко охарактеризовано на молекулярном уровне (Liljegren, Yanofsky, 1996). Даже после того, как установлены MADS-домены высококонсервативных транскрипционных факторов (Williams, 1998; Jack, 2001), сохраняет актуальность замечание Д.А. Сабинина о том, что "при большом значении всего, что связано с приобретением растительным организмом способности к половому размножению, не меньшее значение имеют и различные этапы вегетативного развития" (Сабинин, 1963). Развитие генеративной сфе-
ры является процессом, завершающим формообразование побега взрослого растения. Даже детальное молекулярно-генетическое исследование механизмов развития цветка может не дать ключей к пониманию механизмов, определяющих ранние процессы морфогенеза, такие существенные, как ориентировка оси полярности и регенерации тела растения в целом (Jurgens, 1997). В настоящее время экспериментальное исследование развития растений начиная с одноклеточного состояния организма под действием внешних векторных факторов остается актуальной и сложнейшей задачей биологии развития, для решения которой необходима разработка новых подходов. Основой для развития этого направления является обширный и тщательно систематизированный материал, накопленный методом наблюдения за развитием зигот растений как классическими методами световой микроскопии (Soueges, 1937; Магешвари, 1954; Поддубная-Арнольди, 1976), так и с помощью современных иммунофлуоресцентных методов (Webb, Gunning, 1991).
Развитие инициальных клеток как полового, так и соматического зародышей в большой степени детерминирует последующий ход эмбриогенеза и эмбриоидогенеза (Jurgens et al., 1997; Ба-тыгина, Захарова, 1997; Батыгина, 1999; Paquette, Benfey, 2001). Заложение первых перегородок — критическая стадия в развитии полового и соматического зародышей (Jurgens et al., 1997; Батыгина, Захарова, 1997). Важнейшие формообразовательные процессы цветковых растений начинаются уже во время первого деления оплодотворенной яйцеклетки. Развитие семенных растений отличается тем, что в момент оплодотворения полярность нового организма не возникает de novo, а, вероятно, передается от клеток и тканей материнского растения, в окружении которых происходит развитие яйцеклетки и зиготы.
Археспориальная клетка, развивающаяся в суб-эпидермальной области зачатка мегаспорангия и дифференцирующаяся в спорогенную клетку (ме-гаспороцит) (Никитичева, 1994) увеличивается в размерах, вытягиваясь вдоль оси микропиле-хала-за (Rodkiewicz, Bendara, 1994). Мегаспороцит после мейоза преобразуется в мегаспору, развивается в семязачатке, характеризующимся полярностью, и проявляет определенные признаки поляризации: удлиненная форма, ядро, обычно смещенное к мик-ропиллярному полюсу, часто неравномерное распределение органелл в цитоплазме и каллозы в клеточной стенке. Необходимые условия для осуществления индукции мейоза имеются только в микропиллярной зоне нуцеллуса.
Сама яйцеклетка цветковых растений чаще всего имеет грушевидную форму (Жукова, 1994). Асимметричная форма яйцеклетки является выражением ее функциональной полярности. Ядро
обычно находится в апикальной области, а вакуоль — в базальной (Raghavan, 2000). Важной особенностью строения яйцеклетки покрытосеменных является различие в структуре клеточной стенки, которая обладает наибольшей толщиной со стороны микропиле, а в халазальной части настолько тонка, что граница клетки представлена практически плазматической мембраной (Raghavan, 1997). Полярность зародышевого мешка, в котором образуется яйцеклетка, является "следствием полярности клеток археспория и мегаспор" (Под-дубная-Арнольди, 1994). Таким образом, можно предположить, что яйцеклетка развивается внутри поляризованной системы зародышевого мешка и семязачатка, оказывающей векторное регуляторное воздействие, детерминирующее как морфологическую, так и физиологическую полярность яйцеклетки. Несмотря на критическую роль цитоки-нетических процессов, сопровождающих целлюля-ризацию зародышевого мешка в последующем развитии яйцеклетки и зиготы, "заложение фрагмо-пластов в зародышевом мешке" является "одним из важнейших этапов, на которые не обращают внимания при изучении детерминации, поляризации, симметрии и морфогенеза как яйцеклетки, так и зиготы" (Батыгина, Васильева, 1997).
Зигота покрытосеменных растений наделена "апикально-базальной" полярностью, ось которой определяет будущее взаимное расположение побе-говой и корневой частей зародыша (Поддубная-Арнольди, 1976; Kropf, 1994). Полярность зиготы определена полярностью зрелой яйцеклетки, которая также имеет апикально-базальную (халазаль-но-микропиллярную) ось, и осевой полярностью зародышевого мешка и семязачатка (Батыгина, Васильева, 1997). В ходе эмбриогенеза на противоположных концах продольной оси полярности зародыша организуются две группы стволовых клеток: первичные клетки меристемы побега и меристемы корня (Jurgens et al., 1997; Paquette, Benfey, 2001).
Зигота цветковых растений плотно окружена зародышевым мешком, тканями семязачатка и завязи, которые оказывают физиологическое регу-ляторное воздействие на развитие нового организма (Поддубная-Арнольди, 1976). Оно проявляется в генерации клеточной полярности и асимметрии. Зигота большинства покрытосеменных растений имеет грушевидную или цилиндрическую форму (Поддубная-Арнольди, 1976; Raghavan, 1997).
Плоскость первого деления зиготы, которое часто проходит асимметрично (Jurgens et al., 1997), у большинства покрытосеменных ортогональна по отношению к оси полярности (Магешвари, 1954; Титова, Шамров, 1997). Так, в процессе первого деления зиготы выявляется "врожденная осевая полярность раннего зародыша" (Эзау, 1980). Ориентация первых делений в процессе развития зи-
готы и проэмбрио настолько четко детерминирована и имеет настолько выраженное значение для формообразования разных видов растений, что она была положена в основу классификации типов эмбриогенеза (5оие§е8, 1937). В ходе нормального развития зародыша бластомеры образуются за счет делений, направления которых строго детерминированы и занимают положение в соответствии с той ролью, которую будут выполнять клетки. Наибольшее значение в построении основных частей зародыша придается бластоме-рам первой генерации (клеткам са и сЬ) (8оие-§е8, 1937). Таким образом, изучение первого деления зиготы представляется интересным и необходимым для установления механизмов ориентации оси полярности организма и роли цитокинети-ческого аппарата в формообразовательных процессах.
Изучение реорганизации элементов цитоскеле-та в процессе развития зиготы цветковых растений является технически сложной, но очень важной задачей биологии развития растений. В процессе наблюдения за микротрубочками в зиготе АтаЫйор818 ЖаИапа (проанализировано 200 зигот) были установлены интересные закономерности формообразования. Микротрубочки были выявлены на разных стадиях проэмбриогенеза. В эндосперме микротрубочки были в основном распределены в объеме цитоплазмы. В новообразованной зиготе микротрубочки также распределены по всему объему цитоплазмы, особенно в перинуклеарной зоне, без выраженной ориентации в каком-либо определенном направлении. Позже микротрубочки обнаруживаются преимущественно в кортикальной области. Во время развития зиготы, сопровождающегося ее удлинением, в субапикальной зоне кортикальные микротрубочки постепенно приобретали поперечную ориентацию — под прямым углом к клеточной оси (позже ось "проэмбрио— суспензор"), а в проксимальной зоне они все еще оставались продольно ориентированными. По окончании удлинения зиготы кортикальные микротрубочки занимали поперечное положение почти по всей длине зиготы. Небольшая часть микротрубочек оставалась во внутреннем объеме цитоплазмы. Удлинение зиготы сопровождается изменением формы ядра от изначальной сферической к эллипсовидной. В момент, предшествующий митозу, в кортикальной области напротив ядра наблюдается широкое препрофазное кольцо, занимающее ортогональное положение. Затем происходит формирование "типичного" веретена деления, которое наблюдается в профазе, метафазе и анафазе, когда в остальной части цитоплазмы микротрубочки не обнаруживаются. Ось веретена ориентирована в основном вдоль оси зиготы. По окончании митоза, в поздней телофазе, дочерние ядра разделяет фрагмопласт, ориентированный под пря-
мым углом к главной клеточной оси. Очень низкая частота встречаемости митотического веретена, по-видимому, объясняется высоким темпом митотического процесса (Webb, Gunning, 1991). Таким образом, иммунофлуоресцентная методика позволила установить роль цитоскелета в таком важнейшем процессе развития, как первая генерация бластомеров. Полученные данные свидетельствуют о том, что плоскость первого, поперечного деления зиготы детерминируется еще до начала митоза. Возможно, детерминация плоскости деления каким-то образом связана с ориентировкой оси полярности зиготы. Совпадение процесса элонгации зиготы с выстраиванием кортикальных пучков микротрубочек под прямым углом к оси удлинения, по-видимому, свидетельствует о роли микротрубочек в ограничении роста клетки в диаметре как прочного кольцевого периферического каркаса, установленного во многих типах растительных клеток (Green, 1992; Green, 1994). Поперечная конфигурация кортикальных микротрубочек, таким образом, возможно, способствует росту зиготы растяжением под действием тургорного давления. Выдвинутые предположения, конечно, нуждаются в экспериментальном подтверждении.
Изучение механизмов индукции и ориентации первого деления зиготы под влиянием внешних факторов представляет большой интерес с точки зрения ведущей роли генерации и модификации клеточной полярности в развитии растений (Cove, 2000). Однако "направление полярности зиготы (и в дальнейшем зародыша) зависит от осевой полярности зародышевого мешка и семязачатка" (Батыгина, Васильева, 1997). В настоящее время не представляется возможным определить период развития, когда ось полярности зиготы семенного растения была бы лабильна. Скорее всего, сама полярность передается от поколения к поколению, и ось полярности яйцеклетки остается осью полярности зиготы. Возможно "деполяризовать" зиготу никогда не удастся без значительного повреждения структуры протопласта. Сложное строение зародышевого мешка и окружающих тканей серьезно затрудняет экспериментальный доступ для исследования нового организма, находящегося в одноклеточном состоянии (Goodner, Quatrano, 1993). Так, для изучения организации цитоскелета в процессе развития зиготы A. thaliana путем иммунофлуоресцентного наблюдения микротрубочек зародышевые мешки потребовалось изолировать даже из фиксированного параформальдегидом семязачатка с помощью препаратов пектиназы и целлюлазы (Webb, Gunning, 1991). "Исследование изменений, протекающих непосредственно после оплодотворения в зародышевых мешках семенных растений, представляет очевидные трудности. Поэтому интереснейшие моменты в развитии высших растений, определяющие
дальнейший ход жизненного цикла, остаются с физиологической стороны почти неизученными", — отмечал Д.А. Сабинин (Сабинин, 1963). В настоящее время все еще "нет полной ясности относительно фаз развития самой яйцеклетки и зиготы" (Батыгина, Васильева, 1997; Батыгина, 1999). Основные трудности решения этой проблемы связаны с невозможностью осуществления полноценного экспериментального исследования детерминации процессов развития зиготы семенных растений под непосредственным действием внешних регу-ляторных сигналов, особенно векторных биофизических факторов.
Для изучения тех условий внешней среды, которые необходимы для развития зародыша и того специфического обмена веществ, который характерен для него в эти моменты, важная роль отводится модельным системам на основе культуры зародышей in vitro (Поддубная-Арнольди, 1976). Для развития половых зародышей и для соматических зародышей в природных условиях и в культурах in vitro характерны общие цитологические и эмбриологические закономерности (Батыгина, Захарова, 1997). Инициальные клетки соматических зародышей in vivo также развиваются в системе целого организма, где они, очевидно, испытывают мощное физиологическое регуляторное воздействие со стороны окружающих клеток и тканей (Баты-гина, 1999).
Большое внимание с точки зрения биологии развития и биотехнологии привлекает соматический эмбриоидогенез в культурах клеток и тканей растений. Суспензионные и каллусные культуры клеток растений изучаются как модельные эмбриоидогенные системы как для разработки технологий регенерации и клонирования растений, так и для исследования закономерностей роста и развития. Регенерация растений из культур клеток технологически не представляется сложной задачей. Однако эмбриоидогенез в культурах клеток и тканей может быть инициирован, как правило, только после достижения определенной фазы развития культуры, когда клеточная масса достигает определенного критического порога. В таких культурах in vitro непосредственное маркирование и изучение самих инициальных клеток соматических зародышей даже методом простого наблюдения весьма затруднено гетерогенностью эксплан-та и сложным характером организации клеточной массы, в которой образуются меристемные комплексы (Батыгина, Захарова, 1997; Батыгина, 1999).
Культуры клеток водорослей, мхов и папоротников на протяжении десятков лет используются как эффективные модельные системы для изучения механизмов генерации клеточной полярности (Goodner, Quatrano, 1993; Galway et al., 1994; Wa-da, Sugai, 1994; Cove et al., 1996; Furuya et al., 1997;
Hughes, Hartmann, 1998; Cove, 2000). "Громадным преимуществом при работе с низшими растениями является возможность изучать их развитие начиная с оплодотворенной яйцеклетки или споры, т.е. состояния, когда организм одноклеточен" (Сабинин, 1963). Мы установили, что протопласты мха Physcomitrella patens способны к регенерации на поляризованном свету с образованием нитей протонемы, растущей параллельно электрическому вектору из каждого протопласта. Используя это уникальное свойство протопластов мха, мы провели изучение реорганизации цитоскелета во время деления сферических протопластов на поляризованном свету (Skripnikov et al., 2000). Нами показано, что ось веретена деления устанавливается параллельно электрическому вектору, тогда как на естественном (неполяризованном) свету ми-тотические веретена ориентируются во всех направлениях. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о непосредственном участии дих-роичных пигментных систем клетки в ориентации веретена деления и цитокинетического аппарата (Skripnikov et al., 2000). Известно, что в основе фототропизма клеток мхов (Esch et al., 1999) и папоротников (Wada, Sugai, 1994) лежит дихро-ичное функционирование фитохрома, анизотропно распределенного в области клеточной периферии. Можно предположить, что фитохром может оказывать ориентирующее действие на процесс деления клетки. На основе протопластов мха Phys-comitrella patens нами получена новая одноклеточная модель, представляющая интерес для дальнейшего исследования таких ключевых процессов развития растений, как ориентация цитокинети-ческого аппарата и генерация клеточной полярности.
После формирования зародыша активные клеточные деления и формообразовательная деятельность растения сосредоточиваются в основном в побеговых и корневых меристемах (Mayer, Jürgens, 1998). В результате наблюдений за развитием апикальных побеговых меристем покрытосеменных растений были установлены XII универсальных этапов органогенеза, что методически значительно повысило эффективность морфофи-зиологического анализа разных групп растений и положило начало новому направлению в морфологии растений (Куперман, 1977). Формообразовательная активность апикальной меристемы in situ находится под физиологическим контролем биохимических факторов, образующихся в тканях растения и транспортирующихся в меристемати-ческие клетки (Green, 1996). Новые апикальные меристемы образуются в пазухах листьев. Установлено, что кроющий лист оказывает значительное физиологическое влияние на функционирование апикальной меристемы в составе пазушной почки (Long, Barton, 2000). Остается неясным, в
какой степени апикальная меристема зависит от поступления молекулярных факторов из целого растения для поддержания функциональной активности и определенного органогенного статуса — вегетативного, префлорального и флораль-ного (II, III, IV этапы органогенеза соответственно). Культура изолированных меристемных комплексов in vitro, экстенсивно применяющаяся в биотехнологии для размножения и получения безвирусных растений (Beck et al., 2000), является методологической базой, на которой можно разработать эффективные клеточные модельные системы для изучения как роли эндогенных молекулярных ростовых факторов, так и внешних биофизических и физико-химических сигналов в регуляции органогенной активности апикальных меристем (Shabde, Murashige, 1977). В лаборатории биологии развития растений МГУ была получена модельная морфофизиологическая культура апикальных меристемных комплексов Arabidopsis thaliana, в которой прямая регенерация растений с развитой вегетативной и генеративной сферой успешно осуществляется в течение 3—4 недель, т.е. в срок, сравнимый с продолжительностью аналогичного развития растений из семян в стандартных условиях в почве (Sedova et al., 2001; Седова и др., 2001). Прохождение этапов развития изолированных меристемных комплексов зависит от исходного морфофизиологического состояния экспланта (этапа органогенеза) (Криницы-на, 2003). В наших опытах было установлено, что морфологическое строение регенерантов, формиру-
емых префлоральной апикальной меристемой экс-плантов, зависит от гормонального состава среды. На средах, содержащих цитокинин, начинают закладываться листья (розеточные или стеблевые), т.е. происходит возврат к более ранним этапам развития. На среде, содержащей ауксин без цитокинина, в основном продолжают закладываться цветки. Таким образом, можно утверждать, что при отсутствии большей части тела растения на средах определенного гормонального состава апикальная меристема может возвращаться из пре-флорального состояния в вегетативное, несмотря на индуктивные для развития соцветия внешние условия (оптимальная температура, длинный день) ^еёоуа е! а1., 2001; Седова и др., 2001). Изменение спектрального состава света, на котором проводится регенерация меристемных комплексов А. ЖаНапа, путем обогащения светового потока фотонами из дальней красной области (730 нм) вызывает стимуляцию образования придаточных корней (Капота, 8кпрткоу, 2001). Полученные результаты позволяют предполагать возможность функционирования фитохрома непосредственно в меристемных комплексах. Меристемная культура АтаЫйор818 представляет интерес в качестве перспективной модели для изучения механизмов фотоморфогенеза и разработки методов фотостимуляции корнеобразования растений-регенерантов, актуальной биотехнологической проблемы, обычно возникающей в ходе получения трансгенных растений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Батыгина Т.Б. 1999. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей // Физиол. раст. 6. 884-898.
Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. 1997. Зигота // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб. С. 307—321.
Батыгина Т.Б., Захарова А.А. 1997. Параллелизм в развитии полового и соматического зародышей // Эмбриология цветковых растений. Терминологии и концепции. Т. 2. СПб. С. 635—648.
Жукова Г. 1994. Яйцеклетка // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб. С. 188—192.
Криницы на А.А. 2003. Детерминированное развитие в культуре апикальных меристем Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. in vitro // Бот. журн. 88. 50—56.
Куперман Ф.М. 1977. Морфофизиология растений. М. 288 с.
Магешвари П. 1954. Эмбриология покрытосеменных. М. 439 с.
Никитичева З.И. 1994. Спорогенная клетка // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб. С. 145—146.
Поддубная-Арнольди В.А. 1976. Цито-эмбриология покрытосеменных растений. Основы и перспективы. М. 507 с.
Поддубная-Арнольди В.А. 1994. Тетрада мегаспор // Эмбриология покрытосеменных. СПб. С. 147.
Сабинин Д.А. 1963. Физиология развития растений. М. 195 с.
Седова Е.А., Сперанская А.С., Скрипни к о в А. Ю . 2002. Регенерация Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. из апикальных меристемных комплексов in vitro // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 30—36.
Титова Г.Е., Шамров И.И. 1997. Про-эмбрио // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. СПб. С. 321—325.
Эзау К. 1980. Анатомия семенных растений. М. 558 с.
Beck S.L., Dunlop R., van Staden J. 2000. Meristem culture of Acacia mearnsii // Plant Growth Regulation. 32. 49—58.
Cove D.J. 2000. The generation and modification of cell polarity // J. of Experiment. Bot. 51. 831—838.
Cove D.J., Quatrano R.S., Hartmann E. 1996. The alignment of the axis of asymmetry in regene-
rating protoplasts of the moss, Ceratodon purpureas, is determined independently of axis polarity // Development. 122. 371—379.
Esch H., Hartmann E., Cove D., Wa-da M., Lamparter T. 1999. Phytochrome-controlled phototropism of protonemata of the moss Ceratodon pur-pureus: physiology of the wild type and class 2 ptr-mu-tants // Planta. 209. 290—298.
Furuya M., Kanno M., Okamoto H., Fukuda S., Wada M. 1997. Control of mitosis by phytochrome and blue-light receptor in fern spores // Plant Physiol. 113. 677—683.
Galway M.E., Hyde G.J., Hardham A. R. 1994. Capacity for microtubule reorganization and cell wall synthesis in cytoplasts of the green alga Mougeotia // Protoplasma. 178. 11—17.
Goodner B., Quatrano R.S. 1993. Fucus embriogenesis: a model to study the establishment of cell polarity // Plant Cell. 5. 1471—1481.
Green P . B . 1992. Cellulose orientation in primary growth: an energy level model for cytoskeletal alignment // Current Topics in Plant Biochemistry and Physiology. 11. 99—117.
Green P . B . 1994. Connecting gene and hormone action to form, pattern and organogenesis: biophysical trans-ductions//J. of Experiment. Bot. 45. Special Issue. 1775—1788.
Green P . B . 1996. Transductions to generate plant form and pattern: and assay on cause and effect // Annals of Botany. 78. 269—281.
Hughes J., Hartmann E. 1998. Photomor-phogenesis in lower plants // Concepts in Photobiology: Photosynthesis and Photomorphogenesis. New Delhi. P. 805—837.
Jack T. 2001. Plant development going MADS // Plant Molecular Biology. 46. 515—520.
Jurgens G. 1997. Axis formation in plant embryogenesis: cues and clues // Embryology of Flowering Plants. Terminology and Concepts. St. Petersburg. P. 412—417.
Jurgens G., Grebe M., Steinmann T. 1997. Establishment of cell polarity during early plant development // Current Opinion in Cell Biology. 9. 849—852.
Krinitsina A.A., Skripnikov A. 2001. Effect of far-red irradiation on the development of the isolated meristem complexes and seedlings of Arabidopsis thaliana // 12th International Conference on Arabidopsis Research. Madison. Vol. 208. P. 197.
Kropf D . L . 1994. Cytoskeletal control of cell polarity in a plant zygote // Developmental Biology. 165. 361—371.
Liljegren S.J., Yanofsky M.F. 1996. Genetic control of shoot and flower meristem behavior // Current Opinion in Cell Biology. 8. 865—869.
Long J., Barton M.K. 2000. Initiation of axillary and floral meristems in Arabidopsis // Developmental Biology. 218. 341—353.
Mayer U., Jurgens G. 1998. Pattern formation in plant embryogenesis: A reassessment // Cell and Develop. Biol. 9. 187—193.
Paquette A.J., Ben fey P.N. 2001. Axis formation and polarity in plants // Current Opinion in Genetics and Development. 11. 405—409.
Raghavan V. 1997. Molecular Embryology of Flowering Plants. Cambridge. 690 p.
Raghavan V. 2000. Developmental biology of flowering plants. New York. 354 p.
Rodkiewicz B., Bendara J. 1994. Megaspo-rocyte // Embryology of Flowering Plants. St. Petersburg. P. 146.
Sedova E.A., S p e r a n s k a y a A . S . , Skripnikov A. 2001. Effect of the phytohormones on the development of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. in the culture of meristem complexes in vitro // 12th International Conference on Arabidopsis Research. Vol. 208. Madison. P.
Shabde M . , Murashige T. 1977. Hormonal requirements of excised Dianthus cariophyllus L. shoot apical meristem in vitro // Amer. J. of Bot. 64. 443—448.
Skripnikov A., Schaefer D., Zr y d J.-P. 2000. Dynamics of the cytoskeleton during the polarotro-pic orientation of the first division of Physcomitrella paten protoplasts // Moss 2000 — Villars sur Ollon, Suisse: Laboratoire de phytogénétique cellulaire. Université de Lausanne, 2000. P. 53—54.
Soueges R. 1937. Exposes d'embryologie et de morphologie végétales. VII. Les lois du développement // Actualites scientifiques et industrielles. 521. 1—94.
Wada M., Sugai M. 1994. Photobiology of ferns // Photomorphogenesis in plants 2nd Edition. Dordrecht. P. 783—802.
Williams R.W. 1998. Plant homeobox genes: many functions stem from a common motif // BioEssays. 20. 280—282.
Webb M.C., Gunning B.E.S. 1991. The mic-rotubular cytoskeleton during development of the zygote, proembryo and free-nuclear endosperm in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Planta. 184. 187—195.
CELL MODEL SYSTEMS
IN DEVELOPMENTAL PHYSIOLOGY OF HIGHER PLANTS
A.Y. Skripnikov
Higher plant embryo sacks and apical meristems constitute complex multi-cellular systems creating obvious obstacles to the study of the alignment of polarity axis and orientation of the planes of cell division during plant development. Biophysical signals such as light or gravity could hardly be applied as the vectorial experimental stimuli especially at the earliest stages of ontogenesis. Unicellular models therefore are uniquely suitable for studying the cellular mechanisms of directional plant growth. A culture of moss protoplasts represents an efficient model system to study changes in cell structure influenced by environmental stimuli. The accessibility of mosses to experimental morphogenesis is based on the tropic growth of moss cells in response to uni-
directional light (phototropism), plane-polarised light (polarotropism) and gravity (gravitropism). We demonstrate that in moss protoplasts dividing in polarised light the equatorial planes of the spindle and phragmoplast are aligned perpendicular to the electrical vector, whereas in non-polarised light they are oriented in all directions. Our observations suggest the involvement of dichroic pigment systems in the process of transduction of a vectorial light signal to the cytoki-netic apparatus. The in vitro isolated Arabidopsis thaliana meristem model system has been established to study the effect of endogenous and environmental factors on plant development. We show that shoot regeneration from generative meristem occurs within 3—4 weeks. Cytokinin is critical for leaves formation and apparently affects the reversion of isolated meristems from pre-floral to vegetative state. Isolated apical meristem complexes pre-incubated during 3 days in dim far-red light regenerated to give rise to plants with adventitious roots after 41 days of incubation on B5 medium. Control plants obtained after pre-incubation of seeds and isolated meristems in darkness developed only primary roots and did not produce the lateral and the adventitious roots.
