CC BY
82
УДК 575:631.527
МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ В КУЛЬТУРЕ ОСИ СОЦВЕТИЯ IRIS. HYBRIDA HORT.
Л.И. Тихомирова
Приведены результаты изучения особенностей морфогенеза и регенерационной активности в эксплантах оси соцветия I. hybrida.. Отмечено, что морфогенез происходит по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования. Побеги сформированные de novo имели исключительно эндогенное происхождение. Среди клеток паренхимы первичной коры наблюдались клетки со спиралевидным утолщением клеточной стенки -гидроциты.
Ключевые слова: морфогенез, регенерация, эксплант, микроразмножение, I. hybrida, геммогенез, ткани, ось соцветия, in vitro.
В России первое упоминание в литературных источниках по использованию культуры ткани для размножения ирисов относится к 1977 году, автор Л.С. Лунева. Работа проводилась в Ботаническом институте им. Комарова АН СССР. Был использован метод дифференциации почек в каллусной культуре. В эксперимент брались следующие виды и сорта ирисов: Iris klatti Kem.-Nat., I. sibirioa L., I. japonika Thunb., I. hoogiana Dykes, I. hybrida hort. Harbir Blue. В качестве экспланта использовались корневищные почки. В ходе опытов изучались условия культуры (состав среды, температура, освещение), благоприятствующие образованию каллусной ткани и последующему органогенезу (Лунева, 1977).
На успех микроклонального размножения влияет масса факторов. Особое значение в этом процессе имеет выбор экспланта и способа регенерации.
При использовании вегетативных почек в качестве первичных эксплантов для микроразмножения I. hybrida очень трудно получить стерильную активно пролиферирующую культуру. Ирисы подвержены бактериальной и грибной инфекции. Бактериоз (возбудитель Erwinia ceratovora) или мягкая гниль корневищ, является опасным заболеванием I. hybrida. В неблагоприятные годы в условиях Санкт-Петербурга можно потерять до 90% коллекции бородатых ирисов (Родионенко, 2002). Даже при самых жёстких способах стерилизации вегетативных почек, бактерии из рода Erwinia могут являться источником внутренней инфекции и проявлять себя на протяжении всех этапов микроразмножения, приводя к гибели экспланты (Тихомирова, 2010).
Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза мало пригодно для использования при микроразмножении сортов растений, так как при дедифференциации клеток может происходить полиплоидизация и анеуплоидизация числа хромосом, которое способствует получению неоднородного потомства.
В доступной нам литературе мы не обнаружили данных об использовании фрагментов оси соцветия в качестве первичных эксплантов при микроклональном размножении I. hybrida.
Цель работы - выявить морфогенетические особенности развития и регенерационную способность оси соцветия в культуре in vitro для культиваров I. hybrida.
Объекты, методы и условия исследований.
Объекты исследований - перспективные сорта отечественной и зарубежной селекции I. hybrida, из коллекции НИИСС: Latin Lover, Jazzamatazz, Ланцелот. В качестве эксплантов использовали фрагменты оси соцветия. Цветки брали в фазе бутонизации на VI-VII этапах органогенеза. Стерилизацию бутонов проводили в два этапа. На первом этапе бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигали в пламени спиртовки. На следующем этапе цветки выдерживали 10 минут в 1% растворе сульфохлорантина. После стерилизации для культуры in vitro от генеративных побегов брали участки между кроющим листом и цветком.
Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга, с добавлением 30 г/л сахарозы. Из регуляторов роста на этапе введения ирисов в культуру изучено действие l - нафтилуксусной кислоты (НУК) 3-5мкМ, и 6-бензиламинопурина (БАП) в концентрации 4-8мкМ. Работу в асептических условиях, приготовление и стерилизацию питательных сред проводили по общепринятым методикам (Калинин и др., 1980).
Растения выращивали в лабораторных условиях при искусственном освещении (2000-4000 лк) в условиях фотопериода: 16/8 часов свет/темнота и температуре 24-260С.
Каждые 3-5 дней проводили наблюдения и делали гистологические срезы эксплантов. Выявляли регенерационную способность и пути морфогенеза, согласно существующей в настоящее время классификации путей морфогенеза (Батыгина и др., 2002). Анатомическое строение эксплантов изучали на временных и постоянных препаратах, изготовленных по общепринятой методике (Барыкина и др., 2004).
Результаты и их обсуждение
Отличительной особенностью морфогенеза у I. hybrida сорта Latin Lover in vitro является его высокая регенерационная активность. Через 14 дней после введения в культуру из ткани фрагментов оси соцветия сформировались зачатки побегов на питательных средах содержащих 4-8 мкМ БАП и 3-
5 мкМ НУК (рис. 1).
Рис. 1. Геммогенез у эксплантов оси соцветия I. hybrida сорта Latin Lover
В отличие от генотипов I. ensata и I. sibirica у регенерированных побегов генотипов I. hybrida отмечено явление витрификации, возможно связанное с высоким для данного вида ириса содержанием БАП в питательных средах (Тихомирова, 2010).
В качестве контроля использовали питательную среду содержащую БАП 1мкМ НУК 1мкМ. На данной среде все экспланты в 0 пассаже увеличились в размерах, но в дальнейшем погибли в результате некроза тканей.
Изучение анатомического строения оси соцветия I. hybrida сорта Jazzamatazz (VI -VII этапы органогенеза) показало следующее. Генеративный побег покрыт эпидермой, образованной одним слоем клеток с кутикулой. Эпидермальные клетки плотно сомкнутые, имеют таблитчатую форму. Антиклинальные стенки клеток ровные (рис. 2).
Рис. 2. Анатомическое строение генеративного побега I. hybrida сорт Лаггаппиагг на VI - VII
этапах органогенеза. (Увел. 10 х 10)
Под эпидермисом располагаются 12 слоёв паренхимы первичной коры. Клетки изодиаметрической формы, плотно сомкнуты. Между клетками первичной коры отмечены проводящие пучки.
Центральный цилиндр представлен клетками перицикла, расположенными в три ряда,
основной паренхимой и закрытыми коллатеральными пучками. Клеток склеренхимы на данном этапе развития генеративного побега не обнаружено. Вся внутренняя осевая часть генеративного побега состоит из основной паренхимы, среди которой повсюду рассеяны закрытые проводящие пучки. Проводящие пучки располагаются в беспорядке. На периферии их больше, но они мелкие, в центре оси соцветия их меньше, но они крупнее.
Известно, что, первая ответная реакция на поранение - формирование защитной плёнки. Она образуется из остатков разрушенных оболочек и клеточного содержимого (Чурикова и др., 1995). Относительно рано у I. hybrida формируется раневая пробка, представленная несколькими слоями периклинально делящихся клеток. Наряду с защитной плёнкой она предохраняет живые ткани экспланта о внешней инфекции и создаёт благоприятную среду для проявления меристематической активности отдельных клеток.
При анатомо-морфологическом исследовании выявили особенности прохождения этапов морфогенеза у фрагментов оси соцветия I. hybrida. На 4 сутки культивирования эксплантов отмечено образование полиад (несколько клеток под общей оболочкой) в районе перицикла, в первичной коре, в обкладках проводящих пучков, прилегающих к перициклу (рис. 3).
Рис. 3. Анатомическое строение экспланта оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz на 4 сутки культивирования (поперечный срез). (Увел. 10x10)
На 7-12 сутки культивирования делением затронуты все слои клеток первичной коры. Происходит массовое деление клеток паренхимы, образуется большое количество полиад, обособляются зоны деления клеток. За счёт разрастающихся внутренних тканей, край экспланта становится неровным. Очагов каллусной ткани не обнаружено. Полиады образованы разным количеством клеток от 2 до 10, в основном триады и пентады (рис. 4).
Рис. 4. Анатомическое строение экспланта оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz на 7 сутки культивирования (поперечный срез). (Увел. 10x10)
На 15 сутки культивирования от эпидермиса в глубь экспланта просматривается единый массив делящихся клеток. Обособляются участки с формирующимися побегами de novo в области перицикла (рис. 5).
Рис. 5. Анатомическое строение экспланта оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz на 15 сутки культивирования (поперечный срез). (Увел. 10x10)
На 18 сутки культивирования среди клеток паренхимы первичной коры у I. hybrida впервые выявлены клетки со спиралевидным утолщением клеточной стенки - гидроциты (рис. 6). Таких клеток довольно много. Они соединены между собой гидроцитными тяжами и узлами, образуя тем самым гидроцитную систему.
В работах Р.П. Барыкиной и О.А. Чуриковой (1995, 2004) отмечено, что формирование такой васкулярной системы наблюдается в культивируемых in vitro эксплантах вегетативных органов разной морфологической природы. Посредством её происходит перемещение энергопластических веществ и гормональных регуляторов роста, проведение их в очаги меристематической активности клеток. Таким образом, устанавливается связь побега образующегося de novo, с проводящей системой материнского экспланта. Гидроцитные узлы появляются или вслед за образованием очагов меристемы, часто выступая в качестве центров дальнейшей морфогенетической дифференциации, или васкулярные элементы формируются уже при первых делениях инициальных клеток, на стадии полиад, стимулируя деление прилегающих к ним клеток с последующим образованием побеговых конусов. Вышеуказанные процессы могут идти и параллельно. Наконец, васкулярные элементы, возникают также в основании адвентивных почек.
Рис. 6. Анатомическое строение экспланта оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz на 18 сутки культивирования, гидроцитные тяжи (поперечный срез). (Увел. 10x40)
Визуально геммогенез у эксплантов оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz отмечается на 1522 сутки. Побеги закладываются эндогенно в области перицикла. В более глубоких слоях экспланта в этот период продолжают идти процессы деления клеток, дифференциации тканей и закладка новых побегов (рис. 7, табл. 1).
Рис. 7. Анатомо-морфологическое строение экспланта оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz на 22 сутки культивирования: а) внешний вид, б) анатомическое строение (поперечный срез).
(Увел. 10x10)
Рис.8. Регенерация побегов у эксплантов оси соцветия I. hybrida сорт Ланцелот.
Таблица 1
Этапы морфогенеза в эксплантах оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz на питательной среде
с 6мкМ БАП и 5мкМНУК
Срок фиксации материала от момента введения в культуру in vitro Изменения, произошедшие в тканях экспланта
4 суток Образование полиад в районе перицикла, в первичной коре, в обкладках проводящих пучков, прилегающих к перициклу.
7 - 12 суток Делением затронуты все слои клеток первичной коры. Массовое деление клеток паренхимы, большое количество полиад, обособляются зоны деления клеток. За счёт разрастающихся внутренних тканей, край экспланта становится неровным.
15 суток От эпидермиса в глубь экспланта просматривается единый массив делящихся клеток. Обособляются участки с формирующимися побегами de novo в области перицикла.
18 суток
22 суток В области перицикла на поверхности экспланта массово появляются побеги
Выводы
1. В эксплантах оси соцветия I. hybrida на питательных средах с содержанием 4-8 мкМ БАП
3-5 мкМ НУК морфогенез проходил по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования.
2. Анатомическое строение генеративного побега на I. hybrida сорт Jazzamatazz на VI - VII
этапах органогенеза типично для выполненного стебля однодольных растений.
3. Меристематическая активность (возникновение полиад) отмечалась, начиная с 4 дня культивирования, и была распространена в области перицикла, в первичной коре, в обкладках проводящих пучков, прилегающих к перициклу.
4. Системы тканей побегов в экспланте оси соцветия I. hybrida сорт Jazzamatazz развивались как из клеток перицикла, так и из клеток паренхимы первичной коры.
5. На 18 сутки культивирования в эксплантах среди клеток паренхимы первичной коры наблюдались клетки со спиралевидным утолщением клеточной стенки - гидроциты.
6. Побеги, развившиеся на эксплантах оси соцветия. I. hybrida сорт Jazzamatazz имели исключительно эндогенное происхождение.
Investigation results of morphogenesis peculiarities and regenerative activity of inflorescence axis I. hybrida in explants are presented there. It’s noted, that morphogenesis is carried out similar to gemmagenesis, passing by the stage of callus formation. Shoots, formed de novo, were of endogenous origin. Among cells of the primary cortex parenchyma, cells with spiral thickening of the cell wall - hydrocytes - were observed.
The key words: morphogenesis, regeneration, explant, micropropagation, I. hybrida, gemmagenesis, tissue, inflorescence axis, in vitro
Список литературы
1. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М.: Изд-во МГУ, 2004. -312 с.
2. Барыкина Р.П., Чурикова О.А. Особенности морфогенеза некоторых видов Scilla L. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология, № 1. 2004. С. 20-23.
3. Лунева Л.С. Размножение ирисов (Iridaceae) методом культуры апикальных меристем in vitro //Ботанический журнал. Т. 62. 3. Наука. 1977. С. 416-421.
4. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980. 488 с.
5. Родионенко Г.И. Ирисы. Санкт-Петербург, 2002. 60 с.
6. Тихомирова Л.И. Получение стерильной активно пролиферирующей культуры ириса в условиях in vitro //Достижения науки и техники АПК. № 8. 2010. С. 37-40.
7. Тихомирова Л.И. Особенности индукции морфогенеза из различных фрагментов цветка ириса в культуре in vitro // Turczaninowia. 2010. № 3 (3). С. 147-151.
8. Чурикова О.А., Барыкина Р.П. Регенерационная способность некоторых луковичных и клубнелуковичных однодольных in vitro. Морфогенетический аспект //Вест. Моск. У-та. Сер. Биология. 1995. №2. С.58-66.
Об авторе
Тихомирова Л. И.- научный сотрудник лаборатории биотехнологии, НИИСС им Лисавенко, Алтайский кр. г. Барнаул, Змеиногорский тр. 49. Домашний адрес: Алтайский кр. г. Новоалтайск пер. 2 Трудовой 27. 8-385-2-68-45-75, 8-905-984-22-92. e-mail: L-t.ichomirova@yandex.ru.
