CC BY
88
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная биология
Б
Новости клеточных технологий Клеточная биология. Онкогенный потенциал CD133+
CD133+ клетки были описаны как стволовые клетки взрослого организма в 1997 году [1, 2]. Экспрессия гли-копротеина CD133+ описана на гемопоэтических клетках фетальной печени, костного мозга, пуповинной и периферической крови [1-4], на циркулирующих эндотелиальных прогениторах [5] и некоторых опухолевых клетках человека [6]. Оказалось, что клетки способны к многократным делениям и высокой степени экспансии in vitro, что позволило их рассматривать как одну из самых ранних стволовых популяций во взрослом организме человека [7]. Беспокойство клиницистов, применяющих стволовые клетки дефинитивных тканей, в последнее время стали вызывать публикации, посвященные изучению их возможного онко-генного потенциала. Так, оказалось, что потенциальной он-когенностью могут обладать нейральные [8] и стволовые клетки костного мозга [9]. Кроме того, трансплантация любых тканеспецифичных стволовых клеток, положительных по маркеру раннего эмбриогенеза - Oct-4, может быть потенциально онкогенно опасна [10]. Онкогенный потенциал взрослых стволовых CD133+ клеток остается плохо изученным. Это становится особо актуальным в связи с начавшимися клиническими испытаниями этих клеток в целях кардиомиопластики [11, 12]. В 2003 году группа Singh выделила CD133+ клетки из нейро-опухолей человека [13]. При их экспансии in vitro исследователи получали опухоли с таким же фенотипом, из которых и были выделены CD133+. Напротив, при культивировании CD133- клеток опухоли, они не образовывали сферы и «теряли злокачественный фенотип» [13]. Новая работа этой группы, опубликованная в Nature, более детально изучает потенциальный онкогенный риск трансплантации «чистой» популяции CD133+ in vivo. Для проверки гипотезы об онкогенности этих клеток, CD133+ и CD133- клетки сортировали (MACS) из опухолей головного мозга человека - медуллобластомы (n=3) и глиобластомы (n=4). Обе популяции свежеизолированных клеток вводили стереотаксически в лобные доли NOD/SCID мышей. В стандартном эксперименте по индукции канцерогенеза путем ксенотрансплантации злокачественных клеток человека в головной мозг мышей для формирования опухоли обычно требуется 100 тыс. - 1 млн. клеток. В данном эксперименте введение всего лишь 100 CD133+ клеток вызывало образование полноценной опухоли через 12-24 недель после трансплантации. Введение 50 тыс. - 100 тыс. CD 133- клеток, отсортированных из той же первичной опухоли, приводило к формированию гли-ального рубца, но не опухоли. После трансплантации CD133+ клеток у 16 мышей из 19 развились опухоли (рис.). Для проверки фенотипа при дифференцировке клеток и развитии опухоли использовали иммуногистохимию. При формировании медуллобластомы CD133+ клетки становились nestin+/vimentin+ (неспецифические маркеры, используемые для идентификации нейрональных прогениторных клеток), большинство человеческих клеток окрашивалось также на beta-III-tubulin и некоторая часть на GFAP (glial fibrillary acidic protein). Клетки глиобластомы, образовавшиеся впоследствии из CD133+ экспрессировали nestin, MIB-1 (как маркер пролиферации), GFAP и MAP2 (microtubule associated protein). Часть клеток коэкспрес-сировала CD133+/GFAP. В конечном итоге, CD133+ клетки формировали полноценную опухоль, большинство клеток которой были CD133- и гетерогенны по экспрессии
различных (по степени зрелости) нейромаркёров. Гистологическая структура (включая классическую атипию) и повышенный уровень экспрессии p53 гена родительских опухолей и дочерних из ксенографтов были одинаковыми. Суммарно эти данные указывают на то, что CD133+ клетки, выделенные из нейро-опухолей человека являются опухо-ле-инициирующими клетками in vivo и в формировании опухоли проходят различные стадии как нейрональной так и астроцитарной дифференцировки.
Рис. МРТ-томограмма опухоли в головном мозге SCID-мышей через 14 недель после стереотаксической инъекции в лобную область 1000 CD 133+ клеток, выделенных из медуллобластомы человека.
Для проверки способности клеток к самообновлению производили серийные трансплантации. С этой целью вводили 1000 CD133+ клеток в мозг мышей и через 6 недель получали опухоль, из которой вновь выделяли 1000 CD133+ клеток и трансплантировали их другим («здоровым») мышам той же линии. Через 5 недель наблюдали полную фе-нотипическую рекапитуляцию «родительской» опухоли во вторичных графтах. Результативность эксперимента (рекапитуляции фенотипа) - 2 из 2 (родительских - детская гли-областома) и 3 из 3 (родительских - взрослая глиобласто-ма). При серийной трансплантации CD133- клеток результат был отрицательным.
Для доказательства отсутствия контаминации трансплантата нормальными нервными клетками производили цитогенетический анализ (SKY - спектральное кариотипи-рование и FISH). Практически во всех CD133+ и CD133-клетках трансплантата находили аномалии в хромосоме 17. Количество клеток с нормальным кариотипом было 4%. По данным FISH анализа 80% CD133+ и CD133- клеток имели аномалии. Таким образом, стволовые CD133+ клетки, выделенные из злокачественных нейро-опухолей человека, обладают облигатной канцерогенной активностью in vivo. В свете полученных данных следует полагать, что перед началом клинических испытаний протоколов клеточной терапии, при моделировании необходимо исследовать и тумо-рогенный потенциал CD133+ клеток (и других стволовых клеток взрослого организма), выделенных из нормальных тканей.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная биология
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yin A.H. et al. AC133 a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood 1997; 90; 12: 5002-12.
2. Miraglia S. et al. A novel five-transmembrane hematopoietic stem cell antigen: isolation, characterization, and molecular cloning. Blood 1997; 90; 12: 5013-21.
3. Gordon P.R. et al. Large-scale isolation of CD133+ progenitor cells from G-CSF mobilized peripheral blood stem cells. Bone Marrow Transplant 2003; 31: 17-22.
4. Gallacher L. et al. Isolation and characterization of human CD34(-)Lin(-) and CD34(+)Lin(-) hematopoietic stem cells using cell surface markers AC133 and CD7. Blood 2000; 95: 2813-20.
5. Peichev M. et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood 2000; 95: 952-8.
6. Bhatia M. AC133 expression in human stem cells. Leukemia 2001; 15: 1685-8.
7. Summers J.Y. et al. AC133+ G-0 cells from cord blood show a high incidence of long-term culture-initiating cells and a capacity for more
8.
G.
than 100 million-fold amplification of colony-forming cells In vitro. Stem Cells 2004; 22: 704-15.
Uchida K. et al. Possible oncogenicity of subventricular zone neural stem cells: case report. Neurosurgery 2004; 55: E977-E987. Serakinci N. et al. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation. Oncogene 2004; 23; 29: 5095-8. 10. Tai M.-H. et al. Oct-4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis online (prepublished - doi:10.1093/carcin/bgh321). Stamm C. et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003; 361: 45-6. Pompilio G. et al. Autologous peripheral blood stem cell transplantation for myocardial regeneration: a novel strategy for cell collection and surgical injection. Ann Thorac Surg 2004;78:1808-13.
Singh S.K. et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res 2003 63: 5821-8.
11
12
13.
Подготовил А.В. Берсенев;
10
Слияние клеток костного мозга с мышечными клетками терапевтически не эффективно
В ряде экспериментальных исследований было показано, что системная или локальная трансплантация целого костного мозга (ТКМ) или его гемопоэтической фракции (ГК) может коррегировать такие мышечные дефекты как синтез дистрофина (на mdx модели миопатии Дюшенна) [3], токсическое и радиационное повреждение [1, 2, 4]. Клетки костного мозга обусловливают также регенерацию повреждённой сердечной мышцы [5, 6]. Механизм регенерации мышцы и терапевтический эффект после таких трансплантаций объясняют феноменом слияния клеток костного мозга с миоцитами хозяина [2, 7, 8]. Биологическое значение феномена слияния клеток костного мозгареципиента и хозяина остаётся неясным [8, 9, 10]. До настоящего времени, было показано, что слияние может обусловливать регенерацию повреждённой ткани и не нести никаких отрицательных последствий [2, 9, 10]. В недавнем исследовании, опуб-ликованом в Journal Clinical Investigation, впервые показано, что слияние клеток костного мозга при генетической мио-патии не имеет никакого смысла и терапевтически не эффективно.
Модель нарушения синтеза саркогликана-дельта (Sgcd-7-мыши) была предложена как альтернатива mdx модели миопатии Дюшенна. Основные преимущества этого подхода, по мнению исследователей, заключаются в том, что это эндогенный маркёр зрелых мышечных волокон, который образует мембрана-связанный комплекс, дефект которого влечёт повреждение других членов семейства сар-когликанов и дистрофина. Это обусловливает развитие прогрессирующей мышечной дистрофии и кардиомиопатии [11]. ГК (side population) выделяли из костного мозга по методу Goodell (1996). Аллогенные (от здоровых мышей) трансгендерные трансплантации выполняли сублетально облучённым Sgcd-7-мышам внутривенно в дозе 4-30 тыс. клеток. Клетки идентифицировали по Y-хромосоме в био-птатах мышц бедра через 3 недели и через 3 месяца после трансплантации. Скопления донорских клеток обнаруживали у реципиентов между мышечными волокнами (более чем в 90%). Хороший engraftment ГК в дефектные мышцы наблюдали также в виде Y+ ядер в центре или по периферии миофибрилл. У каждой Sgcd-7-мыши-реципиента (n=14) исследовали по 10000 мышечных волокон на предмет синтеза саркогликана. Однако из такого огромного количества
Рис. Схема возможного репрограммирования ядра дефектного миоцита посредством слияния с донорской "нормальной" клеткой: I - все зрелые мышечные гены выключены; II - общие (коммитированные) гены включены, зрелые (специфические) - выключены; III - "ранние" мышечные гены включены, "зрелые" мышечные -выключены; IV - все мышечные гены включены (по Cossu G. J Clin Invest 2004; 114: 1542, с изменениями).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2OO5
