CC BY
18
Королев С.А.1, Селиверстов А.В.2, Зверков О.А.3, Любецкий В.А.4
гИППИ РАН, г. Москва, стажер-исследователь, korolev @ iitp . ru 2ИППИ РАН, г. Москва,к.ф.-м.н., в.н.с., slvstv @iitp . ru 3ИППИ РАН, г. Москва, к.ф.-м.н., н.с., zverkov@iitp .ru 4ИППИ РАН, г. Москва, д.ф.-м.н., зав.лаб., lyubetsk@ iitp . ru
КЛАССИЧЕСКАЯ АТТЕНЮАТОРНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ, ЗАВИСИМАЯ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ТРИПТОФАНА, У АКТИНОБАКТЕРИЙ
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Актинобактерии, классическая аттенюаторная регуляция, лидерный пептид, моделирование транскрипции.
АННОТАЦИЯ
Предсказаны и подтверждены моделированием новые случаи классической аттенюаторной регуляции, зависимой от концентрации триптофанил-тРНК, у актинобактерий. Показано, что экспрессия генов, кодирующих ферменты пути синтеза триптофана, регулируется аттенюаторной регуляцией только у видов двух родов Corynebacterium и Streptomyces. Обсуждается совершенствование методов моделирования аттенюаторной регуляции, вовлекающей псевдоузлы и триплексы на РНК.
Лидерные гены играют ключевую роль в аттенюаторной регуляции, основанной на сопряжении транскрипции и трансляции у прокариот. Впервые такая регуляция была описана для Escherichia coli [1], но также известна и для актинобактерий. В частности, экспериментальное подтверждение такой регуляции, зависимой от концентрации триптофана, получено для Corynebacterium glutamicum [2] и Streptomyces venezuelae [3]. Широкомасштабный биоинформатический поиск проведен в работах [4-6].
Аттенюаторная регуляция определяется структурой, которая включает ген лидерного пептида с регуляторными кодонами в нём и связанные с ним альтернативные вторичные структуры мРНК, одни из которых приводят к преждевременной терминации транскрипции структурного гена, а другие позволяют РНК-полимеразе продолжать транскрипцию структурного гена. Эта альтернатива зависит от скорости, с которой рибосома выполняет трансляцию лидерного пептида. В свою очередь скорость зависит от концентрации аминоацил-тРНК, которая в свою очередь зависит от концентрации соответствующей аминокислоты и аминоацил-тРНК синтетазы.
Нами проведён поиск лидерных генов перед всеми размеченными в аннотациях генами 196 геномов актинобактерий, доступных в базе данных NCBI. При этом лидерные пептиды, кодируемые лидерными генами, содержат три подряд или две близкие пары остатков триптофана. Далее гены, отмеченные в аннотации, называются структурными. Предсказанные нами лидерные гены не перекрывают структурные гены и обычно имеют небольшую длину.
Моделирование классической аттенюаторной регуляции выполнено нашей программой, описанной в [7].
На рисунке 1 показана зависимость числа предсказанных лидерных генов с кодонами триптофана от расстояния между лидерным и структурным генами у актинобактерий.
Классическая аттенюаторная регуляция, зависимая от концентрации триптофана или триптофанил-тРНК, предсказана только у некоторых видов двух родов Corynebacterium и Streptomyces. При этом расстояние между лидерным и структурным генами колеблется в пределах от 50 до 296 п.н. У многих штаммов коринебактерий C. pseudotuberculosis и C. ulcerans лидерные гены предсказаны перед обоими генами trpB и trpE. У штаммов C. diphtheriae - только перед опероном, включающим trpB1 и другие гены пути синтеза триптофана. У C. aurimucosum лидерные гены предсказаны перед геном trpS, кодирующим триптофанил-тРНК синтетазу, и большим опероном, содержащим ген trpE и другие гены пути синтеза триптофана, включая trpB и trpA. У
Streptomyces гены антранилат синтазы, предположительно регулируемые классической аттенюацией, не входят в единый оперон с другими генами пути синтеза триптофана. Ранее нами исследована потенциальная аттенюаторная регуляция гена phzE (называемого также trpE1), кодирующего антранилат синтазу [4], перед которым нами предсказан лидерный ген, содержащий три подряд кодона триптофана. У близкого вида S. caШeya перед геном phzB, кодирующим антранилат синтазу, также предсказан лидерный ген. Аналогичная картина наблюдается у S. scabiei и S. coe^ico^or для гена trpE.
121-
10
8
6
4
IIIIIIIIIIII ММ IIIIIIIIIIII ММ IIIIIIIIIIII ММ IIIIIIIIIIII ММ IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII IIIIIIIIIIII1111
Рис.1. Зависимость числа предсказанных лидерных генов с кодонами триптофана от расстояния между лидерным и структурным генами у актинобактерий
Выполненное нашими методами моделирование подтверждает эффективность классической аттенюации для генов trpE и trpB у C. pseudotuberculosis и гена trpB1 у C. diphtheria 31A. Результат моделирования показан на рисунке 2. Однако такая регуляция гена trpB1 не подтверждается для штамма С. diphtheriae INCA 402. 100
90
80
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
trpE, С. pseudotuberculosis > trpB, С. pseudotuberculosis й. trpBl, С. diphtheriae Рис.2. Зависимость частоты терминации транскрипции до начала транскрипции структурного гена от концентрации триптофана в модели для генов trpE и trpB у C. pseudotuberculosis, гена trpB1 у C. diphtheria 31A.
Классическая аттенюаторная регуляция, зависимая от концентрации триптофанил-тРНК предсказана для видов двух родов Corynebacterium и Streptomyces. Эти предсказания хорошо согласуются с экспериментами [1-2]. Отсутствие такой регуляции у других видов может быть
связано с регуляцией на другом уровне. Некоторые из ферментов пути синтеза триптофана содержат на Ы-конце домен PF04715, вовлечённый в ингибирование фермента триптофаном [8].
Например, в геноме Streptomyces avermitШs МА-4680 ^епВапк: ЫС_003155) есть два гена, предположительно вовлечённых в синтез антранилата из хоризмата, которые имеют низкое сходство между собой. Первый ген trpE (с координатами 7417784..7419265) кодирует короткий белок длиной 493, который содержит Ы-концевой домен PF04715 и домен PF00425, связывающий хоризмат. Второй ген phzE (или trpE1 с координатами сотр1етеШ;(7320283..7322268)) кодирует длинный белок, содержащий домен PF00425, связывающий хоризмат, и домен PF00117, характерный для глутаминамидотрансфераз, но не содержит домена, участвующего в ингибировании триптофаном. Третий ген pabB (с координатами 8122893..8124014) и четвёртый pabAB (с координатами сотр1етеМ(1468399..1470597)). Последний ген также кодирует белок с Ы-концевым доменом PF04715. Домены определены по базе данных Pfam [9]. Координаты указаны по данным из GenBank, доступным по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/148878541. Ранее нами исследована потенциальная аттенюаторная регуляция гена phzE (называемого также trpE1~) [4], перед которым нами предсказан лидерный ген, содержащий три подряд кодона триптофана. Почему такая регуляция не найдена перед генами trpE и pabAB? Одно из возможных объяснений в том, что эти гены кодируют ферменты, которые ингибируются триптофаном. Тогда как фермент, кодируемый геном phzE, не ингибируется, поскольку не содержит PF04715 на Ы-конце. У близкого вида Streptomyces cattleya антранилат синтаза, кодируемая геном phzB, содержит домены PF00425 и PF00117, но не содержит домен PF04715. Перед этим геном также предсказан лидерный ген. Аналогичная картина наблюдается у Streptomyces scabiei (ген trpE). У Streptomyces гены антранилат синтазы, предположительно регулируемые классической аттенюацией, не входят в единый оперон с другими генами пути синтеза триптофана.
Отметим, что у актинобактерий известны и другие типы аттенюаторной регуляции. Один из них, вовлекающий белок Rho, описан в работе [10]. Но и случаи аттенюации транскрипции, не связанные с дополнительными факторами, могут значительно отличаться от классической аттенюации. Структура РНК может включать псевдоузлы и триплексы [5], существенно затрудняющие моделирование регуляции. Разработка новых алгоритмов, учитывающих эти эффекты, позволяет уточнить список регулируемых генов и эффективность предсказанной регуляции.
Напомним, что триплексы - это три участка РНК, один из которых состоит полностью из пуриновых нуклеотидов, а два других участка имеют относительно пуринового участка параллельную и антипараллельную ориентации. Пара антипараллельных участков образует спираль РНК, в которой комплементарными считаются уотсон-криковские пары и GU пара. Таким образом, два участка триплекса образуют обычную спираль, а еще один, параллельный, участок связан с ней хугстиновскими водородными связями. Последний участок называется третьим плечом триплекса, которое, как и составляющие его нуклеотиды, в записи отделяется знаком * от самой спирали (от ее нуклеотидов). В триплексе возможны триады нуклеотидов: C*GU, G*GC, G*GU, и*Аи, А*Аи, A*GC, C*GC и некоторые другие. Триады характеризуются рядом особенностей, например, триада C*GC прочная лишь в слабокислой среде, когда происходит протонирование по атому N3 цитозина. Имеется много публикаций о РНК-триплексах, среди которых отметим [10-16]. Если третье плечо триплекса находится на 5'-конце его спирали, то необходимо, чтобы оно располагалось на определенном расстоянии от соседнего к нему плеча спирали, достаточном для сворачивания триплекса. Мы принимали: если третье плечо содержит к нуклеотидов, то оно отделено не менее чем на k+6 нуклеотидами от соседнего плеча. Если третье плечо находится на З'-конце спирали, то оно может быть и вблизи нее, как показано в [15-16].
Разрешено образование псевдоузлов у всех вторичных структур в каждом текущем окне на РНК между рибосомой, транслирующей лидерный пептид, и РНК-полимеразой. При этом энергия вторичной структуры вычисляется на основе усовершенствования метода, представленного в [17], и учитывается температура типичная для среды обитания бактерии.
При моделировании аттенюаторной регуляции у некоторых видов актинобактерий эффективная зависимость от концентрации триптофана частоты преждевременной терминации транскрипции наблюдается только при учёте РНК-триплексов и псевдоузлов. Однако полученные результаты носят предварительный характер, поскольку точные значения энергий этих структур не известны. В частности, важную роль играет правильное вычисление изменения энтропии при формировании триплексов.
С другой стороны, анализ траекторий моделирования в нашей модели позволяет
приписать некоторым шпилькам роль терминатора, а другим - антитерминатора, и построить адекватное регуляции (если она имеется) локальное множественное выравнивание потенциальных регуляторных областей. Мы ожидаем, что существенные элементы регуляторных структур консервативны, то есть хорошо выравниваются друг с другом. И действительно, такие выравнивания обычно удаётся построить [4-6] Это даёт возможность независимой проверки правильности предсказания, в частности, правильности выбора формул для вычисления энергии и констант для вычисления скоростей образования или распада элементов структуры РНК: спиралей и триплексов.
Описанные методы могут применяться и для предсказания эффективности регуляции инициации трансляции в зависимости от скорости трансляции лидерного пептида. Типичным примером такой регуляции служит LEU-регуляция гена leuA, которая обнаружена у большинства актинобактерий из порядка Actinomycetales [4-5]. Здесь предсказание регуляции основано на консервативности структуры РНК, включающей псевдоузел, и позиционную связь этой структуры с участком регуляторных кодонов и сайтом связывания рибосомы перед кодирующей областью leuA.
Работа выполнена за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 14-50-00150).
Литература
1. Das A., Crawford I.P., Yanofsky C. Regulation of tryptophan operon expression by attenuation in cell-free extracts of Escherichia coli // Journal of Biological Chemistry, 1982, vol. 257, no. 15, pp. 8795-8798.
2. Heery D.M., Dunican L.K. Cloning of the trp gene cluster from a tryptophan hyperproducing strain of Corynebacterium glutamicum: Identification of a mutation in the trp leader sequence // Applied and Environmental Microbiology, 1993, vol. 59, no. 3, pp. 791-799.
3. Lin C., Paradkar A.S., Vining L.C. Regulation of an anthranilate synthase gene in Streptomyces venezuelae by a trp attenuator // Microbiology, 1998. , vol. 144, no. 7, pp. 1971-1980.
4. Seliverstov A.V., Putzer H., Gelfand M.S., Lyubetsky V.A. Comparative analysis of RNA regulatory elements of amino acid metabolism genes in Actinobacteria // BMC Microbiology, 2005, vol. 5, no. 54.
5. Лопатовская К.В., Селиверстов А.В., Любецкий В.А. Аттенюаторная регуляция оперонов биосинтеза аминокислот и аминоацил-тРНК у бактерий: сравнительный геномный анализ // Молекулярная биология, 2010, том 44, № 1, стр. 140-151.
6. Lyubetsky V.A., Korolev S.A., Seliverstov A.V., Zverkov O.A., Rubanov L.I. Gene expression regulation of the PF00480 or PF14340 domain proteins suggests their involvement in sulfur metabolism // Computational Biology and Chemistry, 2014, vol. 49, pp. 7-13.
7. Lyubetsky V.A., Pirogov S.A., Rubanov L.I., Seliverstov A.V. Modeling classic attenuation regulation of gene expression in bacteria, Journal of Bioinformatics and Computational Biology, 2007, vol. 5, no. 1, pp. 155-180.
8. Spraggon G., Kim C., Nguyen-Huu X., Yee M.C., Yanofsky C., Mills S.E. The structures of anthranilate synthase of Serratia marcescens crystallized in the presence of (i) its substrates, chorismate and glutamine, and a product, glutamate, and (ii) its end-product inhibitor, L-tryptophan // Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, vol. 98, pp. 6021-6026.
9. Finn R.D., Bateman A., Clements J., Coggill P., Eberhardt R.Y., Eddy S.R., Heger A., Hetherington K., Holm L., Mistry J., Sonnhammer E.L.L., Tate J., Punta M. The Pfam protein families database // Nucleic Acids Research, 2014, Database Issue 42, pp. D222-D230.
10. Lyubetsky V.A., Korolev S.A., Seliverstov A.V., Zverkov O.A., Rubanov L.I. Gene expression regulation of the PF00480 or PF14340 domain proteins suggests their involvement in sulfur metabolism // Computational Biology and Chemistry, 2014, vol. 49, pp. 7-13.
11. Chastain M., Tinoco I.Jr. Poly(rA) binds poly(rG) poly(rC) to form a triple helix // Nucleic Acids Res., 1992, vol. 20, no. 2, pp. 315-318.
12. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Наука. 2000.
13. Semerad C.L., Maher L.J. Exclusion of RNA strands from a purine motif triple helix // Nucleic Acids Res., 1994, vol., 22, no. 24, pp. 5321-5325.
14. Carmona P., Molina M. Binding of oligonucleotides to a viral hairpin forming RNA triplexes with parallel G*GC triplets / / Nucleic Acids Res., 2002, vol. 30, no. 6, pp. 1333-1337.
15. Klinck R., Guitteta E., Liquier J., Taillandier E., Gouyetteb C., Huynh-Dinhby T. Spectroscopic evidence for an intramolecular RNA triple helix // FEBS Lett., 1994, vol. 355, pp. 297-300.
16. Holland J.A., Hoffman D.W. Structural features and stability of an RNA triple helix in solution // Nucleic Acids Res., 1996, vol. 24, no. 14, pp. 2841-2848.
17. Isambert H., Siggia E.D. Modeling RNA folding paths with pseudoknots: application to hepatitis delta virus ribozyme // Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 2000, vol. 97, no. 12, pp. 6515-6520.
