CC BY
14
Зверков О.А.1, Селиверстов А.В.2, Любецкий В.А.3
*ИППИ РАН, г. Москва, к.ф.-м.н., н.с., zverkov@ iitp . ru 2ИППИ РАН, г. Москва,к.ф.-м.н., в.н.с., slvstv@iitp . ru 3ИППИ РАН, г. Москва, д.ф.-м.н., зав.лаб., lyubetsk@iitp . ru
О ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРАХ, КОДИРУЕМЫХ В ПЛАСТИДАХ
РОДОФИТНОЙ ВЕТВИ
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Пластида, белок, транскрипционный фактор, кластеризация. АННОТАЦИЯ
Расширена ранее полученная кластеризация белков, кодируемых в пластидах родофитной ветви. Результаты представлены в общедоступной базе данных по адресу http://lab6.iitp.ru/ppc/redline67. База данных позволяет проводить быстрый поиск кластера (семейства белков) как по фрагменту аминокислотной последовательности одного из белков, так и по филогенетическому профилю белка. На этой основе нами предсказаны регулоны транскрипционных факторов Ycf28, Ycf29 и Ycf30, кодируемых в пластидах.
Быстрый рост числа секвенированных геномов пластид позволяет развить предположения об эволюции и регуляции этих геномов не только у водорослей, но и у нефотосинтезирующих видов простейших, содержащих пластиды. Среди последних возбудители опасных протозойных инфекций, таких как малярия и токсоплазмоз. Именно пластиды являются одной из эффективных мишеней для терапевтического воздействия и для получения невирулентных штаммов с целью быстрого создания вакцин.
Все известные пластиды происходят от цианобактерий. Выделяют три ветви первичных пластид с независимым происхождением, которые представлены зелёными водорослями и растениями, Cyanophora paradoxa и багрянками. Однако многие далёкие от перечисленных виды имеют вторичные или третичные пластиды, происходящие от первичных пластид. В этой работе мы ограничимся исследованием пластид родофитной ветви, имеющих общее происхождение с пластидами багрянок.
Весной 2015 года были опубликованы четыре новых генома пластид из родофитной ветви: Lepidodinium chlorophorum (класс Dinophyceae, GenBank: NC_027093, дата 14.05.2015), Choreocolax polysiphoniae (отдел Rhodophyta, GenBank: NC_026522, дата 27.03.2015), Vertebrata lanosa (отдел Rhodophyta, GenBank: NC_026523, дата 27.03.2015) и Trachydiscus minutus (отдел Eustigmatophyceae, GenBank: NC_026851, дата 22.04.2015). В пластиде Choreocolax polysiphoniae кодируются, в частности, некоторые гены путей синтеза триптофана и разветвлённых аминокислот, а также гены метаболизма жирных кислот. Однако генов фотосистем нет. Поэтому он существенно отличается от других багрянок.
Для кластеризации белков применён метод, описанный в [1] и успешно апробированный в серии работ [2-4]. Для визуализации кластеров (семейств белков) использована программа sfdp из пакета Graphviz [5]. Поиск промоторов осуществлён оригинальным алгоритмом, основанном на консервативности известных промоторов [6-7] и экспериментальных данных о влиянии нуклеотидных замен на эффективность инициации транскрипции РНК-полимеразой бактериального типа [8].
Нами выполнена кластеризация белков, кодируемых в пластидах родофитной ветви. Результаты представлены в общедоступной базе данных по адресу http://lab6.iitp.ru/ppc/redline67. База данных позволяет проводить быстрый поиск кластера как по фрагменту аминокислотной последовательности одного из белков, так и по филогенетическому профилю. Четыре добавленных протеома содержат в сумме 462 белка, что увеличивает общее число белков до 8940. Число синглетонов равно 259; число кластеров равно 294.
Ii III 1 1 .lll 111.........i.i .il 1 ill 1 1.1.1
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 +3 45 47 49 51 53 55 57 59 51 53 65 67
Рис.1. Зависимость числа кластеров белков от числа представленных видов водорослей
Зависимость числа кластеров белков от числа представленных видов показано на рисунке 1. Специфичными для всех пластид рассмотренных видов из отдела Rhodophyta (багрянок) являются гены odpA/pdhA, odpB/pdhB, trpA, trpG, tilS/ycf62 и infC.
На рисунке 2 показан граф, вершины которого соответствуют белкам, а рёбра соединяют белки, связанные взаимными хитами (BBH) BLAST^ (E<10-5). За редким исключением кластеры отлично разделяются выделением компонент связности. При этом многие из них удивительно плотные. Выделяются следующие пары и одна тройка близких по последовательности белков: PsaA + PsaB, PsbA + PsbD, PsbB + PsbC + синглетон Orf157, AtpA + AtpB, PetJ + PetV, ApcA + ApcD, ApcB + ApcF, CpeA + CpcA, CpcB + CpeB, CpcG + ApcE, TrpG + CarA, TufA + InfB. Здесь каждая сумма означает связный подграф, большинство вершин которого соответствуют одному из указанных типов белков. Параметры кластеризации выбираются так, чтобы указанные подграфы разделились в соответствии с аннотацией белков.
В целом распределение по кластерам белков, кодируемых в пластидах багрянок, показывает значительное отличие Porphyridium purpureum от остальных видов, что сопровождается многочисленными перестройками ДНК пластид этих водорослей, а также значительное обособление клады из трёх видов Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium и Cyanidioschyzon merolae.
По сравнению с нашими предыдущими результатами кластеры белков MoeB и Ycf28 одновременно пополнились белками, кодируемыми в пластидах Vertebrata lanosa, у Choreocolax polysiphoniae и всех рассмотренных видов вне отдела Rhodophyta ни один из этих белков не кодируется в пластидах. Так подтверждено ранее отмеченное нами совпадение филогенетических профилей этих белков [4].
Белок Ycf28 имеет значительное сходство с транскрипционным фактором NtcA цианобактерий. Поэтому мы предполагаем, что именно Ycf28 регулирует в пластидах транскрипцию гена moeB, связывая ДНК вблизи промотора, где нами предсказан консервативный мотив. При этом нет оснований считать, что Ycf28 связан с метаболизмом азота, то есть по сравнению с цианобактериями произошла смена специфичности транскрипционного фактора к субстрату. Отсутствие типичного -35 бокса промотора перед геном moeB, говорит о том, что Ycf28 является активатором транскрипции.
фффффф
шл *
• •
ш
Рис.2. Компоненты связности графа белков в пластидах родофитной ветви
Транскрипционный регулятор Ycf29 кодируется в пластидах криптофитовых водорослей и багрянок кроме Porphyridium purpureum. Дерево Ycf29, построенное по выравниванию белков, показано на рисунке 3. Визуализация скобочной структуры выполнена программой TreeView 1.6.6 [9]. Другого белка с таким филогенетическим профилем не найдено. Близкий профиль имеет белок CemA, который есть у Porphyridium purpureum, но отсутствует у Choreocolax polysiphoniae. Белок CemA содержит домен PF03040 и найден на внутренней стороне наружной мембраны хлоропластов, но не в тилакоидной мембране. Ортологичные CemA белки у цианобактерий вовлечены в транспорт углекислого газа, но сами не являются транспортёрами [10]. Другой белок с близким филогенетическим профилем - это мембранный белок Ycf19. Перед геном ycf19 предсказан консервативный промотор бактериального типа, близкий к консенсусу. С другой стороны, присутствие Ycf29 у нефотосинтезирующих видов Cryptomonas paramecium и Choreocolax polysiphoniae свидетельствует о том, что он регулирует процессы, не связанные с фотосинтезом. Поскольку Ycf29 входит в двухкомпонентную систему передачи сигнала, его регулон связан с реакцией на изменения внешних условий, а не внутри пластиды.
Известно, что в пластидах многих видов водорослей кодируется транскрипционный фактор Ycf30, регулирующий экспрессию генов rbcLS, кодирующих субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (КФ 4.1.1.39), и гена cbbX. Экспериментально показана индуцируемая светом активация транскрипции этих генов в изолированных Cyanidioschyzon merolae и предсказан сайт связывания фактора Ycf30 в пластидах багрянок [11]. Построенные нами филогенетические профили этих белков согласуются с этими предсказаниями. Однако низкая консервативность сайта связывания Ycf30 не позволила точно предсказать его положение на ДНК.
— Cyanidium caldarium
-Guillardia thêta
-Cryptomonas Paramecium
— Cyanidioschyzon merolae Rhodomonas salina
Galdieria sutphuraria
Porphyra purpurea
Pyropia yezoensis
Pyropia haitanensis
к
-Pyropia perforata
- Calliarthron tuberculosum Gracilaria tenuistipitata Gracilaria salicornia Ch on drus crispus Grateloupia taiwanensis
И
Vertebrata lanosa
Choreocolax potysiphoniae
0.1
Рис.3. Дерево факторов Ycf29
Ген ftsH (синоним ycf25) кодирует АТФ-зависимую протеазу, содержащую цинк и предположительно участвующую в клеточном делении. Ортологичные гены широко распространены у прокариот [12]. У бактерии Oenococcus oeni белок FtsH важен для защиты от теплового или осмотического стрессов [13].
У видов из группы Stramenopiles: золотисто-бурая водоросль Heterosigma akashiwo, жёлто-зелёная Vaucheria litorea и бурые водоросли Ectocarpus siliculosus, Fucus vesiculosus и Saccharina japonica нами выполнено выравнивание 5'-лидерных областей генов ftsH. Предсказан консервативный промотор, типичный для РНК-полимераз бактериального типа. Это хорошо согласуется с близким филогенетическим положением пластид этих видов.
Дадим подробное описание предсказанных промоторов генов ftsH. -35 бокс промотора имеет нуклеотидный состав TTGTAT у H. akashiwo и TTGTTT у V. litorea, E. siliculosus, F. vesiculosus и S. japonica. -10 бокс во всех случаях имеет 5'-расширение TG. Консенсус этого бокса TGnTAnwwA, где w обозначает любой из двух нуклеотидов T или A. Транскрипция предположительно начинается в позициях -41, -33, -29, -22 и -29 соответственно. Эти промоторы показаны на рисунке 4. Нуклеотидный состав наиболее консервативных позиций соответствует экспериментальным данным о влиянии мутаций на эффективность инициации транскрипции РНК-полимеразой бактериального типа [8].
Heterosigma akashiwo AGTTGTATAAAAAG ATTTT - ТС ATGTTATATATAATTTAA -41
Ectocarpus siliculosus GGTTGTTTATTAAGATAAT-AAATGTTAATAATACTTTAT -29
Saccharina japónica agttgttttttactctgat-atgtgttaataatactatat -29
Рис.4. Промоторы перед генами ftsH. Выделены -35 и -10 боксы и 5'-расширение последнего. Справа указаны позиции потенциального сайта инициации транскрипции относительно инициирующего кодона
Менее консервативные потенциальные промоторы перед геном ftsH предсказаны и у других водорослей. Кроме перечисленных случаев промоторы бактериального типа с 5'-расширением -10 бокса предсказаны у Porphyra purpurea, Pyropia yezoensis, Pyropia haitanensis, Cyanidium caldarium, Gracilaria tenuistipitata, Rhodomonas salina, Odontella sinensis, Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira oceanica, Synedra acus, Durinskia baltica и Kryptoperidinium foliaceum. Напомним, что хотя две последние водоросли принадлежат надтипу Alveolata, их пластиды имеют третичное происхождение от пластид диатомовых водорослей [14]. Промоторы без 5'-расширения -10 бокса предсказаны у Cyanidioschyzon merolae, Fistulifera sp. JPCC DA0580 и Phaeodactylum tricornutum. У Nannochloropsis spp., Porphyridium purpureum и Guillardia theta определить промотор не удалось. Выделить консервативный сайт связывания какого-либо транскрипционного фактора вблизи промоторов также не удалось, что позволяет предполагать регуляцию экспрессии гена ftsH на каком-то другом уровне. Гены ftsH отсутствуют у представителей отделов Apicomplexa и Chromerida, классов Haptophyceae и Pelagophyceae, а также у нефотосинтезирующей
Vaucheria litorea
TATTGTTTTTGTAATTAATTTTATGGTACTTAAAAAAATA -33
Fucus vesiculosus
GTTTGTTTTTTAATACATT-ATATGTTAATAATAATATTA -22
криптофитовой водоросли Cryptomonas paramecium.
Работа выполнена за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 14-50-00150).
Литература
1. Любецкий В.А., Селиверстов А.В., Зверков О.А. Построение разделяющих паралоги семейств гомологичных белков, кодируемых в пластидах цветковых растений // Математическая биология и биоинформатика. 2013. Т. 8, № 1. С. 225-233.
2. Зверков О.А., Селиверстов А.В., Любецкий В.А. Белковые семейства, специфичные для пластомов небольших таксономических групп водорослей и простейших // Молекулярная биология. 2012. Т. 46, № 5. С. 799-809.
3. Lyubetsky V., Seliverstov A., Zverkov O. Transcription regulation of plastid genes involved in sulfate transport in Viridiplantae // BioMed Research International. 2013. V. 2013. Article ID 413450. 6 p.
4. Zverkov O.A., Seliverstov A.V., Lyubetsky V.A. A database of plastid protein families from red algae and Apicomplexa and expression regulation of the moeB gene // BioMed Research International. 2015. V. 2015. Article ID 510598, 5 p.
5. Yifan Hu. Efficient high-quality force-directed graph drawing // The Mathematica Journal. 2006. V. 10, № 1. P. 37-71.
6. Селиверстов А.В., Лысенко Е.А., Любецкий В.А. Быстрая эволюция промоторов пластомных генов ndhF у цветковых растений // Физиология растений. 2009. Т. 56, № 6. С. 926-934.
7. Lyubetsky V., Rubanov L., Seliverstov A. Lack of conservation of bacterial type promoters in plastids of Streptophyta // Biology Direct. 2010. V. 5, № 34. 11 p.
8. Homann A., Link G. DNA-binding and transcription characteristics of three cloned sigma factors from mustard (Sinapis alba L.) suggest overlapping and distinct roles in plastid gene expression // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270, № 6. P. 12881300.
9. Page R.D.M. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers // Computer Applications in the Biosciences. 1996. V. 12. P. 357-358.
10. Katoh A., Lee K.S., Fukuzawa H., Ohyama K., Ogawa T. cemA homologue essential to CO2 transport in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803 // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 4006-4010.
11. Minoda A., Weber A.P., Tanaka K., Miyagishima S.Y. Nucleus-independent control of the rubisco operon by the plastid-encoded transcription factor Ycf30 in the red alga Cyanidioschyzon merolae // Plant Physiol. 2010. V. 154, № 3. P. 15321540.
12. Herman C., Prakash S., Lu C.Z., Matouschek A., Gross C.A. Lack of a robust unfoldase activity confers a unique level of substrate specificity to the universal AAA protease FtsH // Mol Cell. 2003. V. 11, P. 659-669.
13. Bourdineaud J.P., Nehme B., Tesse S., Lonvaud-Funel A. The ftsH gene of the wine bacterium Oenococcus oeni is involved in protection against environmental stress // Appl Environ Microbiol. 2003. V. 69. P. 2512-2520.
14. Imanian B., Pombert J.F., Keeling P.J. The complete plastid genomes of the two 'dinotoms' Durinskia baltica and Kryptoperidinium foliaceum // PLoS ONE. 2010. V. 5, № 5. Article E10711.
