CC BY
40Биофизика
кислотный гемолиз эритроцитов куриного эмбриона
HEMOLYSIS OF CHIKEN EMBRYO RED BLOOD CELLS BY ACID ACTION
А. А. Мищенко, Е. А. Лебедева
A. A. Mischenko, E. A. Lebedeva
Проведены исследования кислотной устойчивости эритроцитов 10— 12-дневнък эмбрионов кур Gallus gallus. Показана более высокая резистентность таких эритроцитов по сравнению с эритроцитами человека. Замена Na+ в инкубационной среде на эквимолярное количество холина+ не изменяет резистентность эритроцитов человека, но вызывает повышение резистентности эритроцитов куриного эмбриона. Степень изменений зависит от соотношения Na+ и холина.
Acid resistance of 10—12 day Gallus gallus chicken embryos erythrocytes was investigated. It was demonstrated the increased resistance of chicken erythrocytes relatively human erythrocytes. The chicken embryos erythrocytes resistance was increased by the replacement of Na+ with choline+ in the incubation medium. That increasing was dependent on choline+ — Na+ relation.
Ключевые слова: эритроцит, куриный эмбрион, кислотный гемолиз, Na+/И+-обмен.
Key words: erythrocyte, chicken embryo, acid hemolysis, Na+/H+-exchange.
введение
Формирование функций органов и тканей в ходе онтогенеза — важная часть исследований сравнительной, эволюционной физиологии и эмбриологии. ядерные эритроциты позвоночных животных содержат набор характерных для эукариотических клеток органелл. В этом аспекте эритроциты птиц вызывают интерес как развивающаяся параллельно эритроцитам млекопитающих ветвь кислород-транспортной системы крови.
Мембрана эритроцитов кур содержит анион-транспортную систему, подобную анион-транспортной системе млекопитающих по рН-зависимости, температурной зависимости, чувствительности к ингибиторам [10]. Тем не менее, транспорт катионов в такие эритроциты имеет свои особенности и зависит, в частности, от дыхания клеток [7]. Более крупные размеры клеток сказываются на транспорте газов через эритроцитарную мембрану [13].
Формирование ядерных эритроцитов птиц в онтогенезе также характеризуется рядом особенностей. В крови высокая активность этих клеток сохраняется вплоть до момента, когда концентрация гемоглобина достигает 1/3 его содержания у вылупляющегося птенца. В течение 6 дней эмбрионального развития происходит замещение первичных (primitive) клеток дефинитивными [6].
Большую роль в эмбриональном гемопоэзе играет не только печень, но и сосудистые островки кроветворения [16].
Несмотря на более чем столетний период исследований эритроцитов куриных эмбрионов в знаниях об этих клетках еще есть пробелы. Отсутствуют данные по кислотной резистентности этих клеток. Вместе с тем, метод кислотного гемолиза, будучи простым и чувствительным инструментом оценки свойств эритроцитарной мембраны, может дать ценную информацию об ее физико-химических свойствах.
Объекты и методы исследований
В экспериментах использованы эритроциты крови декапитированных куриных эмбрионов 10—12 дневного возраста массой 5.0 ± 0.6 г. Образцы крови были любезно предоставлены Лабораторией физиологии сердца Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. Для сравнительной оценки резистентности таких эритроцитов проведены также исследования на эритроцитах крови человека, взятой на Республиканской станции переливания крови (г. Сыктывкар). Для выделения клеток кровь центрифугировали в режиме 3 тыс. об/мин, надоса-дочный слой жидкости с лейкоцитами удаляли. К оставшемуся плотному осадку эритроцитов добавляли изотонический 0.9 % раствор NaCl (pH 7.4) с последующим центрифугированием при том же режиме. После трехкратной отмывки клетки ресуспендировали в изотоническом растворе NaCl, оптическая плотность приготовленной суспензии составляла 0.7 ед.
Гемолиз проводили в двух вариантах: а) буферным раствором по Макилвейну (состав 0.31 г/л Na2HPO4 и 1.87 г/л лимонной кислоты, рН=2.5); б) 0.1 н раствором соляной кислоты.
Кислотный гемолиз буфером по Макилвейну проводили методом, предложенным И. И. Гительзон и И. А. Терсковым [2], гемолиз соляной кислотой вызывали методом, взятым из работы М. А. Артюкова с соавторами [1]. Оптическую плотность суспензии после добавления гемолитика регистрировали каждые 20 с на фотоэлектроколориметре КФК 2 при длине волны X = 540 нм.
Серия экспериментов проведена с использованием изотонического, 145 мМоль, раствора холинхлорида (MSDS, China).
Все эксперименты проведены при комнатной температуре 18—22 °С. Результаты обрабатывали методом парных и непарных сравнений, достоверность различий оценивали по критерию Ван дер Вардена [3].
Результаты
Данные по гемолизу буферным раствором по Макилвейну приведены на рис. 1 (n = 5). В таких экспериментах полученные результаты не зависят от буферных свойств цитоплазмы эритроцитов.
Параметры кислотного гемолиза эритроцитов человека согласуются с литературными данными [2]. Разрушение клеток начинается со 2-й мин., заканчивается в течение 3.5 — 4 мин. В течение 170 с лизируется 50 % клеток.
О 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Рис. 1. Кислотный гемолиз эритроцитов человека (1) и куриного эмбриона (2) в буфере
по Макилвейну (рН 2.6) Ось абсцисс — время, с.; ось ординат — величина оптической плотности суспензии
Гемолитическая стойкость эритроцитов куриного эмбриона выше. Начало гемолиза приходится на 260 ± 15 с. Таким образом, длительность лаг-фазы увеличена в 2 раза по сравнению с эритроцитами человека (р < 0.05). Процесс разрушения клеток завершается к 6-й мин., 50 % клеток лизируется в течение 320 ± 15 с. В целом эритроциты куриного эмбриона демонстрируют в 2 раза более высокую резистентность по сравнению с эритроцитами человека. Кроме того, остается высоким конечное значение оптической плотности после полного гемолиза эритроцитов куриного эмбриона.
Использование в качестве гемолитика соляной кислоты (0.1 н) вместо буферного раствора не меняет общей картины гемолитической устойчивости клеток (рис. 2, п = 6). Резистентность эритроцитов куриных эмбрионов в этих экспе-
0,3
о
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Рис. 2. Кислотный гемолиз эритроцитов человека (1) и куриного эмбриона (2) Клетки трехкратно отмыты в изотоническом растворе КаС1. А — эксперименты с КаС1,
Б — эксперименты с холинхлоридом
риментах также в 2 раза выше резистентности эритроцитов человека. Величина оптической плотности после завершения гемолиза в 5 раз выше, чем в суспензии с эритроцитами человека.
Замена хлорида натрия на холинхлорид не влияет на резистентность эритроцитов человека и приводит к увеличению резистентности эритроцитов куриных эмбрионов (рис. 2). В частности, время начала гемолиза увеличивается на 16 % (р < 0.05) (с 240 ± 10 с до 280 ± 15 с), время окончания - на 21% (р < 0.05) (с 330 ± 20 с до 400 ± 20 с). Продолжительность гемолиза 50 % клеток также сдвигается с 270 к 320 с. Действие холинхлорида носит концентрационно-зави-симый характер: резистентность клеток возрастает при увеличении доли холинхлорида в изотонической смеси холинхлорида и №С1 (рис. 3, п = 4).
0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3
о
Рис. 3. Кислотная резистентность эритроцитов куриного эмбриона при разных объемных соотношениях изотоничесих растворов холинхлорида и КаС1 Ось абсцисс — время, с.; ось ординат — оптическая плотность эритроцитарной суспензии. 1 — раствор холинхлорида; 2 — смесь растворов холинхлорида и КаС1 9:1; 3 — смесь
растворов холинхлорида и КаС1 1:9.
Обсуждение
В работе представлены данные по кислотной резистентности эритроцитов 10—12-дневных куриных эмбрионов. К основным особенностям эритроцитов немлекопитающих следует отнести наличие ядра и органелл. Согласно данным [13] на долю ядра в эритроцитах кур может приходиться 22 % внутриклеточного объема эритроцитов. С этим может быть связан тот факт, что оптическая плотность гемолизированных эритроцитов куриного эмбриона остается высокой по сравнению с гемолизатом эритроцитов человека. Мы полагаем, что воздействие гемолитика на хроматин ядра приводит к его деконденсации и набуханию с последующим повышением оптической плотности.
Суммарная концентрация катионов в плазме крови кур в среднем на 30 ммоль выше, чем у млекопитающих. Основные различия касаются ионов Са, К [11]. Тем не менее, эксперименты с гемолизом эритроцитов проводились
при одинаковых концентрациях NaCl (или холинхлорида), изотоничных содержимому клеток млекопитающих (300 мосмоль). При условии, что клетки ведут себя как линейный осмометр, сравнительно небольшое увеличение объема ядерных эритроцитов в этих условиях (порядка 10 %) не снижает их кислотной устойчивости.
Одним из ключевых, запускающих гемолиз событий, является опосредуемый анионным обменником вход в клетку Н+ [9]. Часть поступивших Н+ удаляется во внеклеточную среду за счет активации №+/Н+-обмена. Поскольку активность этого антипорта может быть достаточно высока в ядерных эритроцитах [5, 12], мы провели эксперименты с блокадой Na/H-обмена, заменив NaCl эквимолярным количеством холинхлорида. При высокой активности антипорта можно было ожидать снижения резистентности эритроцитов в этих условиях. Однако параметры резистентности ядерных эритроцитов увеличились. В то же время эритроциты человека не отреагировали на подобную замену внеклеточной среды. Результаты этих экспериментов показали, что №+/Н+-обмен не может быть причиной высокой кислотной резистентности эритроцитов куриных эмбрионов.
Высокая устойчивость эритроцитов куриного эмбриона по сравнению с эритроцитами человека может объясняться разными соотношениями площади поверхности к объему у этих клеток. Площадь поверхности двояковогнутых безъядерных эритроцитов млекопитающих составляет около 145 мкм2 при объеме клетки 86 мкм3 [15]. Следовательно, соотношение площадь—объем равно 1.7. Эритроциты куриного эмбриона в течение 7-дневного периода развития уменьшаются в объеме от 600 мкм3 до 160—200 мкм3 [14]. Если рассматривать эритроцит кур как эллипсоид вращения, то при соотношении длинной и короткой полуосей 5 мкм и 4 мкм соответственно рассчитанное значение площади поверхности составляет 235 мкм2. Соотношение площадь—объем близко к единице. Альтернативный вариант расчетов [10] сделан для эритроцита сферической формы, поэтому завышен (290 мкм2). Следует также учесть, что плотность ани-онообменника в мембране эритроцита человека (8300 копий /мкм2) в 3 раза выше, чем в мембране эритроцита кур (2760 копий /мкм2) [10]. Следовательно, количество анионообменника составит 1.2*106 копий на один эритроцит человека и 6.3*105 копий на один эритроцит куриного эмбриона. Это значит, что потенциальная способность мембраны эритроцитов человека переносить Н+ в 2 раза выше, чем у ядерных эритроцитов куриного эмбриона, что хорошо согласуется с полученными нами данными о 2-х кратной более высокой устойчивости последних. Более низкая проницаемость мембраны ядерных эритроцитов к молекулам воды [4] так же может незначительно увеличить их резистентность, снижая степень осмотического стресса клеток.
Вопрос о влиянии холинхлорида на кислотную устойчивость эритроцитов куриного эмбриона остается открытым. В эритроцитарной мембране млекопитающих имеется транспорная система для холина, функция которой неясна [8]. Такой обменник способен переносить не только холин, но и катионы Cs, Rh, Li и в особенности Mg2+. Это не анионный обменник, он не блокируется стильбе-новыми производными SITS, DIDS. Аналогичный транспорт найден у эритро-
цитов кур. Его активность, высокая у однодневных эмбрионов, затем снижается по мере развития цыпленка [7]. При сравнительно большом объеме таких эритроцитов выход катионов в среду с холинхлоридом мог бы компенсировать набухание и осмотический шок клеток на начальных стадиях гемолиза.
Авторы выражают благодарность коллективу группы биопейсмекеров под руководством В. А. Головко за предоставленный для работы материал крови куриных эмбрионов.
* * *
1. Артюков М. А., Наквасина С. Г., Резван О. В., Башарина Г. А., Вашанов В. Г. Практикум по биофизике. Владивосток: Изд. ВГУ, 2001. 152 с.
2. Гительзон И. И., Терсков И. А. Эритрограммы как метод клинического исследования крови: учеб. пособие. Красноярск: Изд-во Сибирского отд. АН СССР, 1959. 247 с.
3. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
4. Brahm J., Wieth J. O. Separate pathways for urea and water, and for chloride in chicken erythrocytes // J. Physiol. 1977. Vol. 266. P. 727-749.
5. Cala P. M., Maldonado H. M. pH regulatory Na/H exchange by Amphiuma red blood cells // J. Gen. Physiol. 1994. Vol. 103. P. 1035-1053.
6. Dawson A. D. Some observation on the primitive and definitive erythrocytes of the developing chick // Z. Zellforsch. 1936. № 24. P. 256-268.
7. Drew C., Lapaix F., Egee S., Thomas S., Ellory J. C., Staines H. M. Age-dependent changes in cation transport in the chicken erythrocyte // Comp. Biochem. Physiol. a Mol. Integr. Physiol. 2002. Vol. 133. P. 169-178.
8. Ebel H., Hollstein M., Gunteer T. Role of the choline exchanger in Na+ -independent Mg2+ efflux from rat erythrocytes // Biochem. et Biophys. Acta. 2002. Vol. 1559. P. 135-144.
9. Ivanov I. T. Low pH-induced hemolysis of erythrocytes is related to entry of the acid into cytosole and oxidative stress on cellular membranes // Biochim. et Biophys. Acta. 1999. Vol. 1415. P. 349-360.
10. Jay D. G. Characterization of the chicken erythrocyte anion exchange protein // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 9431-9436.
11. Morgan V. E., Chichester D. F. Properties of the blood of the domestic fowl // J. Biol. Chem. 1935. Vol. 110. P. 285-298.
12. Motais R., Borgese F., Fievet B., Garcia-Romeu F. Regulation of Na+/H+ exchange and ph in erythrocytes of fish // Comp. Biochem. and Physiol. Part A: Physiology. 1992. Vol. 102 (Pt. 2). P. 597-602.
13. Nguyen Phu D., Yamaguchi K., Scheid P., Pliper J. Kinetics of oxygen uptake and release by red blood cells of chicken and duck // J. exp. Biol. 1986. Vol. 125. P. 15-36.
14. O'Connor R. J. Growth and differentiation in the red blood cells of the chicken embryo // J. Anat. 1952. Vol. 86 (Pt. 3). P. 320-325.
15. Uzoigwe C. The human erythrocyte has developed the biconcave disc shape to optimise the flow properties of the blood in the large vessels // Medical. Hypotheses. 2006. Vol. 67. P. 1159-1163.
16. Wong G. K., Cavey M. J. Development of the liver in the chicken embryo. II. Erythropoietic and granulopoietic cells // Anat. Rec. 1993. P. 131-143.
