CC BY
124Биофизика
ГЕМОЛИЗ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭТИЛОВОГО СПИРТА И АЦЕТОНА
HUMAN ERYTHROCYTE HEMOLYSIS BY ETHANOL AND ACETONE ACTION
А А. Мищенко, ЕЛ. Стенина
A A. Mischenko, EA. Styenina
Для оценки роли билипидного матрикса мембраны в резистентности эритроцитов к различным липофильным факторам проведены исследования гемолиза эритроцитов при действии этанола и ацетона. Параметры гемолиза зависят от использованной объемной доли веществ. Действие ацетона более выражено, что отражается преимущественно на времени окончания и скорости гемолиза.
Hemolysis of red blood cells was investigated by ethanol and acetone action. The aim of the studies was to evaluate the importance of lipid for the erythrocyte resistance to different lipophilic factors. The hemolysis parameters were dependent on the volume fraction of ethanol and acetone. Acetone effects were more strongly which affected the end-time and hemolysis rate.
Ключевые слова: эритроцит, гемолиз, липиды мембраны.
Keywords: erythrocyte, hemolysis, membrane lipides.
Введение
Индуцированный гемолиз - один из стандартных способов оценки состояния эритроцитов по их устойчивости к внешним воздействиям. Если кислотный гемолиз - это широко используемый способ исследования эритроцитов и их мембран [1, 2], то данных по индуцированному гемолизу под влиянием других веществ гораздо меньше, в частности он зависит от фазового состояния мембраны [3]. Основной мишенью при кислотном гемолизе являются мембранные белки. В данной работе проведены исследования гемолиза при действии активных в отношении мембранных липидов этанола и ацетона.
Результаты исследования могут способствовать пониманию механизмов гемолиза эритроцитов при действии органических и неорганических токсинов и расширить диапазон методов, при помощи которых можно исследовать эритроциты в целом и эритроцитарную мембрану в частности.
104
Объекты и методы исследований
Объект исследования - эритроциты крови мужчин-доноров в возрасте 20^40 лет. Кровь брали на Республиканской станции переливания крови г. Сыктывкара.
Эритроциты центрифугировали (3 тыс. об/мин, 10 мин) и трехкратно отмывали в 0.9 % NaCl (pH 7.4). Для гемолиза готовили суспензию эритроцитов с оптической плотностью 0.7 при длине волны X = 540 нм. Оптическую плотность суспензии регистрировали на фотоколориметре КФК-2.
Кислотный гемолиз проводили по методу Терскова и Гительзона [1]. Для нивелирования возможной зависимости параметров гемолиза от индивидуальных буферных характеристик эритроцитов в качестве гемолитика использовали буферный раствор, по Макилвейну (состав 0.31 г/л Na2HP04 и 1.87 г/л лимонной кислоты pH = 2.5). Гемолиз индуцировали, смешивая по 2 мл эритроцитарной суспензии и гемолитика. Регистрацию оптической плотности D суспензии проводили каждые 20 с.
Аналогичным способом проводили гемолиз органическими веществами -ацетоном и этиловым спиртом в объемных долях 40 %; 45 %; 50 %; 55 %.
Осмотическое давление всех растворов поддерживалось на уровне 300 мОсмоль добавлением соответствующего количества NaCl.
Оптическую плотность регистрировали каждую минуту или через 20 с при действии гемолитиков в объемных долях 0.4—0.45 и 0.5-0.55 соответственно.
Все эксперименты проведены при температуре раствора 18-20° С. Результаты обрабатывали методом парных и непарных сравнений, достоверность различий оценивали по критерию Вилкоксона.
Результаты
Кислотный гемолиз
При кислотном гемолизе под влиянием буфера кривая гемолиза имеет классическую S-образную форму (рис. 1; п = 15).
Рис. 1. Кислотный гемолиз эритроцитов буферо, по Макилвейну.
Ось ординат — оптическая плотность D; ось абсцисс — время, с
105
Гемолиз начинается с 2.6 мин, заканчивается к 5 мин. Между 3.6 мин и 4 мин происходит разрушение половины эритроцитов (ti/2 =3.8 мин). Средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до окончания разрушения эритроцитов составила 0.09 едБ/мин. Максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов составила 0.126 едР/мин и приходилась на 3.8 мин гемолиза.
Средняя скорость разрушения эритроцитов на промежутке между 3 мин и 4.3 мин составила 0.093 едР/мин.
Гемолиз ацетоном
Данные при добавлении ацетона представлены на рис. 2 (п = 12).
При добавлении ацетона в объемной доле 0.4 время начала гемолиза составило 12 мин, его окончание к 19 мин. Средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до окончания разрушения эритроцитов составила 0.059 ед.П/мин. Между 16 мин и 17 мин происходит разрушение половины эритроцитов (ti/2 =16.5 мин). Максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов составила 0.11 едР/мин и приходилась на 15 мин гемолиза. Средняя скорость разрушения эритроцитов на промежутке между 11 мин и 18 мин составила 0.046 едЛ/мин.
Рис. 2. Гемолиз эритроцитов в присутствии ацетона в объемных долях 0.4-0.55.
По оси абсцисс — время (мин), по оси ординат — относительная доля интактных эритроцитов
При объемной доле ацетона 0.45 параметры гемолиза изменяются следующим образом: время начала и окончания гемолиза уменьшаются соответственно в 2.4 раза и на 43 % (р < 0.05); средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до окончания разрушения эритроцитов и максимальная ско-
106
рость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов увеличиваются соответственно на 22 % (р < 0.05) и 18% (р < 0.05).
В объемной доле 0.5 сдвиги параметров гемолиза более выражены: время начала и окончания гемолиза уменьшилось соответственно в 6 раз и в 3 раза (р < 0.01); средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до окончания разрушения эритроцитов и максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов увеличились соответственно на 39 % (р < 0.05) и 36 % (р < 0.05).
Объемная доля вещества 0.55 вызвала максимальный эффект: по сравнению с объемной долей ацетона 0.4 время начала и окончания гемолиза уменьшилось соответственно в 12 раз и 5.75 раза; максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов увеличилась на 36 % (р < 0.05).
Гемолиз спиртом
Данные представлены на рис. 3 (п = 12).
При объемной доле вещества 0.4 время начала гемолиза было таким же, как при действии такого же количества ацетона (р > 0.05), время окончания гемолиза увеличилось на 57 % (р < 0.05), составив 30 мин. Средняя скорость изменения оптической плотности в интервале от начала до окончания разрушения клеток уменьшилась в 5 раз по сравнению с гемолизом раствора ацетона в той же объемной доле. Время разрушения половины эритроцитов увеличилось на 30 % (р < 0.05) и приходилось на 21.5 мин. Максимальная скорость протекания реакции в спирте уменьшилась в 4 раза. Средняя скорость разрушения эритроцитов в интервалах времени между 5 и 30 мин составила соответственно 0.012 едО/мин, что в 4.2 раза меньше соответствующей величины, полученной в экспериментах с ацетоном.
■Спирт,0.4 ■спирт0.45 -спирт,0.5 ■спирт,0.55
HrMrMr\ICncn^flOI^OOa>OrMCQ"3-iniO
Рис. 3. Гемолиз эритроцитов этиловым спиртом.
Ось ординат — доля интактных клеток; ось абсцисс — время, с
Объемная доля вещества 0.45 вызвала следующие сдвиги: время начала и окончания гемолиза уменьшилось соответственно в 2.4 и в 2.1 раза (р < 0.01); средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до оконча-
107
ния разрушения эритроцитов и максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов увеличились соответственно в 3 и 2.5 раза (р < 0.01).
Объемная доля вещества 0.5 привела к уменьшению времени начала и окончания гемолиза соответственно в 7 раз и в 4.8 раза; средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до окончания разрушения эритроцитов и максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов увеличились соответственно в 5.4 и 4.8 раза (р < 0.01).
При объемной доле 0.55 время начала и окончания гемолиза уменьшилось соответственно в 12 и 7 раз; средняя скорость изменения оптической плотности на интервале от начала до окончания разрушения эритроцитов и максимальная скорость протекания реакции на пике разрушения эритроцитов увеличились соответственно в 7.5 и 5.1 раза (р < 0.01).
Обсуждение результатов
В отличие от содержащего Н+ кислотного гемолитика использованные для гемолиза этиловый спирт и ацетон действуют на липидный остов мембраны эритроцитов. Индукция гемолиза такими органическими растворителями выражена в значительно меньшей степени. В экспериментах с кислотным гемолизом концентрация Н+ составила в среднем 0.01 моль/л. Концентрация спирта в объемной доле
0.4 также составляет около 0.01 моль/л, при этом время начала гемолиза при действии спирта (ацетона) удлиняется в 4.6 раза по сравнению с действием кислот, а время окончания гемолиза увеличено в 6 раз. По гемолитическому действию на эритроциты протоны в среднем являются в 5 раз более эффективными, чем молекулы спирта. Мы связываем это не только с разными мишенями для действия Н+, с одной стороны, и молекулы спирта (ацетона) - с другой, но и с разной подвижностью действующих веществ. Исследования влияния спирта на эритроциты при помощи регистрации романовского спектра [4] показали изменение интенсивности спектральных линий по мере удлинения времени инкубации эритроцитов с алкоголем. В частности, основные изменения сводятся к уменьшению линии 752 см"1 спектра, который определяется порфириновым кольцом. Авторы считают, что деградация эритроцитов под влиянием спирта связана с истощением клеток по молекулам гемоглобина. Исследования методом ядерно-магнитного резонанса [5] показали, что молекулы этанола взаимодействуют с липидным бислоем и липидноводной фазой мембраны, что ведет к значительному разупорядочиванию головок липидов. Кроме того, происходит дестабилизация клеточной мембраны. Таким образом, механизмы гемолитического действия молекул спирта на эритроциты могут быть следствием как внутриклеточного, так и внеклеточного эффектов. В экспериментах со спиртом на эритроциты может влиять его метаболит - ацетальдегид, который появляется в суспензии в ходе инкубации. Он снижает гемолитическую устойчивость эритроцитов в условиях окислительного, но не кислотного гемолиза. При этом также имеет место снижение микровязкости липидного бислоя. Прямое дестабилизирующее влияние этанола на мембрану эритроцита [6] приводит к сдви-
108
гам параметров кислотного гемолиза, действие ацетальдегида изменяет показатели резистентности эритроцитов к окислителям.
При одинаковых объемных долях спирта и ацетона эффект последнего был более выражен, что отразилось в меньшем времени полного гемолиза и большей скорости процесса при действии ацетона. С целью уточнения механизма действия ацетона и спирта на эритроциты мы провели исследование концентрационной зависимости параметров гемолиза. Результаты исследований показаны на рис. 4-6.
Рис. 4. Зависимость времени начала гемолиза от объемной доли гемолитика.
Ось абсцисс - объемная доля гемолитика, ось ординат - время начала гемолиза, мин. А - эксперименты с ацетоном; В - эксперименты с этанолом
Рис. 5. Зависимость времени окончания гемолиза от объемной доли гемолитика.
Ось абсцисс - объемная доля гемолитика, ось ординат - время окончания гемолиза, мин. А - эксперименты с ацетоном; В - эксперименты с этанолом
109
Рис. 6. Зависимость средней скорости гемолиза от объемной доли гемолитика.
Ось абсцисс - объемная доля гемолитика; ось ординат - скорость изменения
оптической плотности суспензии, ед. D/мин. А - эксперименты с ацетоном;
В - эксперименты с этанолом
Уравнения зависимости времени начала и окончания гемолиза от объемной доли гемолитика можно представить экспоненциальной зависимостью:
t=k*e'ax,
где к и а - константы, х - объемная доля гемолитика.
Величины коэффициентов приведены в таблице.
Как видно из результатов, данные коэффициенты практически одинаковы в уравнениях зависимости времени начала гемолиза от объемной доли действующего вещества. Из этого следует, что инициация гемолиза как спиртом, так и ацетоном идет по однотипному механизму. Такой механизм может заключаться в разрыхлении полярных головок липидного матрикса мембраны эритроцита и нарушения во дно-липидного взаимодействия в мембране эритроцита [5]. В то же время уравнения, характеризующие зависимость времени окончания гемолиза от объемной доли гемолитика в экспериментах со спиртом и ацетоном, различаются. Коэффициент «к» в уравнении, характеризующем время окончания гемолиза при действии спирта, больше коэффициента «к» в уравнении для ацетона в 3 раза. Экспоненциальный коэффициент «а» при переменной «х» равен -11.4 и -13.25 соответственно для ацетона и спирта.
Величины коэффициентов «к» и «а» в зависимости времени начала и окончания гемолиза от объемной доли гемолитика
Параметры гемолиза Ацетон Этанол
к а к а
Время начала 9.4*103 -16.74 1.1*104 -17.07
Время окончания 1.8*103 -11.43 5.6*103 -13.25
В целом это указывает на то, что сам процесс гемолиза после инициации протекает по разным механизмам в среде со спиртом и ацетоном. На это же указывает
110
величина зависимости средней скорости гемолиза от объемной доли действующих веществ, дающей более высокую эффективность действия ацетона. Мы связываем такое действие спирта и ацетона с разной растворяющей способностью этих веществ по отношению к липидам эритроцитарной мембраны: в молекуле этанола имеется гидрофильная ОН' группа, которая может препятствовать проникновению молекул в билипидный матрикс.
1. Артюков В.Г., Наквасина М.А., Резван С.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А. Практикум по биофизике. Владивосток: Изд-во ВГУ, 2001. 152 с.
2. Никишенко С.А. Кислотная резистентность эритроцитов как способ оценки гемолитического риска при кардиохирургических операциях: сборник статей по материалам международной 69-й научной конференции, посвященной 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова. Томск, 2010. С. 32-38.
3. Hackl E.V., Berest V.P., Gatash S.V. Effect of Cholesterol Content on Gramicidin S-Induced Hemolysis of Erythrocytes // International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 2012. Vol. 18. P. 163-170.
4. Deng, J.L., Wei Q., Zhang M.H., Wang Y.Z., Li Y. Q. Study of the effect of alcohol on single human red blood cells using near-infrared laser tweezers Raman spectroscopy // Wiley In-terScience. 2005. P. 257-261.
5. Gawrisch K., Barry J.A, Holte L.L., Sinnwell T., Bergelson L.D., Ferretti J.A. Role of interactions at the lipid water interface for domain formation // Mol. Membrane Biol. 1995. Vol. 12. P. 83-88.
6. Tyulina O.V., Prokorieva V.D., Dodd R.D., Hawkins J.R., Clay S.W., Wilson D.O., Boldyrev A.A., Johnson P. In vitro effects of ethanol, acetaldehyde and fatty acid ethyl esters on human erythrocytes // Alcohol & Alcoholism/ 2002. Vol. 37, № 2. P. 179-186.
Ill
