CC BY
173
Химия растительного сырья. 2013. №4. С. 109-113.
DOI: 10.14258/jcprm.1304109
УДК 547.972
КЕМПФЕРОЛ И ЕГО ГЛИКОЗИДЫ ИЗ EQUISETUM SILVATICUM L. ХАНТЫ-МАНСИЙСКОГО АВТОНОМНОГО ОКРУГА
© В.М. Боначева , Э.Х. Ботиров
Сургутский государственный университет ХМАО-Югры, ул. Ленина, 1, Сургут, 628412 (Россия), e-mail: [email protected]
Из надземной части Equisetum silvaticum L. (хвощ лесной) семейства Equisetaceae выделены три флавоноида, два из которых обнаружены в хвоще лесном впервые. Полученные соединения на основании химических превращений и результатов изучения данных ИК-, УФ-, 'Н-ЯМР и масс-спектров идентифицированы с кемпферолом, кемпферол-3-0-Р^-галактопиранозил-7-0-а^-рамнопиранозидом и кемпферол-3-0-рутинозил-7-0-рамнозидом.
Ключевые слова: Equisetum silvaticum (L.) Smeet - хвощ лесной, флавоноиды, кемпферол, гликозиды, агликон, P-D-глюкопиранозид, a-L-рамнопиранозид, рутинозид, P-D-галактопиранозид, гидролиз.
Введение
В последние десятилетия особым вниманием ученых пользуются растения, содержащие флавоноиды, вследствие их ценности для медицины и фармакологии как источников лекарственных средств широкого спектра действия. Они обладают антиоксидантными, противовоспалительными, капилляроукрепляю-щими, желчегонными, противоопухолевыми, иммуномодулирующими и другими лечебными свойствами и, что ценно, препараты, созданные на их основе, являются низкотоксичными [1, 2].
Большой интерес представляет с этой точки зрения Equisetum silvaticum L., содержащий некоторые ценные для исследователей вещества, но изучен недостаточно, а на территории Ханты-Мансийского автономного округа изучен впервые.
Equisetum silvaticum L. (хвощ лесной) - многолетнее травянистое растение высотой до 60 см. Распространен в лесной зоне тайги, лесотундры, лесостепи, в горнолесных поясах России, Юго-Восточной Азии, Северной Америки. Хвощ лесной чаще можно встретить на опушках лесов, вблизи водоемов, на влажных затененных местах, на заболоченных и торфяных лугах [3]. Этот вид хвоща ядовит для лошадей и крупного рогатого скота.
С давних времен хвощ лесной использовали в народной медицине как лекарственное растение, которое обладает мочегонными, противовоспалительными, противогрибковыми, диуретическими и другими полезными свойствами [4].
Раньше хвощ лесной использовали для окрашивания шерсти в серо-желтый цвет [5-6]. Хвощ лесной по распространенности, богатым сырьевым ресурсам, а также наличию в нем компонентов фенольной природы является наиболее перспективным для химико-фармакологического изучения. Этот факт говорит об актуальности исследований флавоноидов этих растений.
Экспериментальная часть
Боначева Виктория Михайловна - аспирант кафедры химии, тел. (3462) 76-28-00, e-mail: [email protected] Ботиров ЭркинХожиакбарович - заведующий кафедрой химии, доктор химических наук, профессор, тел.: (3462) 76-30-91, e-mail: [email protected]
Для выделения флавоноидов воздушно-сухую измельченную надземную часть хвоща лесного (700 г) пятикратно экстрагировали 85%-м этиловым спиртом при комнатной температуре. Объединенный
* Автор, с которым следует вести переписку.
экстракт сгущали в вакууме, разбавляли водой в соотношении 1 : 1 и затем последовательно обрабатывали на делительной воронке петролейным эфиром, хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. После отгонки растворителей получили 1,8 г хлороформной, 9,5 г этилацетатной и 19,5 г бутанольной фракций. Хромато-графированием этилацетатной фракции на колонке (120x3 см) с силикагелем (220 г) в градиентной системе этилацетат-этанол выделили соединение 1. Вещество 1 (выход 0,2 г) элюировано смесью растворителей этилацетат - этанол в соотношении 98 : 2.
Хроматографированием части бутанольной фракции (12 г) на колонке с силикагелем (240 г) в системе растворителей этилацетат - этанол в соотношении (94 : 6) получили вещество 2 (0,45 г), а вещество 3 (выход 0,8 г) элюировано системой растворителей этилацетат - этанол (86 : 14).
Полученные вещества очищены колоночной хроматографией на полиамиде марки Woelm (Германия) в градиентной системе растворителей хлороформ - этанол.
Для установления месторасположения углеводных остатков проводили щелочной и кислотный (мягкий ступенчатый и полный) гидролиз соединений 2 и 3.
Щелочной гидролиз проводили следующим образом : навеску гликозида растворяли в 0,5%-м водном растворе гидроксида калия и гидролизовали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч. Раствор нейтрализовали 2%-м водным раствором серной кислоты, упаривали досуха, продукты идентифицировали методом ТСХ сравнением с подлинными образцами [7-8]. Для осуществления ступенчатого мягкого кислотного гидролиза гликозид нагревали при температуре 50-60 °С в 0,16%-м водном растворе хлороводородной кислоты. Через каждые 15 мин отбирали пробы и анализировали продукты методом ТСХ, используя стандартные образцы [9].
Полный кислотный гидролиз флавоноидных гликозидов проводили нагреванием на кипящей водяной бане с обратным холодильником раствора 10 мг вещества в 10 мл смеси 5% соляной кислоты и этанола в соотношении 1 : 1 в течение 2 ч [10]. Осадок агликона, выпавший при отгонке этанола в вакууме, отделяли фильтрованием. Фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в этаноле и углеводы анализировали методом тонкослойной хроматографии в присутствии подлинных образцов моносахаридов в системе растворителей н-бутанол - уксусная кислота - вода (6 : 1,5 : 2,5). Пластинки проявляли смесью н-бутанол -вода - уксусная кислота - фосфорная кислота - анилин - дифениламин, мл (60 - 25 - 15 - 10 - 1 - 2 г), высушивали в термостате при 120 °С в течение 5 мин [11].
УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Specord M 400 в этаноле, ИК-спектры снимали на ИК-Фурье-спектрометре IR Prestige-21. Масс-спектры снимали на хромато-масс-спектрометре Thermo Finnigan MAT 95 XP, энергия ионизации 70 эВ. Спектры 1Н-ЯМР снимали в flMCO-d6 на приборе Bruker Avance III с рабочей частотой 500 МГц. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (м.д.) в 5-шкале.
Температуры плавления определяли на столике Кофлера.
Для ТСХ использовали пластинки Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ. Пятна флавоноидов обнаруживали обработкой пластинок 1%-м спиртовым раствором AlCl3. Колоночную хроматографию проводили на силикаге-ле марки КСК 100/160 мкм.
Обсуждениерезультатов
Выделенные индивидуальные соединения относятся к классу флавоноидов. Идентификацию полученных веществ проводили на основании результатов химических превращений и спектральных данных. Полученные результаты сравнивали с литературными данными.
3,5,7,4'-тетрагидроксофлавон (кемпферол) (1) - светло-желтое кристаллическое вещество состава Ci5Hi006, т. пл. 268-270 °С, масс-спектр (m/z): М+286. УФ-спектр: (этанол) 266,369 нм, что характерно для флавонолов; + NaOH: 281, 415 нм; +СН3СООН 274, 387 нм, поэтому гидроксильная группа в положении 7 - свободна, так как наблюдаем батохромный сдвиг полосы II на 8 нм и полосы I на 18 нм.
В ИК-спектре вещества 1 присутствуют полосы поглощения гидроксильных групп (3323-3277 см-1), карбонила у-пирона (1662 см- ), ароматических С=С-связей (1591см-1).
В спектре ПМР вещества, снятом в flMSO-d6, проявляются сигналы протонов 3,5,7,4'-тетра-замещенного флавонола: 6,19 (Н, д, 2,0 Гц, Н-6), 6,44 (Н, д, 2,0 Гц, Н-8), 6,93 (2Н, д, 8,9 Гц, Н-3', 5'), 8,05 (2Н, д, 8,9 Гц, Н-2',6'), 12,49 (1Н, уш.с, 5-ОН).
Кемпферол и его гликозиды из Equisetum Silvaticum L.
111
Используя метод ТСХ с подлинным образцом кемпферола в системе растворителей хлороформ -этилацетат - этанол в соотношении (6 : 3 : 1), а также сравнивая спектральные данные, физико-химические свойства, соединение 1 идентифицировали с 3,5,7,4'-тетрагидроксофлавоном (кемпферолом) [12, 13]. Кемпферол из Едш^^ит ^Нуа^сит Ь. выделен впервые.
1. R]=H, R2=H
2. R^ß-D-Galp, R2=a-L-Rhap
3. Rj=ß-D-Glcp(6-<—l)-a-L-Rhap, R2=a-L-Rhap
Кемпферол-3-0-Р-Б-галактопиранозил-7-0-а-Ь-рамнопиранозид (2) - желтое кристаллическое соединение состава С27Нзо015, т.пл. 188-190 °С, масс-спектр (m/z): 286 (М+ агликона кемпферола). УФ-спектр: (этанол): 272, 359 нм. + NaOH: 277, 399 нм с уменьшением интенсивности полосы I; +AlCl3:
276, 348, 400 нм; +СН3СООН 267, 354 нм. Анализируя УФ-спектры, можно сделать вывод, что данное вещество относится к 3,7-ди-О-замещенным флавонолам.
В ИК-спектре соединения 2 наблюдаются полосы колебаний гидроксильных групп (3392-3219 см-1), карбонила у-пирона (1647 см-1), гликозидных С-0 связей (1006-1141 см-1) и ароматических связей.
1Н-ЯМР (5, AMCO-d6): 12,6 (1Н, уш.с, 5-ОН), 8,06 (2Н, д, 8,8 Гц, Н-2',6'), 6,95 (2Н, д, 8,8 Гц, Н-3',5'), 6,80 (1Н, д, 1,9 Гц, Н-8), 6,43 (1Н, 1,9 Гц, Н-6), 5,53 (с, Н-1" аномер H-Rha), 5,47 ( д, 7,3 Гц, Н-1'" аномер H-Gal), 3,05-3,62 (м, протоны сахарной части), 1,05 (д, 6 Гц, CH3-Rha).
Был проведен полный кислотный гидролиз 14 мг вещества 2 смесью 5% HCl - С2Н5ОН в соотношении 1 : 1 на водяной бане в течение 2 ч. Осадок агликона, выпавший при отгонке этанола в вакууме, отделяли фильтрованием, перекристаллизовали. Получили кемпферол состава Ci5Hi006 (Х^ 266, 369 нм, т. пл. 270-272 °С). Фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в этаноле и методом ТСХ в присутствии подлинных образцов обнаружили D-галактозу и L-рамнозу [ТСХ в системе н-бутанол - уксусная кислота -вода (6 : 1,5 : 2,5)].
Также провели щелочной гидролиз 10 мг вещества 0,5%-м водным раствором гидроксида калия (10 мл) на водяной бане в течение 2 ч. В результате получили кемпферол-3-0-Р-Э-галактопиранозид и моносахарид L-рамнозу (ТСХ). Таким образом, можно сделать вывод, что в положении 7 гидроксильная группа замещена L-рамнозой, а 3-ОН гликозилирована D-галактозой.
Сигнал аномерного протона D-галактозы в спектре 1Н-ЯМР (flMSO-d6) проявляется в виде дублета с КССВ 7,3 Гц, что свидетельствует о ß-конфигурации D-галактозы.
На основании проведенных химических превращений, а также сравнивая спектральные данные с литературными сведениями, мы идентифицировали вещество 2 c кемпферол-3-0-Р-Э-галактозил-7-0-оЛ-рамнопиранозидом [14]. Кемпферол-3-0-Р-Э-галактозид-7-0-оЛ-рамнопиранозид впервые выделен из растений рода Equisetum L.
Кемпферол-З-О-рутинозил-7-О-рамнозид (3) - светло-желтое кристаллическое вещество состава C33H40O19, масс-спектр (m/z): 286 (М+ агликона), т. пл. 147-148 °С. УФ-спектр: Хмахэтанол 272,361 нм. +NaOH:
277, 400 нм; +AlCl3: 276, 350, 402 нм; +CH3COONa: 267, 356.
ИК-спектр (см-1): 3373-3277 см-1 (ОН-группы), 1654 см-1 (С=0 у-пирона), 1591см-1 (ароматические С=С связи), 1100-1000 см-1 (гликозидные С-0 связи) и др.
1Н-ЯМР- спектр (5, DMSO-d6): 0,98 (д, 6,95 Гц, СН3-рамнозы биозы), 1,13 (д, 6 Гц, СН3-7-рамнозы), 3,05-3,87 (м, протоны углеводной части), 5,16 (д, 2,1 Гц, Н-1'" аномер H-Rha биозы), 5,32 (д, 7,5 Гц, Н-1'" аномер H-Glc), 5,53 (д, 2 Гц, Н-1'' аномер H-Rha), 6,42 (Н, д, 2,0 Гц, Н-6), 6,76 (Н, д, 2,0 Гц, Н-8), 6,87 (2Н, д, 8,8 Гц, Н-3', Н-5'), 8,00 (2Н, д, 8,8 Гц, Н-2', Н-6'), 12,60 (уш.с, 5-ОН).
В результате полного кислотного гидролиза гликозида 3 смесью 5%-й соляной кислоты и этанола в соотношении 1 : 1 получили кемпферол (4 мг), L-рамнозу и D-глюкозу.
Для установления месторасположения углеводных остатков нами был проведен щелочной и кислот -ный мягкий ступенчатый гидролиз данного соединения. В ходе мягкого кислотного гидролиза на первой стадии (через 15 мин) образуются дигликозид, который идентифицировали как кемпферол-3-О-глюкозид-7-О-рамнозид, т. пл. 151-153 °С, УФ-спектр: 272, 359 нм и моносахарид L-рамноза [4,8]. На второй стадии (через 30 мин) образуется гликозид, т. пл. 177-179 °С, УФ-спектр: 260,366 нм и моносахарид D-глюкоза (ТСХ, ИК-спектр). Сравнивая данные с литературой, мы идентифицировали его как кемпферол-7-О-рамнозид [15-16].
Также был проведен гидролиз соединения 3 в щелочной среде, методика которого описана выше. При этом было получено вещество с т. пл. 182-185 °С, УФ-спектр: 266, 352 нм, которое сравнением с литературными данными идентифицировали как кемпферол-3 -О-рутинозид, раннее выделенный из хвоща лесного, и моносахарид L-рамнозу [4]. Углеводный остаток идентифицировали, используя метод ТСХ, сравнением с подлинным образцом L-рамнозы.
Обобщая полученные данные, а также сравнивая спектральные данные и физико-химические свойства с литературными сведениями, соединение 3 идентифицировали с кемпферол-3-О-рутинозил-7-О-рамнозидом [4, 15-17].
Выводы
Из надземной части хвоща лесного впервые выделены известные флавоноиды: 3,5,7,4'-тетрагидроксофлавон (кемпферол), кемпферол-3 -0-Р-Э-галактопиранозил-7-0-а-Ь-рамнопиранозид, а также раннее выделенный кемпферол-3-0-рутинозил-7-0-рамнозид.
Выделенные соединения идентифицированы на основании результатов химических превращений, данных УФ-, :Н-ЯМР, ИК- и масс-спектров.
Список литературы
1. Hollman P.C.H., Feskens E.I.M., Katan M.B. The Flavonoids in cardio-vascular disease and cancer prevention // Proceed. Soc. Exp. Biol. Med. 1999. Vol. 220, no. 4, Pp. 198-202.
2. Hernandez N.E., Tereschur M.L., Abdala L.R. Antimicrobial activity of flavonoids in medicinal plants from Tafi del Valle (Tucuman, Argentina) // J. Ethnopharmacol. 2000. Vol. 73, №1-2. Pp. 317-322.
3. Flavonoids in Health and Disease, edited by Catherine A Rice-Evans and Lester Packer, New-York, Marsel Dekker, Inc. 2003, 458 p.
4. Коломиец Н.Э., Калинкина Г.И. Сравнительное исследование химического состава видов рода флоры Сибири // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 149-154.
5. Носов А. Лекарственные растения. М., 2001. 348 с.
6. Шамрук С.Г. Лекарственные растения. М., 1989. 286 с.
7. Макаров В.А., Шинкаренко А.Л., Литвиненко В.И., Ковалев И.П. Флавоноидные дигликозиды Prunus spinosa // Химия природных соединений. 1969. №5. С. 366-369.
8. Литвиненко В.И., Макаров В.А. Щелочной гидролиз флавоноидных гликозидов // Химия природных соединений. 1969. №5. С. 366-369.
9. Максютина Н.П., Литвиненко В.И., Ковалев И.П. Неоробинин - новый гликозид из Cheiranthus Allioni // Химия природных соединений. 1966. №6. С. 367-454.
10. Chander R.F.. Harpek K.A. Identification of Saccharides in Anthcyanins and other Flavonoids // Austral. J. Chem. 1961. Vol. 14, N4. Pp. 586-595.
11. Методы исследования углеводов / Пер. с англ. В.А. Несмеянова; под ред. А.Я. Хорлина. М., 1975. 445 c.
12. Markham K.R. Techniques of Flavonoid Identification. London: Academic Press, 1982. 113 p.
13. Yuldashev M.P., Muminova B.A., Drenin A.A., Botirov E.Kh. Flavonoids from the aerial Part of Vicia subvillosa // Chem. Nat. Comp. 2007. Vol. 43. №1. Pp. 34-36.
14. Perez-Jimenez J., Neveu V., Vos F., Scalbert A. Identification of the 100 richest dietary sources of polyphenols: an application of the Phenol-Explorer database // European Journal of Clinical Nutrition. 2010. Vol. 64. Pp. 112-120.
15. Самокина О.В., Шинкаренко А.П. Кемпферол 7-рамнозид из Aconitum orientale // Химия природных соединений. 1969. №5. С. 441.
16. Yonekura-Sakakibara K., Tohge T., Niida R., Saito K. Identification of a Flavonol 7-O-Rhamnosyltransferase Gene Determining Flavonoid Pattern in Arabidopsis by Transcriptome Coexpressi on Analysis and Reverse Genetics // Biological Chemistry. 2007. №2. P. 282.
17. Запесочная Г.Г. Изучение структуры и стереохимии флавоноидных О-рамнозидов с помощью спектроскопии ПМР // Химия природных соединений. 1982. №5. С. 695-709.
Поступило в редакцию 13 февраля 2012 г.
kemn®epo^ h ero r^hk03h^m h3 Equisetum Silvaticum L.
113
Bonacheva V.M.*, Botirov E.Kh. KAEMPFEROL AND ITS GLYCOSIDES FROM EQUISETUM SILVATICUM L. smeet HUNTS-MANSIJSKOGO OF AUTONOMOUS region
Surgut State Universit, Lenina st., 1, Surgut, 628412 (Russia), e-mail: [email protected]
The article is devoted to the phytochemical study of Glycosides flavonoids Equisetum silvaticum (L.) Smeet . From the overgrown part of Equisetum silvaticum (L.) Smeet of the first flavonoids kaempferol, kaempferol-3-O-ß-D-galactopyranoside-7-O-a-L-ramnopyranoside and elready kaempferol-3-O-rutinoside-7-O-a-L-ramnopyranoside were isolated. The resulting compounds were identified on the basis of results of chemical transformations and IR, UV, 1H-, 13C-NMR and mass spectra.
Keywords: Equisetum silvaticum L. Smeet, flavonoids, kaempferol, glycosides, aglycone, ß-D-glucopyranoside, a-L-ramnopyranoside, rutinoside, ß-D-galactopyranoside, hydrolysis.
References
1. Hollman P.C.H., Feskens E.I.M., Katan M.B. Proceed. Soc. Exp. Biol. Med, 1999, vol. 220, no. 4, pp. 198-202.
2. Hernandez N.E., Tereschur M.L., Abdala L.R. J. Ethnopharmacol., 2000, vol. 73, no. 1-2, pp. 317-322.
3. Flavonoids in Health and Disease, edited by Catherine A Rice-Evans and Lester Packer, New-York, Marsel Dekker, Inc. 2003, 458 p.
4. Kolomiets N.E., Kalinkina G.I. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2010, no. 1, pp. 149-154. (in Russ.).
5. Nosov A. Lekarstvennye rasteniia. [Medicinal plants]. Moscow, 2001, 348 p. (in Russ.).
6. Shamruk S.G. Lekarstvennye rasteniia. [Medicinal plants]. Moscow, 1989, 286 p. (in Russ.).
7. Makarov V.A., Shinkarenko A.L., Litvinenko V.I., Kovalev I.P. Khimiiaprirodnykh soedinenii, 1969, no. 5, pp. 366-369. (in Russ.).
8. Litvinenko V.I., Makarov V.A. Khimiia prirodnykh soedinenii, 1969, no. 5, pp. 366-369. (in Russ.).
9. Maksiutina N.P., Litvinenko V.I., Kovalev I.P. Khimiia prirodnykh soedinenii, 1966, no. 6, pp. 367-454. (in Russ.).
10. Chander R.F., Harpek K.A. Austral. J. Chem, 1961, vol. 14, no. 4, pp. 586-595.
11. Metody issledovaniia uglevodov. Ed. A.Ia. Khorlina. [Research methods carbohydrates]. Moscow, 1975. 445 c. (in Russ.).
12. Markham K.R. Techniques of Flavonoid Identification. London: Academic Press, 1982. 113 p.
13. Yuldashev M.P., Muminova B.A., Drenin A.A., Botirov E.Kh. Chem. Nat. Comp, 2007, vol. 43, no. 1, pp. 34-36.
14. Perez-Jimenez J., Neveu V., Vos F., Scalbert A. European Journal of Clinical Nutrition, 2010, vol. 64, pp. 112-120.
15. Samokina O.V., Shinkarenko A.P. Khimiia prirodnykh soedinenii, 1969, no. №5, pp. 441. (in Russ.).
16. Yonekura-Sakakibara K., Tohge T., Niida R., Saito K. Biological Chemistry, 2007, no. 2, pp. 282.
17. Zapesochnaia G.G. Khimiia prirodnykh soedinenii., 1982, no. 5, pp. 695-709. (in Russ.).
Received February 13, 2012
* Corresponding author.
