CC BY
23
УДК 577.158.54
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СПЕКТРЫ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ LUCIOLA MINGRELICA С ТОЧЕЧНЫМИ МУТАЦИЯМИ ВНЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА
Л.Г. Малошенок, И.В. Упоров, Н.Н. Угарова
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: mlg@enz.chem.msu.ru)
Методом сайт-направленного мутагенеза получены мутантные формы рекомбинант-ной люциферазы светляков Luciola mingrelica с точечными заменами His433Asn и His433Ser. Исследованы физико-химические свойства исходной рекомбинантной люциферазы светляков и ее мутантов. Показано, что для люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм величины Km LH2 совпали. Замена His433Asn привела к увеличению Km ATP на 20% и снижению удельной активности на 20%, а замена His433Ser привела к увеличению Km ATP на 50% и снизила удельную активность в 200 раз. Предложена модель влияния замен остатка His433 на активный центр люцифе-разы светляков Luciola mingrelica.
Анализ литературных данных по мутагенезу люци-фераз светляков [1] показал, что мутации в активном центре фермента приводят не только к изменениям в спектрах биолюминесценции, но и значительно снижают каталитическую активность люциферазы. В то же
время природные мутанты люцифераз, различающиеся по спектрам биолюминесценции, сохраняют высокую каталитическую активность. Это может быть следствием того, что данные мутации не затрагивают активного центра, но влияют на физико-химические свойства
микроокружения эмиттера [1]. Мутация His433Tyr в лю-циферазах светляков Lucióla cruciata и Hotaria parvula привела к сдвигу максимума биолюминесценции от 570 до 610 нм [2, 3]. Это означает, что консервативный остаток His433, расположенный в люциферазе вне активного центра, играет важную роль в функционировании фермента. Целью данной работы было получение мутантов His433Ásn и His433Ser для люциферазы светляков Lucióla mingrelica, имеющую высокую гомологию с люциферазами, указанными выше, а также изучение каталитических свойств мутантных форм фермента, их спектров биолюминесценции и выявление изменений в белке с мутациями остатка His433.
Материалы и методы
Использовали рестриктазы (NheI, KpnI, AatlI), Т4БКЛ-лигазу и Pwo DNA-полимеразу ("New England Biolabs", USA). Рекомбинантную люциферазу светляков L. mingrelica и ее мутантные формы выделяли из клеток E. coli (штамм LE 392), несущих плазмиду-супер-продуцент pLR с геном люциферазы, либо плазмиды mpLR с заменами His433Asn и His433Ser, а затем очищали по методике [4]. Люциферин был синтезирован в лаборатории органического синтеза кафедры химической энзимологии по методу [5]. Другие химические вещества имели степень чистоты "ос.ч." Растворы готовили на дистиллированной деионизованной воде, полученной на установке "Milli-Q" ("Millipore", Франция).
Получение мутантных форм люциферазы светляков L. mingrelica. Сайт-направленный мутагенез проводили, используя метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе "Techne PHC-2". Для мутагенеза использовали плазмиду pLR (6270 пар оснований), содержащую ген люциферазы светляков L. mingrelica, выделенную из клеток E. coli (штамм LE 392) с помощью набора реактивов фирмы "Qiagen". Синтезированные на первом этапе два фрагмента ДНК c перекрывающимися концами далее использовали в реакции сшивки. Продукт сшивки амплифицировали с помощью ПЦР. Для получения липких концов амплифицирован-ный фрагмент, содержащий мутантный ген люциферазы светляков, и плазмиду pLR обрабатывали рестриктаза-ми. Немутантный ген люциферазы вырезали из фрагмента ДНК, полученного из плазмиды pLR на предыдущей стадии. Оба фрагмента ДНК очищали и лигирова-ли для получения плазмидного вектора, содержащего мутантный ген люциферазы. Компетентные клетки E. coli трансформировали мутантными плазмидами, выращивали на чашках со средой LB с ампициллином, обрабатывали раствором люциферина (рН 5,0) и визуально определяли интенсивность биолюминесценции. Для мутантов His433Asn и His433Ser были получены 30 и 7 светящихся колоний соответственно. Для каждого мутанта отбирали по две наиболее яркие колонии, которые далее помещали в 5 мл среды LB и
выращивали при 28° в течение 20 ч до А590= 2,0. Отбирали по 0,8 мл суспензии выросшей культуры, добавляли по 0,2 мл глицерина и помещали на хранение при температуре -70°. Мутантные плазмиды выделяли из клеток E. coli и сиквенировали. Сиквенс генов в плазмиде показал наличие соответствующих замен для мутаций His433Asn и His433Ser. Мутантные белки выращивали в среде LB с ампициллином, выделяли и очищали до гомогенного состояния, как описано в работе [4]. Степень чистоты мутантных белков составила более 97%.
Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли по поглощению раствора при 280 нм (1мг на 1 мл белка соответствует 0,75 ед. опт. плотности) на спектрофотометре "Shimadzu UV 1202".
Регистрация активности. Активность люцифера-зы измеряли по величине максимальной интенсивности света, излучаемого в процессе ферментативной реакции при насыщающих концентрациях субстратов (1,2 мМ АТР, 0,3 мМ люциферин (LH2)). В кювету помещали 0,4 мл 0,05 М Трис-ацетатного буфера (2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, pH 7,8), 0,3 мл раствора АТР и 10 мкл люциферазы. Быстро вводили 0,3 мл люциферина и регистрировали на люминометре "LKB-Wallac 1250" (Швеция) максимальную интенсивность биолюминесценции (/макс), пропорциональную скорости ферментативной реакции. Активность люциферазы выражали в условных единицах: 1 усл.ед. = 1 мВ = 1109 квант/с.
Измерение кинетических параметров реакции, катализируемой рекомбинантной люциферазой светляков и ее мутантными формами. Снимали зависимости 1макс от концентрации люциферина (5 10-5 10-4 M) при постоянной концентрации ATP (1,2 мМ) и 1макс от концентрации ATP (110-6-510-3 М) при постоянной концентрации люциферина (0,3 мМ). Значение Km для люциферина и ATP определяли с помощью программы Origin 6.0 по методу нелинейной регрессии с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен.
Регистрация спектров биолюминесценции. В кювету флуориметра помещали 2 мл 0,05 М Трис-ацетатного буфера (2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, pH 5,6-8,5), содержащего 1 мМ АТР и 0,25 мМ люциферина, добавляли 0,1 мл концентрированного раствора фермента и регистрировали спектр биолюминесценции на спектрофлуо-риметре LS 50B ("Perkin Elmer", Англия) в интервале 500-650 нм. Спектр исправляли на чувствительность ФЭУ с помощью специальной программы.
Результаты и их обсуждение
Полученные данные о каталитических свойствах и максимумах спектров биолюминесценции рекомбинант-ной люциферазы светляков и мутантов His433Asn, His433Ser приведены в таблице. Данные таблицы показывают, что мутации привели к изменению удельной активности люциферазы: при замене His433Asn она
100
60
20
500 550 600 650 X, нм
550 600 650 л, нм
Рис. 1. Спектры биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica и ее мутантных форм при разных значениях рН: а - 6,9; б - 7,8;
в - 8,5 (1 - His433, 2 - His433Asn, 3 - His433Ser)
б
а
в
снизилась на 20%, при замене His433Ser в 200 раз. Полагая, что удельная активность отражает каталитическую активность фермента, можно заключить, что мутация His433Ser привела к сильному снижению каталитической активности фермента. Это интересный факт влияния отдаленной мутации на каталитические свойства фермента. Константы Михаэлиса, рассчитанные из зависимости /макс от концентрации одного субстрата при постоянной насыщающей концентрации другого субстрата, представляют собой сложные комбинации констант скоростей различных стадий процесса окисления люцифе-рина [4]. Для исходной люциферазы светляков L. mingrelica и мутантов His433Asn, His433Ser величины констант Михаэлиса по люциферину (KmLH2) совпали. Величина Km ATP увеличилась на 20% для мутанта His433Asn и на 50% для мутанта His433Ser. Следовательно, мутации повлияли на сродство фермента к АТР.
Для нативной люциферазы и двух мутантных форм (таблица, рис. 1) максимумы биолюминесценции совпадают и равны 562-564 нм. При рН 7,8 (рН-оптимум активности люциферазы) формы спектров биолюминесценции для всех трех белков близки. Для мутантов полуширина спектров увеличилась лишь на 8%. Более
Кинетические параметры и максимумы спектров биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica и ее мутантных форм
Фермент Исходная люцифераза Мутантные формы люциферазы
His433Asn His433Ser
Максимум биолюминесценции, нм 562 ± 5 562 ± 5 564 ± 5
Удельная активность, усл. ед./мг (9,2 ± 0,4)109 (7,5 ± 0,2)109 (4,6 ± 0,5)107
Kм, ЬИ2, мкМ 20 ± 3,9 20 ± 3,7 20 ± 3,8
АТР, мМ 0,19 ± 0,03 0,23 ± 0,02 0,29 ± 0,04
сильные различия в полуширине спектров наблюдаются вне рН-оптимума. При замене His433Asn полуширина спектра увеличивается на 10%, а при замене His433Ser -на 20%. Интересно, что для всех белков коротковолновая часть спектра совпадает, и уширение наблюдается в длинноволновой области. Уширение спектров может свидетельствовать о большей подвижности групп в микроокружении эмиттера, что может являться следствием определенных изменений в структуре фермента.
Чтобы выявить возможные структурные изменения в мутантных формах люциферазы, нами было проведено компьютерное моделирование изменения пространственной структуры люциферазы при заменах остатка His433Asn и His433Ser. Для этих целей использовали программный комплекс InsightII (Accelrys Inc., San Diego, CA, USA). В качестве исходной была выбрана структура люциферазы, предложенная в работе [6]. Замены остатка His433Asn и His433Ser были произведены с помощью стандартных функций, реализованных в InsightII. Затем структуры люциферазы, как нативная, так и мутированные, подверглись энергетической минимизации. Минимизацию, состоящую из 500 шагов, проводили с привлечением силового поля AMBER [7, 8]. Применение к обеим структурам такой щадящей процедуры релаксации было вызвано желанием сохранить основные черты структуры люциферазы, предложенные в работе [6]. На рис. 2 для участка фермента между активным центром и остатком His433 показаны аминокислотные остатки в радиусе 5 Â от His433 и от аденинового цикла АТР. Все указанные аминокислотные остатки консервативны для всех известных люци-фераз, что доказывает важность этой области белка для формирования структуры активного центра. Остаток His433 консервативен для всех люцифераз и находится на расстоянии 12 Â от аденинового цикла АТР. В непосредственной близости от него находятся отрицательно заряженные остатки Asp429, Asp431 и
Рис. 2. Структура фермент-субстратного комплекса между активным центром фермента и остатаком Шй433 для рекомбинантной люциферазы светляков Ь. mingrelica (черная линия) и для мутанта Шй4338ег (серая линия)
Glu432, а также положительно заряженный остаток Lys366. При замене His433Asn остаток Asn, как и остаток His, может нести положительный заряд, поэтому изменения в указанном участке незначительны и могут быть связаны в основном со структурными различиями остатков His и Asn. При замене His433Ser удаление положительного заряда остатка His и появление частично отрицательного заряда остатка Ser (-0,55) дестабилизирует кластер, и отрицательные боковые цепи окружающих его остатков несколько отдаляются друг от друга. На расстоянии около 12 Á от боковой цепи His433 находится место связывания аденинового цикла АТР. На рис. 2 показано, что происходят некоторые изменения в конфигурации фосфатных групп АТР, что может являться причиной столь сильного уменьшения каталитической актив-
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н. // Изв. АН, сер.хим. 2001. 10.
С. 1670.
2. Kajiyama N.K., Nakano E. // Protein Eng. 1991. 4. P. 691.
3. Ohmiya Y., Hirano N., Ohashi M. // FEBS Let. 1996. 384. Р. 83.
4. Lundovskich I.A., Leontieva O.V., Dementieva E.I., Ugarova N.N.
// Bioluminescence and Сhemiluminescence. Perspectives for 21st Century. Chichester, Wiley. 1999. Р. 420.
ности и увеличения Km ATP для мутанта His433Ser. Таким образом, несмотря на то что остаток His433 локализован достаточно далеко от активного центра фермента, замена его на Ser приводит к значительным изменениям каталитических свойств фермента. Люцифераза светляков характеризуется исключительно высокой специфичностью по отношению к субстратам, что, по-видимому, необходимо для высокоэффективного преобразования энергии биохимической реакции в световую. Этот вывод еще раз подтверждается результатами данной работы. Отдаленная мутация His433Ser, которая приводит, на первый взгляд, к незначительным изменениям в структуре как фермента, так и ее субстрата (АТР), драматически изменяет каталитическую активность фермента, уменьшая ее в 200 раз.
(проект № 02-04-48-961) и INTAS (проект 2000-0562).
5. Талебаровская И.К., Каткова В.А., Рыжова В.В., Щеголев А.А.
и др. // Авт. св. № 1192324. 1983.
6. Сандалова Т.П., Угарова Н.Н. // Биохимия.1999. 64. С. 962.
7. Weiner S. J., Kollman P. A., Case D. A., Singh U. C. et al. // J. Am.
Chem. Soc. 1984. 106. Р. 765.
8. Weiner S. J., Kollman P. A., Nguyen D. T., Case D. A. // J. Comp.
Chem. 1986. 7. Р. 230.
Поступила в редакцию 25.10.02
