CC BY
43Каллусогенез
как альтернативный способ получения биологически активных веществ в замкнутой экосистеме
УДК 581.143
Налетов И.В. Заяц В.С.
ЗАО «Струнные технологии», г. Минск, Беларусь
■ ■ Рассмотрена возможность культивирования клеток растений для производства Ш Щ лекарственного сырья в ЭкоКосмоДоме (ЭКД). По сравнению с классической технологией данный подход способствует более эффективному накоплению действующих веществ (ДВ). Проведена оценка влияния фитогормонов на рост пассированных клеток и количественные показатели накопления биологически активных веществ. Получены каллусные ткани эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea L.), шалфея лекарственного [Salvia officinalis L.), эвкалипта лимонного (Corymbia citriodora Hook.), зверобоя продырявленного [Hypericum perforatum L), полыни горькой [Artemisia absinthium L.). Изучено накопление ДВ: кафтаровой кислоты (эхинацея); эфирного масла (шалфей, эвкалипт, полынь); флавоноидов (зверобой).
Ключевые слова: биологически активные вещества, замкнутая экосистема, каллусные ткани, лекарственные растения, ЭкоКосмоДом (ЭКД).
Введение
Лекарственные растения - главный источник природных биологически активных веществ медицинского назначения. В замкнутых экосистемах при ограниченных ресурсах и площадях появляется острая потребность в разработке методов и способов получения с наименьшими издержками лекарственного сырья.
Примерами такой замкнутой экосистемы являются ЭкоКосмоДом (ЭКД) и ЭкоКосмоДом на планете Земля (ЭКД-Земля) [1], где предусматривается круглогодичное проживание людей. Как и в любом закрытом пространстве, человек может столкнуться с развитием респираторных и других инфекционных заболеваний [2]. Соответственно, для благоприятного существования в подобной среде необходимо наличие большой базы лекарственных соединений, их доступность и возможность получения.
На данный момент в условиях городских поселений насчитывается свыше 142 различных вирусов, вызывающих ОРВИ (острая респираторная вирусная инфекция), которая сопровождается повышенной температурой и другими (одним или более) симптомами, такими как озноб, головная боль, общее недомогание, потеря аппетита. Кроме того, ОРВИ, поражая дыхательную систему, проявляется в виде ринита, фарингита, тонзиллита, ларинготрахеита, бронхита, иногда конъюнктивита [3, 4]. Следовательно, сложно переоценить важность организации производства в ЭКД лекарственных соединений из природных источников.
В медицине для борьбы с заболеваниями используются различные препараты, в том числе на основе веществ, выделенных из лекарственных растений.
Потребность в лекарственном растительном сырье постоянно увеличивается, что приводит к сокращению ареала произрастания лекарственных трав из-за неограниченного их сбора населением и фармацевтическими компаниями [5,6].
К группам полезных веществ можно отнести множество различных компонентов, получаемых в результате долгого синтеза метаболитов внутри клетки [5, 6]. Так, Всемирная организация здравоохранения в монографиях о лекарственных растениях выделяет более 14 семейств: Papave-raceae, Rosaceae, Apiaceae, Araliaceae, Fabaceae, Astera-ceae, Elaeagnaceae, Hypericaceae, Lamiaceae, Peganaceae, Plantaginaceae, Polygonaceae, Tiliaceae, Poaceae и др. [3]. В Государственную фармакопею Республики Беларусь (ГФ РБ) включены свыше 115 различных видов растений [4], относящихся к более чем 20 разным семействам.
В ЭКД лекарственным травам необходимо время и территория произрастания для накопления вторичных
метаболитов в органах и тканях. На смену традиционному способу выращивания приходит культивирование тканей и органов растений на изолированной питательной среде с возможностью влияния на накопление вторичных метаболитов в структуре.
Растения в стрессовом состоянии способны запускать регенерацию посредством образовательной недифференцированной ткани - каллуса. Полученные каллусные клетки в условиях in vitro позволяют регулировать накопление биологически активных веществ, оптимизируя питательную среду путём изменения минерального комплекса, корректирования уровня фитогормонов, элиситоров и предшественников синтеза, а также температуры и освещения тканей [5].
Таким образом, основная цель статьи - изучение возможности получения и практического применения извлечённых из растений лекарственных веществ и дальнейшее использование их в условиях замкнутой экосистемы.
Основная характеристика и потенциальное применение выбранных культур
В настоящее время в отделе биотехнологий ЗАО «Струнные технологии» получены каллусные и суспензионные культуры следующих лекарственных растений: эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea L), шалфея лекарственного (5а/-iпа officinaiis Ц эвкалипта лимонного (Corymbia citriodora Hook), зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L), полыни горькой [Artemisia absinthium L).
Одним из самых известных продуцентов иммуностимуляторов является эхинацея пурпурная; основные классы биологически активных веществ данного растения - водорастворимые полисахариды, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды и др. [6].
В фенольных соединениях шалфея лекарственного превалируют фенолкарбоновые кислоты и их производные (хлорогеновая, розмариновая и др.), характеризующиеся антиоксидантным, нейропротекторным, противовирусным, гепатопротекторным действием [7].
Эфирные масла эвкалипта лимонного обладают большим количеством терпеноидов (цитронеллаль, изопуле-гол и др.), моноциклических терпенов (1,8-цинеол и ß-пинен). В медицине цинеол применяют в составе антисептических, отхаркивающих препаратов и в качестве компонента зубных паст.
Зверобой продырявленный включает в себя важные биологически активные соединения: гиперфорин и кверцетин.
Первое вещество действует как естественный антидепрессант, второе считается мощным противораковым препаратом и полезным средством для лечения болезни Альцгеймера [8].
Полынь горькая содержит значительное количество полифенолов, которые составляют самую большую группу природных антиоксидантов, флавоноидов и терпено-идов. Они в свою очередь отличаются биологическим действием при использовании по отдельности, а также си-нергетически повышают биодоступность артемизина [9], который характеризуется выраженной антималярийной активностью [10].
Все представленные виды растений оказывают различное фармакологическое действие и способны синтезировать вторичные метаболиты, различающиеся по химической структуре и физико-химическим свойствам.
Разведение данных растений в естественной среде может стать фактором ингибирования накопления вторичного метаболита в нужных концентрациях, что приведёт к заметному снижению лекарственного эффекта. Намного целесообразнее культивировать растения в виде каллусных тканей в условиях in vitro - такая технология позволит увеличить выход нужного количества лекарственного вещества.
Материалы и методы
Объект исследования - каллусные культуры, полученные из интактных растений и растений-регенерантов эхина-цеи пурпурной [Echinacea purpurea L), шалфея лекарственного [Salvia officinalis Ц эвкалипта лимонного [Corymbia citriodora Hook.), зверобоя продырявленного [Hypericum perforatum Ц полыни горькой [Artemisia absinthium L). Каллусную ткань, выделенную из различных частей растений-регенерантов, культивировали на питательной среде Мурасига - Скуга. Кроме того, в ходе эксперимента применялись фитогормоны (согласно дозам внесения, приведённым в таблице 1): из группы ауксинов - 2,4-Д (2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота) и а-НУК (а-нафтилуксусная кислота); из группы цитокининов - 6-БАП (6-бензиламинопурин) и кинетин. Изучалось их влияние на процесс каллусогенеза.
Растительный материал культивировался в условиях световой комнаты, где поддерживался температурный режим 25 °С, соблюдался 11-часовой фотопериод, а также обеспечивалось освещение белыми люминесцентными лампами интенсивностью 3000 лк. Степень влияния фито-гормонов на рост и развитие каллуса оценивалась по его среднесуточному приросту, а также длине, ширине и весу. Индекс прироста каллуса рассчитывался как соотношение конечной массы ткани к изначальной.
Для извлечения фенольных соединений растительный материал измельчался, а затем в аппарате Сокслета подвергался экстракции горячим 96-процентным этанолом. В полученных экстрактах (субстанциях) спектрофотометрическим методом выявлялось суммарное содержание растворимых фенольных соединений (с реактивом Фолина - Дениса), фла-ванов (с ванилиновым реактивом) и флавонолов (с хлористым алюминием). Калибровочные кривые для определения суммарного содержания растворимых фенольных соединений и флаванов строились по эпикатехину, для определения флавонолов - по рутину.
Для того чтобы вычислить содержание эфирного масла, 20 г испытуемого сырья, измельчённого непосредственно перед экспериментом (кроме эвкалипта), выкладывали в колбу вместимостью 500 мл, затем добавляли 250 мл воды. В градуированную трубку помещали 0,5 мл ксилола. Перегонка проводилась со скоростью 2-3 мл/мин в течение 2 ч (для шалфея и эвкалипта) и 3 ч (для полыни) [4].
Результаты и обсуждения
Образование каллусных тканей растениями
в условиях in vitro
В ходе эксперимента отмечено, что в каллусогенезе ключевая роль принадлежит двум аспектам:
• содержанию фитогормонов в питательной среде;
• накоплению действующих веществ (ДВ) в каллусе, напрямую зависящему от формировавшей его минеральной среды.
В связи с этим на практике был применён двух-этапный способ клеточного культивирования: на первой стадии растения находились в питательной среде, содержащей гормон для роста каллуса; на второй - перемещались на продуцирующую питательную среду, в которой и начинался активный синтез вторичных метаболитов в клетках.
Согласно полученным данным максимальный индекс роста отмечен в образцах с полынью горькой (а-НУК -1 мг/л; кинетин - 0,5 мг/л) и шалфеем лекарственным (2,4-Д -0,5 мг/л; 6-БАП -1 мг/л) (рисунок 1).
Равное содержание фитогормонов ауксинов по отношению к цитокинам не привело к активному росту каллуса. В первые дни пассирования каллуса все ростовые показатели были схожи с вариантами, имеющими неравные соотношения фитогормонов.
Таблица 1 - Применение фитогормонов для роста и развития каллусных тканей
Доза фитогормонов, мг/л
Фитогормон Эхинацея Шалфей Эвкалипт Зверобой Полынь
пурпурная лекарственный лимонныи продырявленный горькая
Вариант 1 Вариант 2 Вариант 1 Вариант 2 Вариант 1 Вариант 2 Вариант 1 Вариант 2 Вариант 1 Вариант 2
2,4-Д 0,5 - 0,5 0,5 - 1 0,5 - - 0,5
а-НУК 1 0,5 - - 1 - - 0,5 1 -
6-БАП - - 1 0,5 - 1 0,5 - - 0,5
Кинетин 0,1 0,5 - - 1 - - 1 0,5 -
Эхинацея пурпурная: 2,4-Д - 0,5 мг/л; а-НУК -1 мг/л; кинетин - 0,1 мг/л Эхинацея пурпурная: а-НУК - 0,5 мг/л; кинетин - 0,5 мг/л Шалфей лекарственный: 2,4-Д - 0,5 мг/л; 6-БАП -1 мг/л Шалфей лекарственный: 2,4-Д - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,5 мг/л Эвкалипт лимонный: а-НУК -1 мг/л; кинетин -1 мг/л Эвкалипт лимонный: 2,4-Д -1 мг/л; 6-БАП -1 мг/л Зверобой продырявленный: 2,4-Д - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,5 мг/л Зверобой продырявленный: а-НУК - 0,5 мг/л; кинетин -1 мг/л Полынь горькая: а-НУК -1 мг/л; кинетин - 0,5 мг/л Полынь горькая: 2,4-Д - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,5 мг/л
6,8
15,8
7,2 10
20
37,2
43,8
38,4
30
40
50
60
Рисунок! - Индекс роста каллусныхтканей
Накопление действующих веществ в каллусных тканях растений
Для того чтобы выявить степень накопления ДВ в клетках пассированного каллуса растений, проведена сравнительная оценка содержания ДВ в различных условиях произрастания; требования ГФ РБ выступили как контрольные показатели содержания ДВ. Полученные данные представлены в таблице 2.
Эхинацея пурпурная является инвазивным видом на территории Беларуси; сумма фотосинтетически активной
радиации (ФАР), приходящейся на растение, недостаточная, что сказывается на суммарном накоплении ДВ в тканях.
При исследовании содержания ДВ (кафтаровая кислота в пересчёте на килограмм сухой массы растений) в растениях, культивированных на территории Крестьянского (фермерского) хозяйства «Юницкого» (КФХ «Юницкого») в 2021 г., обнаружено 0,1 % кафтаровой кислоты на сухую массу. При этом в сырье, произведённом на территории Германии (предлагается в аптеках г. Минска), показатель составил 0,18 % на сухую массу.
Таблица 2 - Сравнительные экспериментальные данные содержания ДВ в тканях растений, культивируемых при разных условиях
Растение Основной лекарственный компонент Показатель по ГФ РБ Аптечное сырьё Растения, культивированные в КФХ «Юницкого» Дикорастущие растения Каллусные ткани
Эхинацея пурпурная Кафтаровая кислота, %/кг сух. массы 0,1 0,18 0,1 - 0,22
Шалфей лекарственный Эфирное масло, мл/кг сух. массы 8 9,4 8,1 6,1 4,7
Эвкалипт лимонный Эфирное масло, мл/кг сух. массы 10 12,4 - - 11,7
Зверобой продырявленный Флавоноиды, %/мл рутина 15 15 2,4 0,4 1,8
Полынь горькая Эфирное масло, мл/кг сух. массы 2 4,8 5,1 2,7 1,8
Такое содержание активных компонентов соответствует требованиям ГФ РБ; следовательно, подобное сырьё может считаться лекарственным.
Каллусные ткани, полученные из произрастающих на территории КФХ «Юницкого» растений и пассированные на питательной среде Мурасига - Скуга с добавлением фитогормонов 2,4-Д (0,5 мг/л), а-НУК (1 мг/л), кинетина (0,1 мг/л), за 30 дней накопили вторичных метаболитов в 2,2 раза больше, чем требует ГФ РБ, и в 1,2 раза больше, чем допустимо для реализации лекарственного сырья. При дальнейшем наблюдении содержание ДВ в каллусе значительно снижалось, что может быть связано с заметным замедлением темпа развития каллуса растения на 30-е и последующие сутки.
Шалфей лекарственный также не типичен для флоры Беларуси. Лечебный эффект имеет благодаря эфирному маслу, которое получают из цветков и листьев растения и содержание которого напрямую зависит от ряда факторов, таких как уровень температуры, продолжительность светового дня, количество поступивших минеральных веществ и др.
Эфирного масла в тканях вегетируемых инвазивных культур в 1,16 раза больше, чем в растениях, разводимых на территории КФХ «Юницкого». Требования к абиотическим факторам у шалфея весьма высоки. Представители флоры, произрастающие не в Беларуси, накапливают больше ДВ, чем выращенные в нашей республике, однако шалфей, культивируемый на территории КФХ «Юницкого», сформировал достаточное количество эфирного масла согласно требованиям ГФ РБ.
Пассированный каллус шалфея не способствовал значительному приросту эфирного масла в тканях. При детальном изучении установлено, что клетки каллуса активно делились. Кроме того, он был довольно плотным и образовывал большое количество колленхимы (механических тканей), что приводило к меньшему накоплению ДВ.
Эвкалипт лимонный накапливает много эфирного масла, имеющего существенное количество терпеноидов. Норма содержания эфирного масла - не менее 10 мг/кг сухого вещества; в каллусе же удалось получить более 11 мг/кг. Каллус эвкалипта обладал рыхлой тканью чёрного цвета; в каллусе, образованном из листовой пластины, находилось ДВ в 4,01 раза больше, чем из стебля.
Зверобой продырявленный характеризуется различными типами секреторных структур, специализирующихся на хранении метаболитов и распространённых во всех репродуктивных и вегетативных тканях растения.
Бледные железы (рисунок 2), содержащие большое количество гиперфорина, сконцентрированы в листовой
пластине; они пронизывают паренхиму и ограничиваются двумя слоями клеток эпидермиса.
Тёмные железы, содержащие гиперицин, морфологически располагаются по всему растению равномерно и погружены в мезофилл двумя слоями уплощённых клеток.
При пассировании каллуса зверобоя (рисунок 3) удалось получить синтез данных желёз в структуре каллуса; при этом накоплено большое количество ДВ, в 1,3 раза превышающее требуемую норму. Каллус не останавливался в росте на 30-е сутки - он продолжал расти, сохранив активное деление.
Рисунок 2 - Морфологическое расположение желёз на листе зверобоя продырявленного
Рисунок 3 - Расположение желёз в каллусе зверобоя продырявленного
Эфирное масло полыни горькой накапливается в капсулах эпидермиса, а также в волосках самого растения. При пассировании каллуса полыни образование данных капсул не столь существенно, как при естественной вегетации, что привело к снижению содержания масла в структуре каллуса. Однако при культивировании каллуса в жидкой среде содержание эфирного масла возросло незначительно.
Выводы
и дальнейшие направления исследования
Доказано, что накопление ДВ в каллусе тканей растений напрямую зависит от донорских органов, из которых получен сам каллус. Фитогормоны зачастую служат активаторами процессов вторичных метаболитов, однако существуют белковые и элиситорные компоненты, способствующие направленному метаболизму в клетках, что требует дальнейших подтверждений.
Отмечено, что количество вторичных метаболитов, накапливаемых в каллусных тканях, в большинстве случаев превышает их содержание в вегетируемых растениях. Условия культивирования подобных клеток, т. е. размещение в стерильной среде, способствуют снижению патогенной нагрузки на организм растений. При отсутствии патогенов синтез вторичных метаболитов будет изолированным и направленным.
Каллусогенез как методика получения биологически активных соединений находит своё применение при производстве некоторых лекарственных веществ из растений. Каллусогенез исследуемых растений - наиболее оптимальный способ выделения многих видов лекарственных соединений из растительного сырья в условиях ЭКД. Данная технология, предполагающая задействование минимальных площадей, позволит наладить в замкнутой экосистеме производство лекарственных компонентов в лечебных и профилактических целях, а также растительного сырья (в сыром или сушёном виде) для приготовления чаёв, настоев, натуральных ароматизаторов.
Литература
1. Unitsky, A. System Foundations of Non-Rocket Near Space Industrialization- Problems, Ideas, Projects/A. Unitsky -Minsk: Gradient, 2021 - 568 p.: il.
2. Безракетная индустриализация ближнего космоса: проблемы, идеи, проекты: материалы III междунар. науч.-техн.
конф., Марьина Горка, 12 сент. 2020 г. / ООО «Астроинженерные технологии», ЗАО «Струнные технологии»; под общ. ред. A3. Юницкого. - Минск: СтройМедиаПроект, 2021. -516 с.
3. Монографии ВОЗ о лекарственных растениях, широко используемых в Новых независимых государствах (ННГ1. -ВОЗ, 2010.-460 с.
4. Государственная фармакопея Республики Беларусь (ГФ РБ II): в 2 т. / М-во здравоохр. Респ. Беларусь, УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ. ред. А.А. Шерякова. - Молодечно: Победа, 2012. -Т. 1: Общие методы контроля качества лекарственных средств. -1220 с.
5. Санталова, ГВ. Респираторные вирусные инфекции: подходы к терапии с позиции клинико-патогенетических аспектов заболевания / Г. В. Санталова, С. В. Плахотникова // Медицинский совет. - 2022. - Т. 16, № 1. - С. 36-41.
6. Фитохимический состав представителей рода Эхи-нацея (Fchinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) / В.Н. Самородов [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - Т. 30, №4. - С. 32-37.
1. Polyphenol-, Mineral Flement Content and Total Antioxidant Power of Sage (Salvia officinalis L.) Extracts/ M. Then [et al.]//XXVI International Horticultural Congress: The Future for Medicinal and Aromatic Plants, Toronto, 11-17 Aug. 2002/Acta Horticulturae. - Toronto, 2004. - P. 123-129.
8. Goodine, T. Corymbia citriodora: A Valuable Resource from Australian Flora for the Production of Fragrances, Repellents, and Bioactive Compounds / T. Goodine, M. Oelgemoller//ChemBioEng Reviews. - 2020. - Vol. 7 No. 6.-P. 170-192.
9. The Biochemical and Genetic Basis for the Biosynthesis of Bioactive Compounds in Hypericum perforatum L, One of the Largest Medicinal Crops in Europe / P. Rizzo [et ai]//Genes. -2020. - Vol. 11, No. 10. - P 1-20.
10. Kano, S. Artemisinin-Based Combination Therapies and Their Introduction in Japan / S. Kano // Journal of Infection and Chemotherapy. - 2010. - Vol. 16, No. 6.-P. 375-382.
