CC BY
129
UNIVERSUM:
ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ
• 7universum.com
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КАЛЛУСНЫХ ЛИНИЙ TRIGONELLA FOENUM-GRAECUM
Логвина Анна Олеговна
ассистент, младший научный сотрудник, Белорусский государственный университет, Республика Беларусь, г. Минск E-mail: [email protected]
Юрин Владимир Михайлович
доктор биол. наук, профессор, Белорусский государственный университет,
Республика Беларусь, г. Минск E-mail: [email protected]
QUALITATIVE ANALYSIS OF PHENOLIC COMPOUNDS IN TRIGONELLA FOENUM-GRAECUM CALLUS LINES
Lohvina Hanna
Assistant Lecturer, Research Assistant, Belarusian State University,
Republic of Belarus, Minsk
Yurin Vladimir
Doctor of Biological Sciences, Professor, Belarusian State University,
Republic of Belarus, Minsk
Изучен качественный состав фенольных комплексов каллусных культур листового и стеблевого происхождения Trigonella foenum-graecum ярового сорта Ovari 4 и озимого сорта PSZ.G.SZ. Установлено, что исследуемые каллусные линии преимущественно накапливают простые по структуре фенольные соединения с низким молекулярным весом, представленные главным образом фенолокислотами и их производными. В составе фенольных комплексов каллусов
АННОТАЦИЯ
Логвина А.О., Юрин В.М. Качественный анализ фенольных соединений каллусных линий Trigonella foenum-graecum // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2015. № 1-2 (11) . URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1911
идентифицированы кофейная, протокатехиновая, гентизиновая, кумаровая кислоты, скополетин, умбеллиферон, герниарин, нарингенин.
ABSTRACT
The qualitative composition of phenolic complexes of leaf- and stem-derived callus cultures of Trigonella foenum-graecum of “spring-summer” variety Ovari 4 and “winter” variety PSZ.G.SZ has been studied. The low-molecular-weight simple phenolics presented mainly by phenolic acids and their derivatives have been found to be predominantly accumulated in the tested callus lines. Caffeic, protocatechuic, gentisic, coumaric acids, scopoletin, umbelliferone, herniarin, naringenin were identified in the phenolic complexes of the calli.
Ключевые слова: пажитник греческий, Trigonella foenum-graecum,
культура клеток, каллус, фенольные соединения, качественный анализ, спектр поглощения, ВЭЖХ/ЭСИ-МС.
Keywords: fenugreek, Trigonella foenum-graecum, cell culture, callus, phenolic compounds, qualitative analysis, absorption spectrum, HPLC/ESI-MS.
Работа выполнена при финансировании Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований (проект № Б13МС-028 от 16.04.2013 г.).
Несмотря на успехи в области применения синтетических лекарств, препараты природного происхождения приобретают все больший вес в практической медицине в связи с обширным спектром их биологической активности, практически полным отсутствием побочных эффектов и экологической безопасностью изготовления. В настоящее время большое внимание уделяется поиску потенциальных источников фенольных соединений главным образом в связи с их выраженной антиоксидантной активностью [11]. Установлено, что свободно-радикальные реакции, вовлечены в патологический процесс при многих заболеваниях человека, включая атеросклероз, рак, ишемическую болезнь сердца, гепатотоксичность, воспаление, диабет,
иммуносупрессию, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания. Именно с антиоксидантными свойствами связывают способность фенольных метаболитов действовать в качестве агентов, проявляющих противораковую, кардиопротекторную, антибактериальную, противовоспалительную, иммуномодулирующую, нейропротекторную активности [9].
Пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum L.) — одно из древнейших культивируемых лекарственных растений. Представляет собой богатый источник разнообразных биологически активных веществ [2, с. 260—262], в том числе метаболитов фенольной природы, обуславливающих многие его активности, среди которых антиоксидантный, гепатопротекторный и антибактериальный эффекты [4; 8; 12]. Применение технологии культуры клеток in vitro может стать перспективным и экономически выгодным способом получения фармакологически ценных фенольных метаболитов пажитника греческого в промышленных масштабах [5]. При этом известно, что биохимический состав нативного растения и полученной на его основе культуры in vitro может значительно различаться. Поэтому проведение качественного анализа целевых метаболитов, синтезируемых клеточной культурой, является важным этапом ее биохимического исследования. Также необходимо учитывать, что происхождение культур in vitro, в частности тип первичных эксплантов и сорт растения, могут в значительной степени определять их биосинтетический потенциал. Для обнаружения наиболее продуктивной культуры целесообразным является увеличение числа тестируемых клеточных линий.
В этой связи целью данной работы было провести сравнительное исследование качественного состава фенольных комплексов каллусных культур пажитника греческого различного происхождения.
Объектами изучения служили листовые и стеблевые каллусные культуры пажитника греческого ярового сорта Ovari 4 (далее ЛКЯС и СКЯС соответственно) и озимой разновидности сорта PSZ.G.SZ. (далее ЛКОС и СКОС соответственно). Культивирование каллусных тканей осуществляли на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга, дополненной 4 %
сахарозы и фитогормонами 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой, кинетином, индолил-3-уксусной кислотой в различных комбинациях [6]. Каллусные линии выращивали в темноте в условиях микробиологического термостата при температуре 24°С.
Предварительный анализ состава фенольных соединений каллусных тканей осуществляли методом оптической спектроскопии. Спектры поглощения 70 %-ных водно-спиртовых экстрактов снимали на спектрофотометре «Cary 50 Bio» (Varian, Австралия) в диапазоне длин волн 200—500 нм с использованием кюветы с толщиной слоя 1 см. С целью детального исследования качественного состава фенольных комплексов готовили этилацетатные фракции 70 %-ных водно-спиртовых экстрактов каллусов, которые разделяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (прибор Latek Laborgerate GmbH, Германия). Использовали колонку “LiChrospereTM 100 RP-d8e”, 250x4 мм, 5 мкм (Merck, Германия). Применяли подвижную фазу состава 0,5 %-ная муравьиная кислота (А) — ацетонитрил (Б). Соблюдали следующий градиентный режим: 0—10 % Б (0—15 мин), 10 % Б (15—30 мин), 10—100 % Б (30—50 мин). Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Для определения молекулярного веса разделенных компонентов использовали масс-селективный детектор (модель Micromass VG Quattro II; Waters, Великобритания) c ионизацией методом электростатического распыления (ЭСИ-МС) в режиме регистрации отрицательных ионов (программное обеспечение MassLynx, version 4.0; Waters, Великобритания).
Спектры поглощения 70 %-ных водно-спиртовых экстрактов каллусов представлены на рисунке 1. Показано, что все исследуемые вытяжки поглощают свет в одинаковой области спектра, типичной для фенолов [1], обнаруживая заметную полосу поглощения в области 260—295 нм. Для кривых поглощения характерно наличие и второй, значительно меньшей по интенсивности, полосы при 300—385 нм, не имеющей заметных максимумов. Практически полная идентичность в спектральных кривых, указывает на сходство в качественном составе фенольных компонентов каллусов пажитника.
По литературным данным, интенсивная полоса поглощения при 200—240 нм объясняется высоким содержанием в экстрактах простых фенолов с боковой цепью в пара-положении или с насыщенными пара-заместителями, поглощающими свет в данной области спектра. Наличие коротковолновой полосы (254—275 нм) с максимумом при 265—270 нм обусловлено присутствием в смеси фенольных кислот. Основной максимум поглощения катехинов также приходится на указанную область спектра.
1 — ЛКОС; 2 — ЛКЯС; 3 — СКЯС; 4 — СКОС
Рисунок 1. Спектры поглощения водно-спиртовых экстрактов каллусных тканей пажитника греческого
Наличие же полос в более длинноволновой части спектра может определяться оптическими свойствами нескольких классов фенолов. В первую очередь флавоноидами, которые обнаруживают основную полосу поглощения при 320—380 нм. Вдобавок, поглощая свет во второй характерной для них полосе (240—270 нм), они в некоторой степени могут усиливать интенсивность поглощения экстрактов в этой области. С6-С3 фенолкарбоновые кислоты демонстрируют основной максимум при 315—325 нм, поэтому также, вероятно, вносят свой вклад в проявление оптических свойств экстрактов. Спектры кумаринов содержат две главные полосы при 278 и 310 нм [1].
Приведенные сведения о спектральных особенностях различных классов фенолов позволяют сделать предположение о том, что доминирующими компонентами в экстрактах каллусных тканей пажитника греческого являются
простые фенолы и Сб-С фенолокислоты. Также в данных пробах могут присутствовать отдельные фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды (возможно, катехины), кумарины, но отсутствие в спектрах выраженных характеристических для данных классов соединений полос может свидетельствовать о низком их содержании.
Согласно результатам проведенной ВЭЖХ/ЭСИ-МС (рисунок 2), наибольшим разнообразием качественного состава фенольного комплекса характеризовался СКЯС — 18 компонентов фенольной природы. В ЛКЯС было обнаружено 15 компонентов, в ЛКОС и СКОС — по 14 соединений исследуемой группы (таблица 1).
Рисунок 2. Хроматограммы ВЭЖХ/ЭСИ-МС этилацетатных фракций водно-спиртовых экстрактов каллусных культур пажитника греческого
В образцах обнаружено 5 компонентов, встречающихся во всех линиях клеток (№ 1, 2, 3, 20, 26). Большинство соединений являются общими для 2-х или 3-х культур из 4-х исследуемых. При этом полифенольные комплексы большей части каллусных линий характеризуются наличием уникальных компонентов, обнаруженных лишь в одной линии клеток. СКЯС содержит 5 компонентов фенольной природы, не встречающихся у других культур in vitro (№ 4, 9, 12, 13, 24). В СКОС обнаружено два уникальных соединения (№ 16 и 19), в ЛКОС — одно (№ 7). В ЛКЯС таких соединений не найдено.
Компоненты, входящие в состав исследуемых образцов, можно классифицировать в зависимости от величины их молекулярной массы (Mr) [10]. На основе литературных сведений о молекулярных массах соединений фенольной природы мы условно разделили данные метаболиты на 2 группы. Так, соединения с молекулярным весом 150—250 а.е.м., скорее всего, будут относиться к простым фенолам: фенолокислотам, спиртам и альдегидам, многим фенолкарбоновым кислотам либо к кумаринам и их производным (первая группа). Молекулярный вес в диапазоне от 250 до 600 а.е.м., как правило, характерен для более сложных веществ фенольной природы, таких как флавоноиды (гликозиды и агликоны), продукты конденсации и гликозиды простых фенолов, ряд фенолкарбоновых кислот (вторая группа). Анализ полученных экспериментальных данных показал, что большая часть компонентов, обнаруженных в тестируемых пробах, имеет молекулярную массу, характерную для фенольных соединений, отнесенных нами к первой группе, среди которых фенолокислоты, спирты и альдегиды, ряд фенолкарбоновых кислот, кумарины.
На основании сведений о времени удерживания, молекулярной массе и масс-спектрах компонентов тестируемых образцов была предпринята их идентификация, позволившая определить такие вещества, как протокатехиновую, гентизиновую, кофейную и кумаровую кислоты, скополетин, умбеллиферон, герниарин и нарингенин.
Таблица 1.
Состав этилацетатных фракций водно-спиртовых экстрактов каллусных
культур пажитника греческого
Номер пика Время удерживания, мин 1 \ Предполагаемое соединение Тип каллусной ткани
и Ч ч и и и о « ч и о « и
1 8,1 181 протокатеховая кислота Мг — 182 а.е.м. + + + +
2 8,9 153 гентизиновая кислота Мг — 154 а.е.м. + + + +
3 9,8 151, 175 — + + + +
4 10,7 165, 175 — — + — —
5 10,9 165, 325 — + — + +
6 12 278, 167 — + + — +
7 12,5 167, 175 — — — + —
8 13,9 179 кофейная кислота Мг — 180 а.е.м. + + + —
9 14,2 191 скополетин Мг — 192 а.е.м. — + — —
10 14,7 153,551 — + — + —
11 15,3 161, 335 умбеллиферон Мг — 162 а.е.м. + + + —
12 16,17 235, 175 герниарин Мг — 176 а.е.м — + — —
13 16,6 163 кумаровая кислота Мг — 164 а.е.м — + — —
14 17,4 205, 163 — + — — +
15 19,6 165, 577 — + + — +
16 20,7 262 — — — — +
17 23 271 нарингенин Мг — 272 а.е.м + + + —
18 24,8 262, 218 — — + — +
19 26 163,426 — — — — +
20 26,3 187 — + + + +
21 30,7 273 — — + + —
22 37,2 167, 343 — — + + —
23 42,24 329 — + — — +
24 42,5 327 — — + — —
25 45,1 265 — + — + +
26 45,7 281 — + + + +
Таким образом, резюмируя результаты качественного исследования экстрактов, можно заключить, что каллусные линии пажитника греческого, преимущественно накапливают простые по структуре фенолы с молекулярной
массой до 250 а.е.м., представленные в первую очередь фенолокислотами и их производными. Данные метаболиты, как правило, в свободном виде в растениях практически не накапливаются, так как вовлекаются в процессы биосинтеза (образование флавоноидов, лигнанов) либо вступают во взаимодействие с другими соединениями (сахарами, кислотами и т. д.) [3]. Их количественное доминирование в исследуемых клеточных линиях, вероятно, является результатом проявления физиологических и биохимических особенностей каллусных тканей, обусловленных, в частности, состоянием дедифференциации, отсутствием организменного контроля, условиями выращивания. Важно отметить схожесть состава фенольных комплексов каллусов пажитника греческого различного происхождения, выражающуюся как в присутствии общих компонентов, так и в направленности синтеза в сторону накопления простых фенольных соединений, что указывает на детерминированность генотипом донорного растения «набора» синтезируемых фенольных метаболитов в исследуемых клеточных линиях. При этом связи качественного состава фенольных комплексов каллусных линий с сортом донорного растения или типом эксплантов не обнаружено.
Список литературы:
1. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. — М.: Изд-во «Мир», 1977. — 240 с.
2. Barnes J., Anderson L.A., Philipson J.D. Herbal medicines (3rd ed). — London: Pharmaceutical Press, 2007. — 710 p.
3. Dixon R., Paiva N.L. Stress-induced phenylopropanoid metabolism // Plant cell. — 1995. — Vol. 7. — P. 1085—1097.
4. Kaviarasan S., Anuradha C.V. Fenugreek (Trigonella foenum-graecum) seed polyphenols protect liver from alcohol toxicity: A role on hepatic detoxification system and apoptosis // Pharmazie. — 2007. — Vol. 62, iss. 4. — P. 299—304.
5. Lohvina H., Yurin V. Fenugreek cell culture in vitro as a potential source of phenolic antioxidants // Scientific enquire in the contemporary world: theoretical basics and innovative approach. Natural sciences. 3rd edition / ed. A. Burkov. — San Francisco, 2014. — P. 8—12.
6. Lohvina H.O., Makai S., Ditchenko T.I. et al. Induction of callus from leaves and stems of Trigonella foenum-graecum varieties // Acta Agronomica Ovariensis. — 2012. — Vol. 54, iss. 2. — P. 29—37.
7. Maxwell S.R.J. Prospects for the use of antioxidant therapies // Drugs. — 1995. — Vol. 49. — P. 345—361.
8. Premanath R., Sudisha J., Lakshmi D.N. et al. Antibacterial and anti-oxidant activities of Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) leaves // Res. J. Med. Plant. — 2011. — Vol. 5, iss. 6. — P. 695—705.
9. Rakesh S.U., Patil P.R., Mane S.R. Use of natural antioxidants to scavenge free radicals: a major cause of diseases // International Journal of Pharm. Tech. Research. — 2010. — Vol. 2, iss. 2. — P. 1074—1084.
10. Shahidi F., Naczk M. Food phenolics: sources, chemistry, effects, applications. — Lancaster: Technomic, 1995. — 331 p.
11. Sies H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants // Experimental Physiology. — 1997. — Vol. 82. — P. 291—295.
12. Subhashini N., Thangathirupathi A., Lavanya N. Antioxidant activity of Trigonella foenum-graecum using various in vitro and ex vivo models // Int. J. Pharm. Pharm. Sci. — 2011. — Vol. 3, iss. 2. — P. 96—102.
