CC BY
20
6. Gavrilov L.A., Gavrilova N.S. Is aging a disease? Biodemographer's point of view. Adv. Gerontol. 2017; 30 (6): 841-842. (In Russ.).
7. Moskalev A.A. Is aging a disease? Geneticist's point of view. Adv. Gerontol. 2017; 30 (6): 843-844. (In Russ.).
8. Golubev A.G. Is aging a disease? Geneticist's point of view: the old age ф disease. Adv. Gerontol. 2017; 30 (6): 845-847. (In Russ.).
9. Myakotnykh V.S. Is aging a disease? Geriatrician's point of view. Adv. Gerontol. 2017; 30 (6): 848-850. (In Russ.).
10. Krut'ko V.N., Dontsov V.I., Khalyavkin A.V., Markova A.M. Natural aging as a sequential poly-systemic syndrome. Front. Biosci. (Landmark Ed.). 2018; 23: 909-920. doi: 10.2741/4624.
11. Jones O.R., Vaupel J.W. Senescence is not inevitable. Biogerontology. 2017; 18 (6): 965-971. doi: 10.1007/s10522-017-9727-3.
12. Khalyavkin A.V., Krut'ko V.N. How regularities of mortality statistics explain why we age despite having potentially ageless somatic stem cells. Biogerontology. 2018; 19 (1): 101-108. doi: 10.1007/s10522-017-9728-2.
13. Rando T.A., Chang H.Y. Aging, rejuvenation, and epigenetic reprogramming: resetting the aging clock. Cell. 2012; 148 (1-2): 46-57. doi: 10.1016/ j.cell.2012.01.003.
14. Kim W.T., Ryu C.J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Rep. 2017; 50 (6): 285-298. doi: 10.5483/BMBRep.2017.50.6.039.
15. Khaliavkin A.V. Influence of environment on the mortality pattern of potentially non-senescent organisms. General approach and comparison with real populations. Adv. Gerontol. 2001; 2: 46-49.
16. Khalyavkin A.V., Yashin A.I. Nonpathological senescence arises from unsuitable external influences. Ann. New York Acad Sci. 2007; 1119: 306-309.
17. Khalyavkin A.V. From macro- to nano-systems and back in search of the primary cause and control of aging. Proceedings of International Conference «Instabilities and control of Excitable Networks: From Macro- to Nano-Systems», 2012; 69-76 (Dolgoprudny). DOI: 10.13140/2.1.4408.0326.
18. Khalyavkin A.V. Phenoptosis as genetically determined aging influenced by signals from the environment. Biochemistry (Moscow). 2013; 78 (9): 1001-1005. DOI: 10.1134/S0006297913090058.
19. Khalyavkin A.V., Krutko V.N. Aging is a simple deprivation syndrome driven by a quasi-programmed preventable and reversible drift of control system set points due to inappropriate organism-environment interaction. Biochemistry (Moscow). 2014; 79 (10): 1133-1135. doi: 10.1134/S0006297914100150.
Сведения об авторе:
Халявкин Александр Викторович - канд. биол. наук, старший научный сотрудник Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН и Института системного анализа ФИЦ ИУ РАН. Москва 119334, ул. Косыгина 4. E-mail: antisenesc@mail.ru
About the author:
Khalyavkin Alexander V. - candidate of biology science, Senior Research Scientist Emanuel Institute of Biochemical Physics of RAS and Institute for Systems Analysis FRC CSC RAS. Moscow 119334, Kosygin St., 4. E-mail: antisenesc@mail.ru
К ВОПРОСУ ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДАННЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГЕРОНТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВОЗРАСТНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
А.Н. Хохлов, А.А. Клебанов, Г.В. Моргунова
Сектор эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.
Ломоносова, Москва, Россия
Широкий спектр появившихся в последнее время эффективных геропротекторных соединений способствовал определенным успехам как отечественного, так и зарубежного здравоохранения в борьбе за увеличение продолжительности жизни человека (правда, пока чаще - продолжительности жизни экспериментальных животных). Среди таких препаратов - короткие пептиды, митохондриальные антиоксиданты, антидиабетические бигуаниды, миметики ограничения питания, модуляторы аутофагии и др. Полученные к настоящему времени данные позволяют полагать, что все эти соединения действительно должны положительно влиять на состояние организма человека и способствовать его долголетию (по-видимому, в основном за счет увеличения средней продолжительности жизни). Однако складывается впечатление, что такие положительные эффекты связаны не столько с влиянием указанных геропротекторов на процесс старения, сколько с их воздействием на различные возрастные (и не только) болезни, которые в настоящее время в основном и определяют смертность в большинстве развитых стран мира. Во многом это связано с получившим в последнее время широкое распространение выбором в качестве контрольных объектов геронтологи-ческих исследований либо животных или людей с определенными патологиями, либо «больных» клеточных культур. Таким образом, все популярные геропротекторы, по-видимому, помогают нам бороться лишь с последствиями старения, не затрагивая его фундаментальные механизмы. В то же время именно их расшифровка могла бы обеспечить как определенный прорыв в борьбе против возрастных болезней, так и значительное увеличение продолжительности активной жизни людей. В связи с этим предлагаются некоторые альтернативные подходы к такого рода исследованиям.
Ключевые слова: старение, геропротекторы, продолжительность жизни, клеточная пролиферация, экспериментальные животные, контрольные группы, ограничение питания, клеточные культуры
ON THE USING OF DATA OF EXPERIMENTAL GERONTOLOGICAL RESEARCH FOR PROPHYLAXIS OF AGE-RELATED DISEASES
A.N. Khokhlov, A.A. Klebanov, G.V. Morgunova
Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
A wide range of effective geroprotective compounds that have appeared recently has contributed to certain successes of both domestic and foreign healthcare in the struggle to increase the life span of humans (although, more often, the life span of experimental animals). Among such drugs are short peptides, mitochondrial antioxidants, antidiabetic biguanides, mimetics of dietary restriction, modulators of autophagy, etc. The data obtained so far allow us to believe that all these compounds really should positively influence the state of the human body and contribute to its longevity (apparently, mainly due to an increase in the average life span). However, it seems that such positive effects are associated not so much with the influence of these geroprotectors on the aging process, but rather with their effect on various age-related (and not only) diseases, which currently mainly determine mortality in most developed countries of the world. In many respects this is due to the choosing, that has recently became widely adopted, as control objects for gerontological research, either animals or people with certain pathologies, or «sick» cell cultures. Thus, all the popular geroprotectors seem to help us fight only the consequences of aging without affecting its fundamental mechanisms. At the same time, it was their decoding that could provide both a definite breakthrough in the fight against age-related diseases, and a significant increase in the duration of active life for people. In this regard, some alternative approaches to this kind of research are proposed.
Key words: aging, geroprotectors, life span, cell proliferation, experimental animals, control groups, diet restriction, cell cultures
Ссылаясь на работы Клайва Маккея, впервые обнаружившего увеличение продолжительности жизни (ПЖ) экспериментальных животных под влиянием ограничения питания [1], ученые часто игнорируют три важных обстоятельства: 1) использованные Маккеем крысы Фишер-344 являются короткоживущими; 2) у этих животных высока частота развития спонтанных опухолей; 3) контрольные животные питались ad libitum, что, по-видимому, не является для них нормой.
XXIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ
Можно полагать, что результаты исследований Маккея определялись не воздействием на фундаментальные механизмы старения, а лишь «удачным» выбором как контрольных животных, так и условий (не совсем благоприятных) их содержания. К сожалению, в последние десятилетия такой подход стал чрезвычайно популярным среди ученых-геронтологов, занимающихся поиском потенциальных геропротекторов. В частности, это касается мышей SAM [2], крыс OXYS [3] и так называемых «шведских» мышей [4]. Можно полагать, что во всех этих модельных системах геропротекторное действие изученных с их помощью соединений определялось лишь тем, что животные не были «практически здоровыми» либо содержались в неблагоприятных условиях. Помимо этого, у них у всех наблюдались проявления окислительного стресса, связанного с усиленным образованием свободных радикалов, а изучаемые потенциальные героп-ротекторы, как правило, обладали антиоксидантными свойствами. В то же время существует точка зрения, согласно которой антиокси-данты проявляют свое геропротекторное действие как раз тогда, когда в экспериментах используются животные с различными патологиями (например, с высокой частотой спонтанных опухолей) или находящиеся в плохих условиях [5].
В частности, известный митохондриальный антиоксидант SkQ1 действовал как геропротектор в экспериментах на так называемых «шведских» мышах с дефектной митохондриальной ДНК-полимеразой [4]. У этих животных значительно увеличена интенсивность образования свободных радикалов со всеми вытекающими последствиями - нарушение функционирования митохондрий, а затем и многих клеточных функций, что, в свою очередь, ведет к патологическим «старческим» изменениям органов и тканей, а также к уменьшению ПЖ. Совсем не очевидно, что антиоксидант таким же образом повлиял бы на нормальных животных. Интересно, что в экспериментах В.Н. Анисимова с соавт. [6] на мышах нескольких линий было обнаружено, что SkQ1 проявляет свое геропротекторное действие только при содержании животных в не очень благоприятных условиях - в виварии, недостаточно хорошо защищенном от инфекционных агентов. При содержании мышей в другом, полностью защищенном от инфекций виварии геропротекторный эффект SkQ1 исчезал.
По-видимому, имеет смысл при проведении экспериментальных исследований потенциальных геропротекторов усилить акцент на оценке ПЖ (причем максимальной/видовой, а не средней, изменение которой может быть никак не связано с влиянием на процесс старения) нормальных высших животных и людей, иначе мы будем относить к этому классу соединений все, что обеспечивает нормальное существование организма, в том числе - воду, пищу, витамины, микроэлементы и т.п. [7].
Хотелось бы также подчеркнуть, что выбор «правильного» контрольного объекта чрезвычайно важен не только в геронтологических экспериментах на животных, но и в цитогеронтологических исследованиях потенциальных геропротекторов на клеточных культурах. В нашей лаборатории мы проводим такое тестирование на модели «стационарного старения», предполагающей идентичность изменений клеток непересеваемой культуры и стареющего многоклеточного организма [8]. При этом «старение» культуры оценивается либо по скорости накопления соответствующих макромолекулярных изменений (главным образом - повреждений ДНК), либо по кинетике вымирания клеток в стационарной фазе роста [9-11]. Эксперименты ставятся, как правило, на культивируемых трансформированных клетках млекопитающих, пролиферация которых остановлена только контактным торможением (никакие специальные воздействия не используются, так что ситуация сходна с той, которая возникает при формировании постмитотических тканей взрослого организма). Нам не кажется оправданным подход некоторых исследователей, которые «состаривали» клетки (как нормальные, так и трансформированные) с помощью агентов или условий культивирования, вызывающих повреждения ДНК. Этот подход был заложен еще в 90-х годах XX века Т. фон Зглиницки с соавт., вызывавшими остановку пролиферации и «старение» нормальных фибробластов человека путем культивирования их в гипероксических (40% кислорода в атмосфере или добавление пероксида водорода в ростовую среду) условиях [12]. Модификация таких «возрастных» изменений какими-либо потенциальными геропротекторами опять-таки, на наш взгляд, является просто «лечением больного», но не воздействием на фундаментальные механизмы старения.
Мы часто слышим от коллег замечания в адрес используемой в нашей лаборатории модели «стационарного старения» клеточных культур в связи с тем, что большинство экспериментов по тестированию геропротекторов проводятся нами на трансформированных, а не на нормальных клетках млекопитающих. Однако такой выбор контрольного объекта представляется нам вполне оправданным по следующим соображениям. Феномен «стационарного»/хронологического старения свойствен самым разным клеткам, среди которых бактерии, дрожжи, цианобактерии, микоплазмы, клетки животных и растений [13]. При этом «репликативный возраст» клеток с неограниченным митотическим потенциалом не изменяется ни от эксперимента к эксперименту, ни в процессе длительного культивирования как с пересевами, так и без пересевов (в рамках модели «стационарного старения»), чего не скажешь о нормальных диплоидных фибробластах, теломеры которых укорачиваются при каждом делении. А от момента посева клеток до входа их в стационарную фазу роста клетки могут поделиться до 10 раз! Таким образом, нормальные клетки, входящие в стадию «плато», будут иметь гораздо больший «репликативный возраст», чем клетки в момент посева, так что дальнейшие их изменения могут определяться не только интересующим нас «стационарным старением». По тем же причинам корректные повторы экспериментов становятся проблематичными (нормальные клетки в массовой культуре непрерывно изменяются со временем). Наконец, часто мы проводим так называемые «поперечные» эксперименты, в которых клетки засеваются в культуральные флаконы через определенные (иногда достаточно большие) интервалы времени, а используются для оценки изучаемых показателей в один конкретный момент, когда у групп флаконов разный «стационарный возраст». Если работать на нормальных фибробластах, «считающих» пассажи, то обеспечить идентичность всех групп посеянных клеток практически невозможно. В данном случае, как говорится, «нельзя войти в одну реку дважды» [7].
Суммируя вышеизложенное, мы полагаем, что для поиска эффективных геропротекторов, обеспечивающих воздействие на фундаментальные механизмы старения, необходимо проводить исследования либо на «максимально здоровых» животных, либо на «максимально стабильных» клеточных модельных системах.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. McCay C.M., Crowell M.F., Maynard L.A. The effect of retarded growth upon the length of life span and upon the ultimate body size. J. Nutr. 1935; 10 (1): 63-79.
2. Takeda T., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence-accelerated mouse (SAM): a novel murine model of senescence. Exp. Gerontol. 1997; 32 (1-2): 105-109.
3. Kolosova N.G., Stefanova N.A., Korbolina E.E. et al. Senescence-accelerated OXYS rats: a genetic model of premature aging and age-related diseases. Adv. Gerontol. 2014; 4 (4): 294-298.
4. Shabalina I.G., Vyssokikh M.Y., Gibanova N. et al. Improved health-span and lifespan in mtDNA mutator mice treated with the mitochondrially targeted antioxidant SkQ1. Aging (Albany NY). 2017; 9 (2): 315-336.
5. Frolkis V.V., Muradian Kh.K. Life span prolongation. Boca Raton: CRC Press, 1991. 427 pp.
6. Anisimov V.N., Egorov M.V., Krasilshchikova M.S. et al. Effects of the mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 on lifespan of rodents. Aging (Albany NY). 2011; 3 (11): 1110-1119.
7. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Morgunova G.V. Anti-aging drug discovery in experimental gerontological studies: from organism to cell and back. Aging: exploring a complex phenomenon. Ed. Sh.I. Ahmad. Boca Raton: Taylor & Francis, 2018. P. 577-595.
8. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Khokhlov A.N. Interpretation of data about the impact of biologically active compounds on viability of cultured cells of various origin from a gerontological point of view. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016; 71 (2): 62-70.
9. Khokhlov A.N., Morgunova G.V. On the constructing of survival curves for cultured cells in cytogerontological experiments: a brief note with three hierarchy diagrams. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015; 70 (2): 67-71.
10. Khokhlov A.N. Which aging in yeast is «true»? Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016; 71 (1): 11-13.
11. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Marotta F., Khokhlov A.N. Culture medium pH and stationary phase/chronological aging of different cells. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017; 72 (2): 47-51.
12. Von Zglinicki T., Saretzki G., Docke W., Lotze C. Mild hyperoxia shortens telomeres and inhibits proliferation of fibroblasts: a model for senescence? Exp. Cell Res. 1995; 220 (1): 186-193.
13. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Morgunova G.V. Does aging have a purpose? Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017; 72 (4): 222-224.
Сведения об авторах:
Хохлов Александр Николаевич - заведующий сектором эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: 8 (495) 939-15-90. E-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru
Клебанов Александр Александрович - научный сотрудник сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел. 8 (495) 939-15-90. E-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru
Моргунова Галина Васильевна - научный сотрудник сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел. 8 (495) 939-15-90. E-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
About the authors:
Khokhlov Alexander Nikolaevich - Head of Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Tel. 8 (495) 939-15-90. E-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru
Klebanov Alexander Alexandrovich - Associate Researcher, Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Tel. 8 (495) 939-15-90. E-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru
Morgunova Galina Vasil'evna - Associate Researcher, Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Tel. 8 (495) 939-15-90. E-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ KLF, PTEN, SUMO1, APOE, SOD2 И SHC1 В ПОКОЯЩИХСЯ КЛЕТКАХ РАЗНОГО «ВОЗРАСТА»: МОДЕЛЬ ТЕСТИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ ГЕРОПРОТЕКТОРОВ
Г.А. Шиловский1, В.В. Ашапкин1, Н.С. Линькова2, В.Х. Хавинсон2, Б.Ф. Ванюшин1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского,
Москва, Россия
2 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург
Изучено влияние физиологически активных олигопептидов AED, KED и KE на уровень экспрессии генов, влияющих на продолжительность жизни (вовлеченных в реакции на окислительный стресс, температуру, доступность пищи и повреждения генома - так называемых «геронтогенов»). Для этого сравнивали уровни экспрессии геронтогенов (представителей семейства KLF, PTEN, SUMO, APOE, SOD и SHC) в клетках, последовательно подвергнутых двум «типам» старения: прошедшим 7 или 14 пассажей репликативного старения и затем еще 7 суток «стационарного» старения, обозначенных, соответственно, как 7Q и 14Q. Уровень экспрессии большинства исследованных генов (за исключением SUMO1 и APOE) в «старых» клетках (14Q) выше, чем в «молодых» (7Q). Действие олигопептидов AED, KED и KE на экспрессию геронтогенов различно и направлено, по-видимому, на оптимизацию функционирования клеток. Исследуемые олигопептиды влияют на уровень экспрессии генов как в «молодых» (7Q), так и в «старых» (14Q) клетках, кроме двух случаев: KED и AED слабо влияют на экспрессию SHC1, и AED не влияет на экспрессию APOE. Наиболее единообразно все три пептида действуют на экспрессию PTEN, снижая ее в «молодых» клетках, и еще сильнее - в «старых». В случае KLF, SOD2 и SHC1 наблюдается обратная картина: все пептиды повышают уровень их экспрессии, причем в молодых клетках сильнее, чем в старых. Полученные данные позволяют предположить, что геропротектор-ные пептиды действуют на клетки по-разному, в зависимости от их пролиферативного статуса, от которого, в свою очередь, зависит способность клеток реагировать на окислительный стресс и повреждения ДНК и скорость накопления таких повреждений. Изучение влияние того или иного препарата на процесс старения, в том числе и клеточного, очевидно, требует предварительной оценки его действия на моделях с различным пролиферативным статусом клеток.
Ключевые слова: пептиды, стволовые клетки, старение, геропротекторы, противовозрастные препараты, клеточное старение, геронтогены
EXPRESSION OF KLF, PTEN, SUMO1, APOE, SOD2, AND SHC1 GENES IN DIFFERENTLY «AGED» QUIESCENT CELLS:
A MODEL FOR TESTING OF SOME GEROPROTECTORS
G.A. Shilovsky1, V.V. Ashapkin1, N.S. Linkova3, V.Kh. Khavinson3, B.F. Vanyushin1*
1 Belozersky Institute of Physico Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia 2 Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St-Petersburg, Russia
Effects of physiologically active oligopeptides AED, KED, and KE on expression of genes affecting the lifespan (involved in responses to oxidative stress, temperature, food availability, and genome damages - so-called «gerontogenes») were studied. The expression levels of gerontogenes (members of the KLF, PTEN, SUMO, APOE, SOD, and SHC families) were compared between cultures of human mesenchymal stem cells subjected sequentially to two «types» of aging: 7 or 14 passages of replicative aging and then 7 more days of «stationary» aging, designated respectively 7Q and 14Q. The expression levels of most genes are higher in «aged» cells (14Q) compared with «young» cells (7Q), except for SUMO1 and APOE. Effects of oligopeptides AED, KED, and KE on the expression of gerontogenes are variable and directed, apparently, to optimization of the cell function. Oligopeptides studied affect gene expression in both «young» (7Q) and «aged» (14Q) cells, except for two cases: KED and AED have little effect on SHC1 expression, and AED does not change APOE expression. Most consistently all three peptides influence PTEN expression, reducing it in «young» cells and even stronger in «aged» cells. An opposite pattern was observed for KLF, SOD2, and SHC1: all peptides increase levels of their expression, the effect being stronger in young cells than in aged cells. We suggest from the data obtained that geroprotective peptides act on cells differently depending on their proliferative status, which, in its turn, affects the ability of cells to respond to oxidative stress and DNA damage, and the rate of accumulation of such damage. Studies of the effects of drugs on aging, including the cellular aging, evidently, require preliminary evaluation of their effects in cell models with variable proliferative status.
Key words: peptides, stem cells, aging, geroprotectors, anti-aging drugs, cell aging, gerontogens
Теоретические разногласия о причинах, механизмах и степени детерминированности процесса старения создают значительные препятствия и методологические трудности для объявления того или иного вещества не только лекарством, но и геропротектором [1]. Отслеживание чувствительных к макромолекулярным повреждениям и окислительному стрессу и зависимых от пролиферативного статуса клеточной культуры показателей представляется важным для изучения действия геропротекторов, так как основные модели клеточного старения, репликативное и «стационарное» (старение покоящихся клеток), в той или иной степени связаны с ограничением клеточной пролиферации [2,3].
Цели и задачи работы. Поскольку перспективы применения стволовых клеток для омоложения растут с каждым годом, их культуры особенно привлекательны для исследований экспрессии генов, связанных со старением клеток и организма в целом.
