CC BY
15
НЕПЕРЕСЕВАЕМАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК КАК МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМОСВЯЗИ РАЗВИТИЯ И СТАРЕНИЯ
(МАТЕМАТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ) А.А. Клебанов, Г.В. Моргунова, А.Н. Хохлов
Сектор эволюционной цитогеронтологии, биологический факультет Московского государственного университета
имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Еще в 80-х годах прошлого столетия в нашей лаборатории была разработана клеточно-кинетическая модель для тестирования геропротекторов, которая базировалась на модифицированном уравнении Ферхюльста-Пирла. Она позволяла описать рост непересеваемой клеточной культуры и на основании экспериментальных данных вычислить ее насыщающую («стационарную») плотность, которая, как было показано, является хорошим показателем биологического «возраста» исследуемых клеток. Кроме того, с использованием данной модели можно было определить скорость размножения клеток, долю неделящихся клеток, а также некоторые другие важные показатели конкретной культуры. Впоследствии мы, наряду с другими авторами, продемонстрировали, что непересеваемые культуры различных клеток в стационарной фазе стареют и вымирают в соответствии с законом Гом-пертца. В то же время складывалось впечатление, что все части кривой, описывающей как рост, так и пребывание клеток в стационарной фазе, а также их дальнейшее вымирание, должны быть взаимосвязаны. Предположительно, эта связь сходна с той, которая существует между развитием многоклеточного организма и его последующим старением (в обоих случаях мы наблюдаем интенсивную клеточную пролиферацию вначале и ее замедление (вплоть до полной остановки) впоследствии, что приводит к старению как организма, так и клеточной культуры). В связи с этим мы попытались разработать математическую модель, описывающую одним уравнением всю «жизнь» непересеваемой культуры клеток от момента посева в культуральный флакон до окончательной гибели в результате «стационарного старения».
Ключевые слова: клеточно-кинетическая модель, математическая модель, аппроксимация, монослойные клеточные культуры, «стационарное старение»
NON-SUBCULTURED CELL CULTURE AS A MODEL SYSTEM FOR STUDYING THE RELATIONSHIP BETWEEN DEVELOPMENT
AND AGING (MATHEMATICAL ASPECTS)
A.A. Klebanov, G.V. Morgunova, A.N. Khokhlov
Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology Lomonosov Moscow State University Moscow, Russia
In order to test geroprotectors, in the 80s of the last century we had developed the cell kinetics model, which was based on the modified Verhulst-Pearl equation. It made it possible to describe the growth of a non-subcultured cell culture and, on the basis of experimental data, to calculate its saturating («stationary») density, which, as was shown, is a good indicator of the biological «age» of the cells being studied. In addition, using this model, it was possible to determine the rate of cell proliferation (cycling time), the proportion of non-dividing cells, as well as some other important features of a particular cell culture. Subsequently, along with other authors, we demonstrated that various non-subcultured cell cultures in the stationary phase grow old and die out in accordance with the Gompertz function. At the same time, it seemed that all parts of the curve, describing both the growth and cell aging in the stationary phase, as well as their further dying out, should be interrelated. Presumably, this relationship is similar to that which exists between the development of the multicellular organism and its subsequent aging (in both cases we observe intensive cellular proliferation at first and its slowing down, until a complete arrest, subsequently, which leads to aging of both the organism and the cell culture). In this regard, we tried to create a mathematical model describing by one equation the entire «life» of a non-subcultured cell culture from the moment of seeding into the culture vessel to their final vanishing as a result of «stationary phase aging.»
Key words: cell kinetics model, mathematical model, approximation, monolayer cell cultures, stationary phase aging
Разработанная в нашей лаборатории еще в 80-х годах прошлого столетия клеточно-кинетическая модель [1] для тестирования геропротекторов базировалась на уравнении Ферхюльста-Пирла [2]:
r t N0Ke m
МО =
где N(t) - численность размножающейся клеточной популяции в момент времени t; N0 - численность популяции в начальный момент
времени; rm - мгновенная рождаемость, которая определяется как dN(t- •—1— при малой плотности популяции, то есть как максималь-
m dt N( t)
но возможное значение r; K - емкость экологической ниши, определяющая высоту «плато» на графике кривой роста. Эта формула позволяла описать рост непересеваемой клеточной культуры и на основании экспериментальных данных вычислить ее насыщающую (»стационарную») плотность, которая, как было показано [3,4], является хорошим показателем биологического «возраста» исследуемых клеток. С использованием данной модели можно было определить скорость размножения клеток r, долю неделящихся клеток NHfl, а также некоторые другие важные показатели конкретной культуры, такие как: а) время удвоения клеточной популяции Тудв, вычисляемое
по формуле: Тудв = -Т-2 ; б) среднюю длительность клеточного цикла Ткц. С учетом того, что не все клетки в культуре делятся, Ткц можно rm
рассчитать по формуле:
In -
2N - N,
нд
Ткц r ,
m
где N - общее число клеток, а NHfl - число неделящихся клеток в изучаемой клеточной популяции. В другой математической модели, предложенной R.G. Absher и P.M. Absher [5], величина Ткц определяется из дифференциального уравнения, учитывающего характеристики конкретной клеточной линии, ее гетерогенность, параметры культуральной среды и условия культивирования.
В рамках клеточно-кинетической модели не рассматривалось, что происходит с клеточной популяцией после достижения «плато». Впоследствии мы, наряду с другими авторами, продемонстрировали, что непересеваемые культуры различных клеток в стационарной фазе стареют и вымирают в соответствии с законом Гомпертца:
», ct -be
f(t) = ae ,
где а - определяет максимальное значение - асимптоту графика функции f(t), b - смещение по оси времени, c - темп роста, то есть масштабирование по оси времени.
XXIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ
Под клеточным старением мы понимаем накопление «возрастных» изменений клеток при замедлении скорости размножения в пределах одного пассажа и дальнейшем их пребывании в стационарной фазе роста. Ограничение клеточной пролиферации, мы считаем основной причиной накопления с возрастом различных дефектов (наиболее важные из них - повреждения ДНК) в клетках и тканях, что приводит к увеличению вероятности смерти.
Складывалось впечатление, что все части кривой, описывающей как рост, так и пребывание клеток в стационарной фазе, а также их дальнейшее вымирание, должны быть взаимосвязаны. Целый ряд данных позволял полагать, что эта связь сходна с той, которая существует между развитием многоклеточного организма и его последующим старением (в обоих случаях мы наблюдаем интенсивную клеточную пролиферацию вначале и ее замедление вплоть до полной остановки впоследствии, что приводит к старению как клеточной культуры, так и организма). В связи с этим мы начали работу по созданию математической модели, описывающей одним уравнением всю «жизнь» непересеваемой культуры клеток от момента посева в культуральный флакон до окончательной гибели в результате «стационарного старения» [6]. На данный момент мы используем усовершенствованное нами уравнение Ферхюльста-Пирла. В дифференциальной форме оно выглядит так:
2 = ^- (1 - (Ф
где N - количество клеток в популяции; tm - точка на оси времени, связанная с окончанием фазы стационарного старения и, соответственно, с началом фазы вымирания; к1 - коэффициент, от которого зависит скорость роста популяции; V - скорость вымирания популяции. Данное уравнение хорошо описывает результаты наших экспериментальных данных, кроме того его параметры имеют биологический смысл. Аппроксимация разработанной формулой результатов экспериментов, направленных на поиск потенциальных геропротек-торов или геропромотеров [7], позволяет сравнивать непосредственно параметры функции, аппроксимирующей динамику контрольной популяции клеток, с аналогичными параметрами функции, аппроксимирующей динамику популяции клеток, в ростовую среду которой добавлено исследуемое вещество. Сравнение функций по параметрам сразу показывает различия в скорости роста культуры, скорости ее гибели, достигнутой максимальной плотности, продолжительности пребывания в стационарной фазе, а это, в свою очередь, позволяет подтвердить или опровергнуть действие исследуемого вещества на клеточную популяцию. В случае если вид графиков, построенных на основе данных из реальных экспериментов, отличается от гипотетического (например, если было взято небольшое количество точек для построение кривой), мы аппроксимируем полученные результаты с помощью доступных готовых уравнений. С использованием этого подхода попробовали обработать результаты, полученные нами ранее.
Обработку результатов проводили с помощью программы в^таРЫ 12. Из всех встроенных в в^таРЫ функций для аппрок-
симации лучше всего подошла функция логарифмически нормального распределения с 4-мя параметрами.
-0,5
У = Уо + ,
где у0 - смещение по оси ординат, х0 - точка на оси абсцисс, в которой функция у(х) имеет максимум, от а зависит величина максимального значения функции, Ь - определяет «остроту пика» на графике функции. При аппроксимации подобными формулами сравнивать их параметры не имеет смысла, так как биологического обоснованных значений они не имеют. Для выяснения отличий мы применили метод [8], в котором строится разностный график двух функций, одна из которых аппроксимирует график контрольной группы, а другая -экспериментальной.
Далее находили стандартные отклонения в тех точках графика, абсциссы которых соответствуют дням проведения подсчетов плотности культур. Далее для каждой точки рассчитывали среднеквадратические отклонения по формуле:
—= Л (А1 + ,
где А1 - разница между значением аппроксимирующей функции в i-й точке и реально посчитанным числом клеток контрольной группы в этой же точке; А2 - то же, но для экспериментальной группы. В случае удачной аппроксимации распределение —должно быть нормальным. Проверить это можно любым способом, например, с помощью теста Шапиро-Вилка или Лиллиефорса. Далее вычислили среднее значение среднеквадратического отклонения.
n
- - 1 У
— = - у —..
n i =1 '
В случае если 68% точек разностного графика отклоняются от оси абсцисс не более чем на — , а 95% не более чем на 1,96 — , можно утверждать, что графики достоверно не различаются. В частности, с использованием данного подхода смогли доказать наличие достоверных различий между контрольными и опытными группами.
Полученные нами результаты показывают, что использование модифицированного уравнения Ферхюльста-Пирла позволяет связать части кривой в связанное целое. Адекватной аппроксимации данных достаточно, чтобы можно было произвести сравнение контрольных и опытных кривых с применением описанного выше метода.
ЛИТЕРАТУРА
1. Khokhlov A.N., Morgunova G.V. On the constructing of survival curves for cultured cells in cytogerontological experiments: a brief note with three hierarchy diagrams. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015; 70 (2): 67-71.
2. Verhulst P.F. Recherches mathematiques sur la loi d'accroissement de la population. Nouv. Мйт. Acad. Roy. Sci. Bruxelles. 1845; 18 (1): 14-54.
3. Хохлов А.Н. Пролиферация и старение. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР, серия «Общие проблемы физико-химической биологии», том 9. М.: ВИНИТИ, 1988. 176 с.
4. Khokhlov A.N. Stationary cell cultures as a tool for gerontological studies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992; 663: 475-476.
5. Absher R.G., Absher P.M. Mathematical models and computer simulations of proliferation of human diploid fibroblast clones. J. Theor. Biol. 1978; 72 (4): 627-638.
6. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Karmushakov A.F., Shilovsky G.A., Nasonov M.M., Morgunova G.V. Testing of geroprotectors in experiments on cell cultures: choosing the correct model system. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2014; 69 (1): 10-14.
7. Rommelaere J., Errera M. The effect of caffeine on the survival of U.V.-irradiated diploid and tetraploid Chinese hamster cells. Int. J. Radiat. Biol. 1972; 22 (3): 285-291.
8. Petersen H., Stockl D., Blaabjerg O., Pedersen B., Birkemose E., Thienpont L., Lassen J.F., Kjeldsen J. Graphical interpretation of analytical data from comparison of a field method with a reference method by use of difference plots. Clin Chem. 1997; 43 (11): 2039-2046.
REFERENCES
1. Khokhlov A.N., Morgunova G.V. On the constructing of survival curves for cultured cells in cytogerontological experiments: a brief note with three hierarchy diagrams. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2015; 70 (2): 67-71.
2. Verhulst P.F. Recherches mathematiques sur la loi d'accroissement de la population. Nouv. Mйm. Acad. Roy. Sci. Bruxelles. 1845; 18 (1): 14-54.
3. Khokhlov A.N. Cell Proliferation and Aging, in Itogi nauki i tekhniki VINITI AN SSSR, seriya «Obshchie problemy fiziko-khimicheskoi biologii» (Advances in Science and Technology, VINITI Akad. Sci. USSR, Ser. General Problems of Physicochemical Biology), Moscow: VINITI, 1988, vol. 9. 176 pp. (In Russ.).
4. Khokhlov A.N. Stationary cell cultures as a tool for gerontological studies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992; 663: 475-476.
5. Absher R.G., Absher P.M. Mathematical models and computer simulations of proliferation of human diploid fibroblast clones. J. Theor. Biol. 1978; 72 (4): 627-638.
6. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Karmushakov A.F., Shilovsky G.A., Nasonov M.M., Morgunova G.V. Testing of geroprotectors in experiments on cell cultures: choosing the correct model system. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2014. Vol. 69. N 1. P. 10-14.
7. Rommelaere J., Errera M. The effect of caffeine on the survival of U.V.-irradiated diploid and tetraploid Chinese hamster cells. Int. J. Radiat. Biol. 1972; 22 (3): 285-291.
8. Petersen H., Stöckl D., Blaabjerg O., Pedersen B., Birkemose E., Thienpont L., Lassen J.F., Kjeldsen J. Graphical interpretation of analytical data from comparison of a field method with a reference method by use of difference plots. Clin Chem. 1997; 43 (11): 2039-2046.
Сведения об авторах:
Клебанов Александр Александрович - научный сотрудник сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: + 7 (495) 939-15-90. E-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru
Моргунова Галина Васильевна - научный сотрудник сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: + 7 (495) 939-15-90. E-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
Хохлов Александр Николаевич - докт. биол. наук, зав. сектором эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: + 7 (495) 939-15-90. E-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru
About the authors:
Klebanov Alexander Alexandrovich - Associate Researcher, Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. Address: School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Phone: + 7 (495) 939-15-90. E-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru
Morgunova Galina Vasil'evna - Associate Researcher, Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. Address: School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Phone: + 7 (495) 939-15-90. E-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru
Khokhlov Alexander Nikolaevich - PhD, DBSci, Head of Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. Address: School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Phone: + 7 (495) 939-15-90. E-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru
ЛАЗЕРНОЕ ЛЕЧЕНИЕ ОСЛОЖНЕНИЙ АНТИГЛАУКОМАТОЗНЫХ ОПЕРАЦИЙ У ПОЖИЛЫХ БОЛЬНЫХ Е.В. Кремкова1, В.В. Новодережкин2, М.Г. Рабаданова1
1 ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова», Москва, Россия 2 Городская клиническая больница № 15 им. О.М. Филатова, Москва, Россия
Цель исследования. Проанализировать возможности лазерных технологий в лечении фибринозного синдрома у пожилых больных перенесших антиглаукоматозные операции.
Материал и методы. Изучены пациенты с ПОУГ с I-III стадией процесса, после ранее проведенных антиглаукоматозных операций, осложнившихся фибринозным синдромом. I группа после фистулизирующих операций, II группа после фильтрующей иридоциклоретракции и III группа после непроникающих антиглаукоматозных операций с последующей лазерной трабекулото-мией. Коррекция фибринозного синдрома выполнялась с использованием YAG-лазера «Оптимум» с длинной волны 1,064 мкм и временем экспозиции 30 нс. Больным осуществлялось комплексное офтальмологическое исследование.
Результаты. Исследован 91 пациент в возрасте от 41 до 83 лет. Лазерная коррекция фибрина осуществлялась в I группе на 28, во II на 33 и в III на 30 глазах. Результаты лечения оценивались на 3, 7, 14, 21 и 30 день после операции. У пациентов воспалительные явления и признаки пролиферации исчезли. ВГД нормализовалось в 93 % случаев. Улучшение функций глаза отмечены у всех пациентов.
Заключение. Предложенная YAG-лазерная коррекция фибринозного синдрома после проведения антиглаукоматозного хирургического лечения обеспечивает стабильное снижение ВГД с купированием воспалительного процесса.
Ключевые слова: первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ), YAG-лазерная коррекция фибринозного синдрома.
LASER TREATMENT OF COMPLICATIONS OF ANTIGLAUCOMATOUS OPERATIONS IN ELDERLY PATIENTS E.V. Kremkova1, V.V. Novoderezhkin2, M.G. Rabadanova1
1 Russian National Research Medical University named after Pirogov N.I., Moscow, Russia 2 Clinical Hospital 15 named after Filatov O.M., Moscow, Russia
Objective. To analyze the possibilities of laser technologies in the treatment of fibrinous syndrome in elderly patients with antiglau-comatous operations.
Material and methods. Patients with POAG with the I-III stage of the process, after previous antiglaucomatous operations complicated by fibrinous syndrome, were studied. I group after fistulizing operations, II group after filtering iridocycloreutraction and III group after non-penetrating antiglaucomatous operations followed by laser trabeculotomy. Correction of fibrinous syndrome was performed with the use of the YAG-Optimum laser with a wavelength of 1,064 microns and an exposure time of 30 ns. The patients underwent complex ophthalmological examination.
Results. 91 patients aged 41 to 83 years were examined. Laser correction of fibrin was performed in Group I at 28, in II on 33 and in III on 30 eyes. The results of the treatment were assessed at 3, 7, 14, 21 and 30 days after the operation. In patients, inflammation and signs of proliferation disappeared. IOP normalized in 93 % of cases. Improvement of eye functions was noted in all patients.
Conclusion. The proposed YAG-laser correction of fibrinous syndrome after antiglaucomatous surgical treatment provides a stable decrease in IOP with the arrest of the inflammatory process.
Key words: primary open-angle glaucoma (POAG), YAG-laser detection of fibrin, YAG-laser correction of fibrinous syndrome
При проведении антиглаукоматозных вмешательств нередко в глазу наблюдается выраженная фибринозная экссудация. Выявлено, что фибрин в полости глаза стимулирует миграцию клеток пигментного эпителия и вызывает их трансформацию в фибробластопо-добные клетки. Это может приводить к формированию эпиретинальных, трансвитреальных и циклитических контрактильных мембран с
