CC BY
5УДК 577.15/.7 + 541.12.035.4 + 612
К вопросу о развитии проблемы эффективности сверхмалых доз биологически активных соединений
И. П. Ашмарин, Е. П. Каразеева, Т. В. Лелекова
ИГОРЬ ПЕТРОВИЧ АШМАРИН — доктор биологических наук, профессор, академик РАМН, заведующий кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Область научных интересов: нейрофизиология, нейропептиды.
119899 Москва, Ленинские горы, МГУ им. М. В. Ломоносова, тел./факс (095)939-33-55, E-mail [email protected]
ЕЛЕНА ПАВЛОВНА КАРАЗЕЕВА — младший научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М. ВЛомоносова. Область научных интересов: нейрофизиология, нейропептиды.
ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА ЛЕЛЕКОВА — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Область научных интересов: физиология сосудов.
Общеизвестно, что проблема эффективности сверхмалых доз (СМД) и концентраций (СМК) биологически активных веществ в экспериментальном плане отличается деликатностью и даже определенной опасностью для репутации ученых, работающих в этой области. Исследования в данном направлении сопряжены с серьезными методическими трудностями. Работая с очень большими разбавлениями веществ, практически невозможно контролировать конечную концентрацию порядка Ю-15—Ю-23 моль/л даже наиболее чувствительными современными методами. При использовании высокоразбавленных растворов чрезвычайно сложно избежать сорбции единичных молекул на стенках посуды. Возможны также сложные взаимодействия вещества с растворителем и даже с некоторыми примесями, содержащимися в применяемых растворителях. Наконец, даже нарушение рутинного требования — смены пипеток на каждом этапе разбавления — ведет к грубым ошибкам.
Еще больше осложняется ситуация при использовании СМД (СМК) веществ в клинических исследованиях. Хорошо известно, что даже простое placebo дает при лечении ряда заболеваний существенный клинический эффект. Для объяснения этого феномена выдвигался ряд серьезных гипотез. Основное объяснение — психотерапевтический эффект введения placebo. Вопрос эффективности малых доз особенно характерен для гомеопатического метода лечения. Многие гомеопатические средства применяются в таких низких разбавлениях, что организм больного практически не имеет шансов подвергнуться воздействию хотя бы одной молекулы соответствующего вещества в процессе лечения. Применительно к такому уровню концентраций (доз) не существует пока сколько-нибудь удовлетворительных объяснений декларируемых эффектов, кроме психотерапевтических.
Все это побуждает к повторному критическому обобщению накапливающихся материалов об эффективности действия веществ в сверхмалых дозах и концентрациях. Ряд обзоров и гипотез в этой области опубликован в 1990-1994 гг. Е.Б. Бурлаковой и соавт. [1], JI.A. Сазановым и С.В.Зайцевым [2], И.П. Ашмари-ным и соавт. [3, 4] и др. Проблеме СМД и СМК были
посвящены международные конференции в Бордо и Москве (1990, 1993 гг.). Настоящая статья является очередным концептуальным обзором, включающим ряд материалов последних лет.
Сверхмалые концентрации и сверхмалые дозы
По мере развития биохимии и фармакологии представления о количественных характеристиках биологически активных веществ, в пределах которых они оказывают воздействие, быстро эволюционируют. Рабочие концентрации целого ряда внутренних биорегуляторов, например пептидов и собственных гормонов, нередко находятся в интервале 10~9— Ю-12 моль/л и даже менее. Эффективные дозы некоторых признанных лекарственных препаратов и токсинов значительно ниже 10~12 моль на 1 кг массы тела (см., например [5, 6]).
Попробуем уяснить, начиная с каких значений концентраций (доз) разумно пользоваться терминами с приставкой «сверх»? По-видимому, такие количественные обозначения целесообразно отнести к концентрациям и дозам, эффективность которых трудно объяснима с позиции современных положений биохимии, молекулярной биологии и физической химии.
Одним из главных критериев оценки эффективной концентрации (дозы) биологически активных веществ может быть сродство клеточных рецепторов к своим лигандам, которое характеризуется, в частности, константой диссоциации К0 лиганд-рецепторного комплекса. В определенных условиях константа К0 соответствует концентрации лиганда, связывающего 50 % присутствующих рецепторов.
Большинство известных лиганд-рецепторных взаимодействий характеризуется К0 в интервале 10~б— 10"12 моль/л. Имеются, однако, сведения о существовании так называемых супераффинных рецепторов, образующих комплексы с К0 менее Ю-12 моль/л. Крайняя ограниченность данных о существовании таких рецепторов связана, по-видимому, не столько с их редкостью, сколько с методическими трудностями их выявления и определения характеристик. Примером
супераффинных рецепторов служит брадикинин. Открытие этих рецепторов стало возможным лишь при использовании особенно «горячих» радиоактивных лигандов. Константа KD для этих рецепторов составляет 7,5 • Ю-13 моль/л [7].
Значительным вкладом в проблему явились исследования C.B. Зайцева с сотруд., установивших существование супераффинных рецепторов опиоидных пептидов с KD около 1СГ14 моль/л [8, 9]. Можно полагать, что в ближайшие годы будут сделаны новые открытия в этой области. Последние достижения позволяют понять эффективность ряда регуляторных соединений в концентрациях порядка 10"15 моль/л, но данные об эффективности концентраций 10~16 моль/л и менее вызывают по-прежнему определенное недоумение и настороженность. Пока можно принять в качестве условного пограничного значения концентрации (разумеется, временного), ниже которого разумно употреблять понятие СМК, — 10~15 моль/л.
Еще труднее определить соответствующее пограничное значение для доз лекарственных веществ. Фармакодинамические закономерности для лекарственных веществ довольно сложные и установить четкое соотношение дозы с эффективными концентрациями вводимых веществ в зоне внутренних «мишеней» крайне затруднительно, а нередко и просто невозможно. Наконец, неясно, какой вклад в конечный эффект вносит начальная концентрация лекарственного вещества в зоне введения. Очевидно, она выше расчетной концентрации (на 1 кг массы тела). Поэтому очень условным эмпирическим ориентиром для СМД можно считать дозы меньшие 10~15 моль на 1 кг массы тела.
Обозначив верхнюю границу СМК и СМД, обратимся к вопросу о нижнем пределе. Здесь опять-таки строгое научно обоснованное определение крайне затруднительно. Можно лишь отметить неподдающуюся истолкованию ситуацию, когда концентрации действующего вещества столь малы, что вероятность встречи рецептора с соответствующим лигандом составляет менее 1%. Если учесть реальный объем внутриклеточных жидкостей, с которыми контактирует рецептор, то можно полагать, что предельно низкие концентрации близки к Ю-20 моль/л, но в особых случаях могут быть и ниже.
Таким образом, на основании приведенных рассуждений за действующие сверхмалые концентрации (дозы) биологически активных веществ можно принять интервал Ю-15—Ю-20 моль/л (моль/кг).
Настоящая статья посвящена рассмотрению данных об эффективности концентраций преимущественно в этом интервале.
Канальный и гуморальный способы передачи информации в организме
Проблема эффективности СМК и СМД связана с наличием двух принципиально различных систем передачи информации в организме — канальной и гуморальной.
Передача сигналов по нервной системе осуществляется по узконаправленным проводникам. Правда, существуют зоны контакта между элементами нервной системы — химические синапсы, которые «приоткрыты» для внешних гуморальных влияний. Однако передача сигнала происходит, как правило, при вы-
бросе в синаптическую щель нейротрансмиттеров и котрансмиттеров в таких количествах, которые временно создают довольно высокие концентрации (наиболее яркий пример — ацетилхолин — до 10~4— 10"5 моль/л). Эти концентрации нет оснований относить к СМК. Такая ситуация характерна и для канальной передачи информации через системы прямых контактов между нервными клетками.
Иначе обстоит дело с гуморальной передачей сигналов, осуществляемой гормонами и другими регуля-торными соединениями через плазму крови, цереброспинальную жидкость, межклеточные среды и т.п. В этом случае способность клетки, клеточной мембраны, рецептора реагировать на чрезвычайно низкие концентрации регулятора приобретает особое значение. Именно в такой системе регуляции широко представлены соединения, эффективные в СМК: Наконец, восприятие внешних химических сигналов — ароматические вещества, феромоны и т.п. — опять-таки требует наличия внешних систем, реагирующих на СМК и СМД.
Системы, необходимые для реализации эффектов СМК и СМД
Можно назвать, по крайней мере, четыре системы, необходимые для реализации эффектов СМК и СМД:
а) каскадные системы, амплифицирующие сигнал;
б) собирательные, конвергентные системы;
в) накопители и транспортеры сигнальных молекул;
г) супераффинные рецепторы.
Каскадные усиливающие системы существуют на молекулярном, клеточном и межклеточном уровнях. Нет необходимости характеризовать здесь хорошо изученные каскадные процессы в рецепторных системах различного типа, когда при воздействии единичных молекул лиганда на каждом последующем этапе его связывания с рецептором внутри клетки образуются промежуточные сигнальные молекулы (вторичные мессенджеры), число которых на много порядков выше, чем на предшествующем этапе. Амплификация сигнала осуществляется и в разветвляющихся нейро-нальных сетях, т.е. на клеточном уровне.
Менее развиты представления о конвергентных системах, реагирующих на единичные сигнальные молекулы. На клеточном уровне основой таких систем служит множество (сотни, тысячи) одинаковых рецепторов на клетке-мишени. Включение любого из них достаточно для физиологического ответа клетки (гипотеза «рецепторного резерва», или избытка связывающих мест и т.п. [2]).
Что касается надклеточного уровня, то особенно показательны центростремительные, собирательные варианты нейрональных систем (см. схему). В таких системах очень большое число однотипных нейронов (обозначенных как нейроны первого порядка — nl) объединены конвергирующей системой связей с нейронами следующего порядка — nil и nlll, которые обеспечивают физиологический ответ. Нейроны nl расположены в определенном общем объеме межклеточной жидкости, причем каждому нейрону соответ вует одинаковый парциальный объем среды. Число сигнальных молекул (СМ) значительно меньше числа нейронов nl.
Схема индукции физиологического ответа малыми концентрациями сигнальных молекул (СМ) посредством возбуждения единичных нейронов первого порядка (nl) с последующей передачей сигнала на "собирательные" нейроны высших порядков (nil, nlll)
Продемонстрируем возможности функционирования такой сигнальной системы. Если, например, принять число нейронов nl близким к 105, а общий объем межклеточной среды, в котором они расположены, равным 1 мкл, то при числе сигнальных молекул ~103 (концентрация порядка Ю-15 моль/л) вероятность вхождения СМ в парциальный объем нейрона будет подчиняться закону редких событий (распределение Пуассона). Приведенное количественное соотношение (103 молекул на 1 мкл) означает, что в каждый момент времени в парциальном объеме среды, окружающей подавляющее большинство нейронов, как правило, не будет ни одной СМ. Однако закон Пуассона позволяет показать, что до 10 из 105 нейронов окажутся в объеме, где находится одна или более СМ. Временная концентрация сигнальных молекул в парциальном объеме нейрона будет, таким образом, значительно большей, чем концентрация их в общем объеме, и приблизится к минимальному значению KD лиганд-рецепторных комплексов. В этих условиях вероятна реакция единичных нейронов первого порядка.
Благодаря системе конвергирующих межнейро-нальных связей, когда возбуждение любого из нейронов первого порядка достаточно для возбуждения нейронов второго, третьего или других высших порядков, достигается конечный физиологический эффект. Заметим, что по современным данным число нейронов первого порядка, которые могут находиться в контакте с одним из нейронов второго или третьего порядка в конвергирующей схеме, может быть очень велико: число синапсов на одном нейроне измеряется сотнями и даже тысячами.
Представленная собирательная, «улавливающая» система иллюстрирует одну из возможностей реализации очень низких концентраций биологически активных веществ даже при взаимодействии с обычными рецепторами, не обладающими супераффинностью по отношению к своим лигандам. По-видимому, только
действием такого рода систем можно объяснить, например, феномен, когда интерлейкин-1 и вещество Р проявляют биологическую активность при концентрации в 103 раз меньшей, чем К0 соответствующих рецепторов [10].
В последние десятилетия собраны обширные данные о различных высокоаффинных акцепторах, которые не являются рецепторами в принятом смысле этого понятия, т.е. они не объединяют в одно надмолекулярное образование участки связывания с лиган-дом и систему первичной реализации сигнала. К таким акцепторам относятся разнообразные транспортные белки плазмы, защищающие пептидные гормоны от деградации на их пути к клеткам-мишеням, белки-акцепторы одорантов и феромонов, белки, способные связывать и временно накапливать стероидные гормоны, и др. [6]. Все они в принципе могут временно накапливать сигнальные молекулы и, мигрируя далее в зону расположения соответствующего рецептора, способствуют его включению даже в условиях, когда первичная концентрация СМ чрезвычайно мала. Высказывалось также предположение о накопительной функции гликолипидов, сопряженных с рядом рецепторов, например церебрози-дов, связывающих энкефалины.
Что касается чрезвычайно высокой чувствительности к одорантам и феромонам, то до сих пор не имеет исчерпывающего толкования факт включения сигнала от клеток, взаимодействующих с этими веществами в концентрациях, допускающих лишь единичные столкновения с клеткой. Известно, однако, что одоранты и феромоны первично взаимодействуют со специализированными молекулами-переносчиками, которые в конечном счете либо доносят СМ до рецептора, либо модифицируются таким образом, что приобретают способность включить рецептор при контакте с ним. К сожалению, даже полуколичественные оценки здесь пока крайне затруднительны.
Для понимания механизмов действия СМК определенное значение может иметь и открытие рецепторов, претерпевающих необратимые изменения (в течение относительно длительного промежутка времени) после взаимодействия с лигандом. Примером могут служить рецепторы, расщепляемые тромбином [11]. Необратимые взаимодействия лиганда ведут к неравновесным процессам, которые могут значительно снизить эффективные концентрации лиганда [1, 2].
Представленный в настоящем разделе материал позволяет в целом наметить пути истолкования эффектов, возникающих при концентрации регуляторов, существенно меньших Ю-12 моль/л. Можно полагать, что сведения о существовании супераффинных рецепторов в сочетании с представлениями о конвергентных, накопительных и транспортирующих системах усиления сигнала позволят в близком будущем дать строгое объяснение эффектов концентрации порядка Ю-15—Ю"20 моль/л.
Экспериментальные данные об эффективности сверхмалых концентраций
Ниже кратко суммирована часть экспериментальных материалов об эффектах СМК в пределах 10"12 —Ю-20 моль/л. При этом основное внимание направлено на такие эндогенные факторы, как регуляторные пептиды. В табл. 1 для многих семейств регуляторных пептидов указаны функции, реализуемые при СМК. Мы считаем, что именно эти функции входят в число наиболее
Примеры минимальных действующих концентраций Смин биологически активных веществ
Вещество
смий, моль/л
Эффект
Ссылка
Пептиды
Эндотелии 10 5 Коронарорасширяющее действие (противопо- [12]
ложное действие при Ю-12 моль/л)
10 2 Коронаросуживающее действие, увеличение [13]
кровяного давления (крыса)
10 0 Бронхоконстрикция (морская свинка) [14]
10 2 Действие на электрозависимые Са2+-каналы [15]
бронхов
10" 3. -10 -15 Стимуляция сокращений лимфатических сосудов [16]
Вещество Р 10- А Стимуляция роста клеток спинного мозга [17]
(в культуре)
АКТГ4.10 (МОНРРС) 10" 2 Рост нейритов спинальных нейронов [18]
Аналог АКТГ4.10 (НОЕ-427) 10- 2 Облегчение реакции пассивного избегания [4]
Мет- и лей-энкефалины 10" 7 МКа-активность, антителообразование (человек) [19, 20]
Мет-энкефалин 10" 4 Модуляция бласттрансформации спленоцитов [8]
(мыши)
Динорфин, (3-эндорфин, морфин 10- 4 Респираторный взрыв нейтрофилов [2]
0-А1а-мет-энкефалинамид 10- 5 Угнетение дыхательного взрыва нейтрофилов [2, 9]
(человек)
Р-Эндорфин 10" 4 10- 18 Активация 1МК-лимфоцитов и антителообразо- [21, 22]
вания (клетки крови человека)
10- 7 Антителообразование (мыши) [23, 24]
р-Эндорфин, мет-энкефалин, РОЕг 10- 4 Продукция хемотаксического фактора [25]
а- и р-Эндорфины, мет-энкефалин 10" Антителообразование (человек) [20]
Вазотоцин 10" Снижение скорости фильтрации в почках [26]
А^-вазопрессин 10- Увеличение концентрации мочи (собака) [27]
10- 3_ -10- 19 Модуляция К+-тока, блокирование Са2+-тока в [28]
мембране нейрона
Соматолиберин 10" Увеличение синтеза мРНК. Выделение гормона [29]
роста (крысы)
Ко-кальцигенин (СОЯР) 10- 0_ -10- 12 Расширение артериол кожи [30]
Брадикинин 10- Модуляция сосудистой проницаемости [31]
Атриопептид 10- Увеличение -уреза (собака) [32]
10- Угнетение выхода ренина из кжстагломеруляр- [33]
ных клеток
Тимозин-оц 10- Ингибирование №+/Н+ обмена в тучных клетках [34, 35]
Кардиоактивный пептид В моллюсков 10- Угнетение двигательного рефлекса (аплизия) [36]
Вазоактивный интестинальный пептид 10- Стимуляция миграции лимфоцитов [37]
Т-активин 10- Стимуляция реакции розеткообразования лим- [38]
фоцитов
Туморнекротический фактор + адриамицин 10- Подавление опухолевых клеток [39]
Интерлейкин-1 10" Продукция интерлейкина-2 в лимфоцитах [40]
Фактор роста опухолей 10" Хемотаксис нейтрофилов [41]
Гормон роста 10- Флуоресценция в мембранах эритроцитов [2]
Форболовый эфир Фенозан
Антиоксиданты 6 Нитрозодиметилмочевина
Вещества
10" 10" 10-
непептидной природы
Модификация биомембран [42]
Влияние на алкогольную интоксикацию [43]
Влияние на активность изолированного нейрона [44] улитки
Ю-24—10~29 Прорастание семян, резистентность клеток [1]
а ГЧК — естественные киллеры. 6 б-Мешл-2-этил-З-оксипиридин, хлоргидрат; 4-окси-3,5-дтретбутил-а-метилбензиламин, хлоргидрат.
Примеры минимальных действующих концентраций Смин регуляторных пептидов на сократительную активность лимфатических сосудов брыжейки крысы
Пептид ^мин » моль/л Инкремент частоты сокращений сосуда в минуту Увеличение амплитуды сокращений Изменение тонуса дилатация констрикция
Ангиотензин Г <10-20 17 ±4,3 +++ 0 +++
Ангиотензин II <10-2° 9 ± 1,1 ++ 0 ++
Амилин 10-13 6 ± 0,9 +++ 0 ++
АКТГ (4_9) (М-О-Н-Р-Р-в) 10-14 19 ± 3,8 ++ +*> +т>
РМЯР(амид) ю-19* 16 ± 2,4 ++++ 0 +++
Производные РМЯР(амид):
НУООРМ1Щамид) Ю-15' 14 ± 3,0 ++++ 0 +++
НУСОРМЯР (ОН) 10-19* 18 ± 4,1 + 0 +
НУССРМЛЦамид) ¡0-17' 12 ± 1,5 + 0 +
УМКР(амид) Ю-16* 7 ± 0,9 + 0 +
ЯР • 2НС1 Ю-15* 6 ± 1,3 + 0 +
Эндотелии -1 <10-20 20 + 1,6 ++ ++++ 0
Тиролиберин 10"18 21 ±4,7 ++++ ++ 0
Дефенсин Ю-'5 11 ± 1,2 +++ ++ 0
Тафцин 10-12 0 - ++ 0
МИФ (Р-Ю^Н2) ю-'8 17 ± 3,1 +++ ++ 0
Брадикинин ю-'8 7 ±0,7 ++++ ++ 0
Фрагмент брадикинина (РРвРЭР; 1 <10-2° 20 ± 4,4 ++++ ++++ 0
Пентагастрин Ю-'3 9 ± 1,1 ++ 0 ++
Аналоги пентагастрина:
ОНО Ю-'3 8 ± 2,0 + 0 0
ЬЯ 261 10-13 8 + 1,7 + 0 0
Простейшие пролинсодержащие пептиды:
в-Р Ю-19 19 ± 3,0 +++ +++ 0
Р-О-Р 10-19 10 ± 1,3 ++ +++т>
Р-в ,0-19 14 ± 2,8 ++
Р-У Ю-'3 15,5 ± 3,9 +++ ++ 0
R-P-G-P(NH2) <10-20 9 ± 0,9 ++++ +++т>
О-Р-О-в 10"16 12 ± 2,1 +++ ++ 0
W-P Ю-17- 8 ± 1,6 ++■ +++ 0
в-Р-Я-Р Ю-'5 13 ± 2,2 + +++ 0
Р-М <10-20 Ю ± 2,9 ++ ++ 0
Р-Р-Р Ю-'6 12 ± 1,2 ++ ++ 0
А-Р 10-18 7 ± 0,9 ++ ++ 0
Р-О-Р-У(ОН) <10-20 12 + 0,8 ++ ++ 0
Р-Ы <10-20 16 ± 3,1 + ++')
0-Р-Я-Р(НН2) <10-20 11 ± 1,0 + ++ 0
Р-Б-Р Ю-'8 10 ±2,1 + ++ 0
Р-Р Ю-'8 11 ± 2,9 + ++ 0
У-Р ,0-19 12 ± 1,6 + + 0
Р-Ь Ю-'8 9 ± 1,1 + + 0
Р-1 10-15 15 ± 2,6 + + 0
Р-8 Ю-15 11 ± 3,2 + + 0
+ стимуляция (+ < 20%, ++ >20 и <35%, +++ а 35 и <50%, ++++ > 50%; активные сосуды; т> — периодическое изменение тонуса. — торможение; * стимулирует только спонтанно
специфических активностей соответствующих пептидов. Сравнение данных табл. 1 с аналогичными материалами, приведенными в предшествующих обзорах, дает основание полагать, что практически в пределах каждого семейства эндогенных регуляторов при углубленном их исследовании можно прогнозировать функции, реализуемые при сверхмалых концентрациях.
Особенно удачной моделью для изучения эффектов СМК пептидов оказалась система мезентериальных лимфатических сосудов in vivo. В соответствующих экспериментах растворы пептидов наносились непосредственно на брыжейку [45—47]. Как видно из табл. 2, характерным эффектом пептидов является стимулирующее влияние на амплитуду и частоту сокращений в минимальных действующих концентрациях порядка Ю-13—Ю-20 моль/л. Кроме того, часть пептидов обладает констрикторным действием, а часть вызывает и дилататорный эффект. Интересно также, что тироли-берин способен вызывать мембранные эффекты в концентрациях Ю-4—Ю-18 моль/л. Так, методом спиновых зондов показано, что действие тиролиберина (10~4—10~18 моль/л) сопровождается снижением микровязкости липидного бислоя на поверхности мембраны эндоплазматического ретикулума клеток печени мыши. Наибольший эффект (35%) отмечен для концентраций Ю-10 и Ю-16 моль/л [48]. На мембране клетки миокарда морской свинки тиролиберин в концентрации Ю-15 моль/л оказывает выраженный ино-тропный эффект (эффект на амплитуду мышечных сокращений) [49].
Особого внимания заслуживают приводимые во многих обзорах данные об особой чувствительности систем восприятия запахов, феромонов и т.п. Например, из расчетов, опубликованных в 1971 г. Кайслин-гом [50], следует, что реакции самцов тутового шелкопряда возникают, когда на одну сенсиллу приходится менее одной молекулы на рецептор.
Противоречия между эффективностью минимальных концентраций регуляторных пептидов и эндогенными их концентрациями в жидкостях организма
Обращает на себя внимание тот парадоксальный факт, что значения эффективных СМК (см. табл. 1) оказываются нередко гораздо ниже тотальных концентраций соответствующих эндогенных регуляторов в плазме крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Как правило, концентрация регуляторных пептидов в жидкостях организма находится в интервале Ю-7— Ю-17 моль/л, а для таких регуляторов, как тафцин, она достигает 4 • Ю-7 моль/л. Сходная ситуация обнаруживается при сопоставлении тотальных концентраций эндогенных регуляторов с теми приращениями концентрации, которые могут возникать при введении извне тех же соединений в дозах, достаточных для физиологического ответа. Расчетные данные для некоторых таких ситуаций представлены в табл. 3. Для объяснения этого противоречия выдвинуты две основные гипотезы.
Первая гипотеза исходит из того, что большинство регуляторных пептидов содержится в плазме крови и ЦСЖ не в свободном виде, а в виде прочных комплексов со специфическими белками-носителями. Ранее были известны лишь нейрофизины — носители вазопрессина и окситоцина. Сейчас набор молекулярных носителей пептидов исчисляется десятками белков [3] и постоянно возрастает. Константа диссоциации К0 комплексов пептидов с белками-носителями, естественно, несколько выше, чем К0 комплексов с соответствующими клеточными рецепторами. В противном случае невозможен был бы переход регуляторных пептидов на рецептор после завершения транспорта их к клеткам-мишеням. Тем не менее значения Кр пептид-белкового комплекса могут быть столь низкими, что реальные концентрации пептидов в плазме будут на несколько порядков ниже тотальной их концентрации.
Таблица 3
Соотношения между физиологически эффективным приращением концентрации пептидов и их тотальной концентрацией
в плазме и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ)
Пептид Уровень концентрации в плазме или ЦСЖ, Ю-12 моль/л Приращение концентрации при экзогенном введении пептида, Ю-12 моль/л Физиологический ответ
Arg-вазопрессин 2+3, плазма (человек, крыса) 0,12-0,18 Подавление диуреза и реакции активного избегания
Ко-кальцигенин (CGRP) 20, плазма (человек) 0,015 Расширение подкожных артериол
Р-Эндорфин 5, плазма (человек) 0,01 Активация ЫК-лимфоцитов, возрастание содержания АКТГ, про-лактина и альдостерона в плазме
75—150, плазма (крыса) 0,3 Ингибирование секреции катехо-ламинов
Холецистокинин 1900-19000, ЦСЖ (крыса) 94 Подавление двигательной активности, модуляция реакции пассивного избегания
Тиролиберин 200—250, плазма (крыса) 0,002-0,0002 Стимуляция сократимости лимфатических сосудов
Тафцин 500000, плазма (крыса) 2 Подавление сократительной активности лимфатических сосудов
Здесь следует остановиться на определении тотальных концентраций регуляторных пептидов в жидкостях организма. В существующих процедурах плазма крови или ЦСЖ, как правило, предварительно обрабатывается депротеинизирующими агентами (этанол, ацетон и др.), которые денатурируют комплексы регуляторных пептидов со своими белками-носителями, что приводит к освобождению пептидов. Если же операция депротеинизации не проводится, то распределение регуляторных пептидов между белками-носителями и специфическими антителами, применяемыми при иммунохимическом определении концентрации, может принимать столь сложные формы, что результат все равно не будет отражать действительной концентрации свободного пептида. Следует признать, что в настоящее время не разработана адекватная процедура, гарантирующая точное определение концентрации свободного регуляторного пептида в жидкостях организма. Таким образом, есть основание считать, что противоречия между данными о тотальных концентрациях регуляторных пептидов и их минимальными эффективными концентрациями обусловлены циркуляцией пептидов не в свободном виде, а в комплексах со специфическими белками-носителями.
Вторая гипотеза, разработанная С.В.Зайцевым и соавт. [2], основана на предположении об адаптации клетки к определенному относительно высокому уровню концентрации вещества и на представлении о существовании быстрой и медленной реакций с добавляемым на этом фоне веществом, эффект которого может быть даже разнонаправленным. Эта гипотеза привлекательна также тем, что позволяет объяснить полимодальные зависимости эффекта от дозы. Авторы представили ряд экспериментальных данных, полученных in vitro в опытах с клеточными суспензиями, хорошо согласующиеся с гипотезой [8, 9], что позволяет считать ее справедливой для ряда ситуаций. Однако большие трудности возникают при распространении этой гипотезы на ситуации in vivo. В организме постоянно имеют место флуктуации средних тотальных концентраций регуляторных веществ и они достигают 3—15%. Поэтому без привлечения первой гипотезы (о роли белков-носителей) не представляется возможным объяснить эффекты изменения концентраций, измеряемых долями процента.
Таким образом, первая гипотеза сама по себе или в сочетании со второй может объяснить феномен эффектов сверхмалых концентраций биорегуляторов на фоне тотальных эндогенных концентраций. Очевидно также, что необходима дальнейшая экспериментальная разработка этого вопроса.
* * *
На основании приведенного рассмотрения экспериментальных данных об эффектах сверхмалых концентраций и доз регуляторных пептидов, некоторых других биологически активных соединений и имеющихся в настоящее время теоретических представлений о природе этого явления можно заключить, что эффекты концентраций в интервале Ю-15— Ю-20 моль/л объяснимы, если допустить раздельное или комплексное действие трех механизмов:
1) функционирование супераффинных рецепторов с KD до Ю-13—10-14 моль/л;
2) действие каскадных механизмов усиления и конвергенции сигнала, особенно эффективных в усло-
виях неравномерного распределения редких сигнальных молекул возле клеток, являющихся первичными мишенями;
3) существование молекул-акцепторов, способных накапливать циркулирующие сигнальные молекулы.
Основное противоречие заключается в проявлении эффектов регуляторных пептидов в концентрации Ю-12—Ю-18 моль/л при наличии средних тотальных концентраций многих из них в плазме крови и ЦСЖ, которые намного выше — Ю-9— 1СГ" моль/л; эффективное приращение концентраций составляет лишь доли процента. Действие столь малых приростов концентраций можно объяснить тем, что тотальные концентрации регуляторных пептидов в жидкостях организма намного выше концентраций свободных пептидов, так как большая часть их транспортируется в виде комплексов со специфическими белками-носителями.
В целом, познание механизмов действия сверхмалых доз и концентраций в интервале Ю-15— Ю-20 моль/л еще не закончено, хотя уже нет оснований относить эти эффекты к категории загадочных.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 96-15-97861).
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков ИВ. Изв. АН СССР. Сер биол., 1990, № 2, с. 184-193.
2. Сазанов Л А., Зайцев С.В. Биохимия, 1992, т. 57, № 10, с. 1443-1460.
3. Ашмарин И.П., Лелекова Т.В., Санжиева Л.Ц. Изв. АН, 1992, № 4, с. 531-536.
4. Wolterink G„ Van Ree J.M., De Wied D. Life Sci., 1991, v. 48 № 2, p. 155-161.
5. Dolly J.O., Poulain В., Maisey E.A. e. a. In: Neurotoxins in neurochemistry. Ed. J.O. Dolly N.-Y.: John Wiley & Sons.
1988, p. 79-99.
6. Розен В.Б., Матарадзе Г.В., Смирнова О.В., Смирнов А.Н. Половая дифференцировка функций печени. М.: Медицина, 1991, 336 с.
7. Leibman С., Bosse R., Escher Е. In: 13-th Amer. Peptide Symp., 1993, Abstract N P346.
8. Zaitsev S. V, Khegai L.A., Kim B.B. e. a. Immunol. Letters, 1992, v. 32, p. 27-30.
9. Efanov A.M., Koshkin A.A., Sazanov L.A. e. a. FEBS Letters, 1994, v. 355, p. 114-116.
10. Rameshwar P., Ganea D., Gascon P. J.Immunol., 1994,
v. 152, № 8, p. 4044-4054. 11 .Coughlin SR. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 9200.
12. Medvedeva N.A., Shaffer R.A., Medvedev O.S., Lewis S.J. Bui. Exp. Biol. Med.(Engl.) 1992, v. 114, № 9, p. 1263-1268.
13. Le Monnier de Gouville A.C., Lippton H.L., Cavero I. e.a. Life Sci., 1989, v. 45, № 17, p. 1499-1513.
14.Payne A.N., Whittle B. Eur. J. Pharmacol., 1988, v. 13, p. 201-206.
15. Advenier C., Sarria В., Naline E. e. a. Br. J. Pharmacol., 1990, v. 100, p. 168-172.
16. Fortes Z.B., Scivoletto R., Garcia-Leme J. Eur. J. Pharmacol.,
1989, v. 170, № 1-2, p. 69-73.
П.Козлова M.B., Ильинский О.Б., Каленчук В.У., Кондри-кова Е.С. Нейрофизиология, 1986, т. 18, № 5, с. 610—615.
18. Van Der Neut R., Bar PR., Sodaar P., Gispen W.H. Peptides, 1988, v. 9, p. 1015-1020.
19. Faith R.E., Liang H.J., Murgo A.G., Plotnicoff N.P. Clin. Immunol, and Immunopathol., 1984, v. 31, p. 412—418.
20. Munn N.A., Lum L.G. Ibid., 1989, v. 52, № 3, p. 376-385.
21. Mathews P.M., Froelich C.J., Sibbit W.L., Bankhurst A. D. J.Immunol., 1983, v. 130, p. 1658-1662.
22. Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.I., Hobbs J.R. Immunology, 1989, v. 65, № 1, p. 47—51.
23. Захарова Л.А., Белевская Р.Г., Михайлова A.A. Бюл. экспер. биологии и медицины, 1988, т. 105, № 1, с. 50.
24. Zakharova L.A., Belevskaya R.G., Yanovskii O.G. Biomed. Sci., 1990, v. 1, № 2, p. 139-143.
25. Brown S. L., van Epps D. E. J.Immunol., 1985, v. 134, p. 3384-3390.
26. Gray D.A., Erasmus T. Am. J. Physiol., 1988, v. 120, p. 231.
27. Baerwolff M„ Bie P. Ibid., 1988, v. 255, № 6, Pt. 2, p. R940-R945.
28. Артемьев И.Ю., Даринский Ю.А., Сологуб М.И., Ложкина Т.К. Бюл. экспер. биологии и медицины, 1991, т. 111, № 2, с. 115-116.
29. Gick G.G., Zeytin F.N., Brazean Р. е. a. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, № 5, p. 1553.
30. Brain S.D., Williams T.J., Tippins JR. e. a. Nature, 1985, v. 313, № 3, p. 54-56.
31. Игнатьева И.Р., Чернух A.M., Гомазков O.A., Горизонтова М.П. Патол. физиол. и экспер. терапия, 1982, т. 2, с. 91.
32. Cemacec P., Mathier Е., Crawhall J.C., Levy М. Am. J. Physiol., 1988, v. 255, p. R929-R935.
33. Kurtz A., Bruna R.D., Pfeilschifler J. e. a. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, v. 83, p. 4769-4773.
34. Струкова C.M., Киреева Е.Г., Спирова C.M. и др. Биохимия, 1989, т. 306, № 1, р. 229-232.
35.Dugina T.N., Strukova S.M., Khalgatyan C.V., Ashmarin LP. Byull. Eksperim. Biologii i Med., 1992, v. 114, № 9, p. 260.
36. Cawtrope D., Higgins A., Lukowiak K. Can. J. Physiol, and Pharmacol., 1989, v. 67, № 5, p. 89.
37. Bondesson L., Norolind K, Liden S. e. a. Acta Physiol. Scand., 1991, p. 477-481.
38. Гладышева Т.Е., Конрадов A.A., Лебедев K.A. Биофизика,
1989, т. 34, № 5, p. 833-834.
39. Saint J., Tsuchitani Т., Zighelboim J., Bonavida B. In: Ultra Low Doses. Ed. C, Doutremepuich, London, Washington, DC, Taylor & Francis, 1991, p. 27.
40. Klamet J.P., Kem D.E., Dower S.К. e. a. J. Immunol., 1989, v. 142, № 7, p. 2187-2191.
41. Reibman J., Meixler S., Lee T.C. e. a. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, № 15, p. 6805-6809.
42. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева Е.Л., Пы-нзарь Е.И. Биологические мембраны, 1992, т. 9, № 2, с. 810-820.
43. Золотая Р.Д., Миненкова У.А., Евсеенко Л.С. Изв. АН СССР. Сер. биол., 1990, т. 2, с. 302-308.
44. Бурлакова Е.Б., Терехова С.Ф., Греченко Т.Н., Соколов Е.Н. Биофизика, 1986, т. 31, № 5, с. 921.
45. Лелекова Т.В., Романовский П.Я., Александров П.Н., Ашмарин И.П. Бюл. экспер. биологии и медицины, 1989, т. 108, № 7, с. 8-10.
46. Lelekova T.V., Sanzhieva L.Ts., Ashmarin LP. Biomed. Sci.,
1990, v. 1, № 1, p. 99.
47. Lelekova Т. V. Reports of 2nd International Congress on Ultra Low Doses. Bordeaux, 1-2 Oct., 1993, p. 35.
48. Bogdanova N.G., Palmina N.P. Reports of Congress «Magnetic resonance in chemistry and biology», Suzdal's, 1998, P-51a, p. 152.
49. Hasegawa J., Hirai S., Kotake H. e. a. Endocrinology, 1988, v. 123, p. 2805-2811.
50. Kaissling K.-E. In: Handbook of sensory Physiology. 1971, Bd.. IV, P. I, Berlin. S. 351-431.
УДК 577.15/.17 + 541.12.035.4
Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах
С. В. Зайцев, А. М. Ефанов, JI. А. Сазанов
СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ЗАЙЦЕВ — доктор химических наук, профессор Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ и сотрудник департамента молекулярной медицины Каролинского медицинского университета. Область научных интересов: рецепторно-ферментные системы, механизмы регуляции клеточной активности.
Стокгольм, 171 77, Швеция (Department of Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 17177 Stockholm, Sweden). E-mail [email protected] и [email protected]
АЛЕКСАНДР МИХАЙЛОВИЧ ЕФАНОВ — кандидат химических наук, научный сотрудник Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ и сотрудник департамента молекулярной медицины Каролинского медицинского университета. Область научных интересов: механизмы регуляции клеточной активности.
ЛЕОНИД АЛЕКСЕЕВИЧ САЗАНОВ — кандидат физико-математических наук, сотрудник лаборатории молекулярной биологии MRC (MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills road, Cambridge CB2 2QH, U.K.). Область научных интересов: структура и функция мембранных белков.
Парадоксальные эффекты воздействия сверхмалых доз (СМД, Ю-18—Ю-14 М ) биологически активных соединений привлекают значительный интерес исследователей в области биохимии, физиологии, фармакологии. Биоэффекты под действием СМД наблюдаются среди самых разных групп веществ — гормонов и регуляторных пептидов (в том числе опиоидных), некоторых веществ непептидной природы. Неожидан-
ным в данном случае оказался как сам факт проявления эффектов СМД (действующие концентрации на 4—6 порядков ниже минимальных наблюдаемых констант диссоциации лиганд-рецепторных комплексов Кв - Ю-10—Ю-11 М [1—4] и потому не должны были бы давать отклик), также необычны закономерности, характерные для действия СМД (полимодальная дозо-вая зависимость и др.).
