CC BY
3Эффекты сверхмалых доз на разных уровнях организации биообъектов
УДК 577.325 + 577.15
Модификация активности протеинкиназы С лигандами в сверхмалых концентрациях. Роль протеинкиназы С и ее эффекторов
в процессах пероксидного окисления
Н. П. Пальмина, Е. J1. Мальцева, Е. И. Пынзарь, Е. Б. Бурлакова
НАДЕЖДА ПАВЛОВНА ПАЛЬМИНА — доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник Института биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН (ИБХФ РАН). Область научных интересов: мембранология.
117977 Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН, тел. (095)939-73-51, факс (095)137-41-01, E-mail npalm @sky. chph. ras. ru
ЕЛЕНА ЛЬВОВНА МАЛЬЦЕВА — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ИБХФ РАН. Область научных интересов: структура мембраны.
ЕЛЕНА ИВАНОВНА ПЫНЗАРЬ — кандидат биологических наук, сотрудник Института биологических исследований, г. Осака. Область научных интересов: липидология.
К середине 90-х годов накопилось довольно много информации о чрезвычайно высокой чувствительности биологических объектов различной степени сложности к химическим и физическим факторам. Соответствующий эффект проявляется на уровне сверхмалых доз воздействия. Так, многие живые системы способны реагировать на присутствие биологически активных веществ — гормонов, пептидов, ядов, пестицидов, антиоксидантов и других агентов в концентрациях менее Ю-12 М[ 1—6].
В основном предшествующие наблюдения эффекта сверхмалых доз касались сложных биологических систем — от клеточных популяций и целостных организмов вплоть до биологических мембран [7—10]. Во всех этих объектах присутствуют системы вторичных посредников, способные многократно усиливать сигнал на сверхмалые воздействия. В связи с этим для подтверждения существования эффекта сверхмалых доз чрезвычайно важно было обнаружить его на молекулярном уровне, например, как проявление модификации активности фермента.
Для проведения соответствующих исследований, представленных в настоящей статье, в качестве объекта воздействия сверхмалых доз (СМД) был выбран фермент протеинкиназа С.
Протеинкиназа С, открытая Нишизукой и его коллегами [11 — 13], охарактеризована как Са2+-зависи-мый и липид-требующий фермент фосфатидилино-зитного цикла. Протеинкиназа С фосфорилирует ряд мембраносвязанных и цитоплазматических белков [14, 15] и рассматривается как важнейшее звено в системе трансмембранной передачи физиологического сигнала при многих кратковременных и долговременных клеточных ответах, включая пролиферацию и трансформацию клеток [16—19].
Установлено, что нормальное функционирование большинства из одиннадцати изоформ протеинкиназы С требует присутствия фосфатидилсерина [17— 22]. Важнейшим природным активатором протеинкиназы С является 5л-7,2-диацилглицерол [11—17], некоторые ее изоформы испытывают стимулирующее влияние фосфатидилинозитолтрифосфата [23]. Фермент активируется и свободными ненасыщенными жирными кислотами, эффект наблюдается даже в отсутствие фосфатидилсерина и Са2+, хотя в их присутствии уровень активации выше [24, 25].
Эффекторами протеинкиназы С являются также лизофосфатидилхолины и их производные, которые в низких концентрациях активируют, а в высоких — ингибируют фермент [25, 26]; продукты гидролиза сфинголипидов — сфингозин и лизосфинголипиды обладают ингибирующим действием [27, 28].
Влияние системы пероксидного окисления липцдов на активность протеинкиназы С
Имеются указания на то, что процессы клеточной пролиферации и дифференцировки наряду с управляющим воздействием на них специфических регуляторов контролируются работой системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах [29, 30], поэтому представляло интерес изучить зависимость активности протеинкиназы С от концентрации первичных продуктов окисления фосфолипи-дов и арахидоновой кислоты (содержится в липидах) — диеновых конъюгатов [28].
Установлено, что первичные продукты окисления действуют как ингибиторы данного фермента. Обнаружена положительная кинетическая кооперативность ферментативной реакции по этим ингибиторам: ко-
эффициент Хилла (индекс кооперативное™) составляет более единицы (соответственно 1,75 и более 4 для фосфолипидов и арахидоновой кислоты). Показано, что уравнение Хилла для ингибиторов выполняется в случае фосфолипидов и не соблюдается для арахидоновой кислоты. На примере последней определено, что повышение кооперативности (увеличение коэффициента Хилла) происходит при изменении степени окисленности в очень узком интервале (15—22%). Обнаружено, что сродство фермента к первичным продуктам окисления фосфолипидов различно: у продуктов окисления фосфатидилэтаноламина и фосфа-тидилинозита оно приблизительно в 2 раза выше, чем у фосфатидилсерина, что соответственно в 5—10 раз больше, чем к диеновым конъюгатам из арахидоновой кислоты.
Таким образом, первичные продукты окисления фосфолипидов и свободных ненасыщенных жирных кислот являются ингибиторами протеинкиназы С. Их взаимоотношения с ферментом носят характер положительной кинетической кооперативности, что свидетельствует о регуляторном действии этих веществ на фермент.
Выяснению вопроса о механизме ингибирующего эффекта посвящено несколько кинетических исследований [31—33], которые привели к заключению о том, что первичные продукты окисления липидов — диеновые конъюгаты являются ингибиторами протеинкиназы С смешанного типа. Очищенные гидроперокси-ды обладают свойством как ингибировать фермент в концентрациях, соответствующих концентрациям диеновых конъюгатов в фосфатидилсеринах, так и активировать его при воздействии в более высоких концентрациях (Ю-4 М) [28, 31, 34].
Приведенные выше данные позволяют рассматривать протеинкиназу С как пероксилипидзависимый фермент.
Действие природного антиоксиданта а-токоферола на протеинкиназу С
Одним из важнейших параметров системы регуляции ПОЛ в биологических мембранах является концентрация природных антиоксидантов [29, 30]. К наиболее эффективным природным антиоксидантам относится а-токоферол (витамин Е), предотвращающий окисление липидов за счет взаимодействия со свободными радикалами и стабилизации структуры мембраны [35—37]. К началу наших работ были отдельные указания на то, что а-токоферол может ингибировать протеинкиназу С [38, 39 ].
-12 -8 Igia-ТФ]
Рис.1. Зависимость степени ингибирования протеинкиназы С от концентрации a-токоферола [a-ТФ]
Исследование влияния a-токоферола на активность протеинкиназы С в широком интервале концентраций (Ю-17—Ю-2 М) в опытах in vitro позволило установить, что этот антиоксидант действительно является ингибитором данного фермента [40]. Зависимость активности фермента от концентрации a-токоферола (рис. 1) имеет бимодальный характер с максимумами в областях концентраций 10"11 —10"15 М и 10~4—10~6 М, ингибирование фермента в этих областях составляет 60—80%. Результаты исследований при физиологических концентрациях (Ю-6—Ю-4 М) совпадают с данными, приведенными в работах [38, 39].
Форма полученной кривой типична для закономерностей, описывающих действие веществ в СМД: максимум в области высоких концентраций, резкое снижение эффекта или его отсутствие («зона молчания») и второй максимум в области сверхмалых концентраций [41, 42].
С целью сравнения эффективности ингибирования протеинкиназы С в обычных, физиологических и сверхмалых дозах a-токоферола был проведен расчет кинетических параметров фермента на основании экспериментальной зависимости его активности от концентрации субстрата гистона Н-1 в присутствии Ю-4 и Ю-14 М антиоксиданта [31, 33]. Анализ полученных данных (см. таблицу) позволяет дать оценку влияния a-токоферола в широком интервале концентраций на эффективность (каталитическую активность) протеинкиназы С. Положительная кинетическая кооперативность наблюдается только в случае низких концентраций эффектора (Ю-14 М) — коэффициент Хилла составляет 1,7, т.е. превышает 1. При
Таблица
Кинетические параметры протеинкиназы С при действии a-токоферола in vitro
Параметры: коэффициент Хилла (по субстрату) пц; показатели сродства фрагмента к субстрату [So,5] — концентрация субстрата (лиганда), связанного на 50% ферментом, и константа Михаэлиса (кажущаяся) Кщкаж)| максимальная скорость реакции VmKt. (V °макс — без эффектора, V ингмакс — в присутствии препарата); мольное соотношение компонентов реакции протеинкиназа С : a-токоферол : фосфатидилсерин, ПКС : a-ТФ : ФС
Концентрация эффектора, М пн [So,5], ЛГм(каж). мкЛ/ V 'макс* Ю-12 моль/(мг • мин) ув / ринг ' макс / ' макс ПКС : a-ТФ : ФС
Контроль 1,0 0,08 ± 0,01 1700 — 1 : 0 : 300
Ю-4 1,0 0,17 ± 0,03 240 7 1 : 4000000 : 300
Ю-Н 1,9 ±0,2 0,081 + 0,04 320 5 2500 : 1 : 800000
высоких концентрациях (10~4 М) и в отсутствие эффектора коэффициент Хилла равен 1, следовательно, в этих случаях кинетическая кооперативность не осуществляется. Сродство фермента к субстрату в зависимости от концентрации а-токоферола различно: константа Михаэлиса Ам(каЖ) при концентрации антиок-сиданта Ю-4 М в два раза больше величины [S0 5], характеризующей сродство к ферменту в случае проявления кинетической кооперативное™ при концентрации а-токоферола Ю-14 М, и константы Км для реакции в отсутствие антиоксиданта.
Таким образом, сверхмалая концентрация антиоксиданта не изменяет сродства фермента к субстрату, в то время как высокая доза уменьшает его в два раза. Высокая доза ингибитора более существенно, чем низкая, снижает максимальную скорость реакции фосфорилирования (в 7 и 5 раз, соответственно).
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что а-токоферол в высоких концентрациях действует как ингибитор смешанного типа, а в сверхмалых концентрациях как аллостерический эффектор. Более того, в качестве регулятора фермента он более эффективен в сверхмалых концентрациях благодаря положительной кинетической кооперативности с коэффициентом Хилла, близким к 2, и в два раза большему сродству протеинкиназы С к гистону Н-1. Иными словами, сверхмалые дозы а-токоферола увеличивают чувствительность фермента к субстрату. Согласно расчету мольное соотношение компонентов реакции фосфорилирования — протеинкиназы С, а-токоферола и фосфатидилсерина составляет для концентраций антиоксиданта-ингибитора 10~4 и 1(Г14 М 1: 4000000 : 300 и 2500 : 1 : 800000, соответственно, т.е. в случае сверхмалой концентрации а-токоферола одна его молекула воздействует на 2500 молекул фермента.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что а-токоферол в широком спектре концентраций является ингибитором протеинкиназы С и меняет кинетические параметры фермента.
Действие синтетического антиоксиданта фенозана на протеинкиназу С
В качестве эффектора протеинкиназы С был исследован также синтетический антиоксидант из класса экранированных фенолов*. Фенозан — сильный антиоксидант, имеющий высокую антирадикальную активность и обладающий широким спектром биологического действия [43].
Было изучено влияние фенозана (калиевая соль) на активность протеинкиназы С в нормальных и опухолевых клетках, растущих в культуре, т.е. в условиях, приближенных к in vivo. В качестве биологических моделей были выбраны гладкомышечные клетки аорты крыс (VSMC), на которых ранее был показан эффект а-токоферола [38, 39, 44], и клетки остеосаркомы человека (Saos-2), характеризующиеся ярко выраженными опухолевыми свойствами. Антиоксидант вводили в клеточные культуры в концентрации от Ю-4 до Ю-20 М. Действие данного антиоксиданта сравнивали с влиянием наиболее сильного активатора протеинки-
-14 -10 МФК]
600
Работа выполнена в лаборатории проф. А. Ацци (Институт биохимии и молекулярной биологии, Университет, г. Берн, Швейцария) Е. Л. Мальцевой совместно с д-ром Д. Боско-бойником.
-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 ОДФК]
Рис. 2. Зависимость степени активации протеинкиназы С от концентрации фенозана (калиевая соль) [ФК], добавленного к гладкомышечным клеткам аорты крыс (в) и к опухолевым клеткам остеосаркомы человека (б), растущим в культуре.
Штриховая кривая — действие форболового активатора
назы С — 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата в эффективной его концентрации — 10~7 М [45].
Обнаружено, что фенозан действует как активатор протеинкиназы С. Зависимость изменения активности фермента от концентрации фенозана, добавленного к культуре клеток УБМС, носит ярко выраженный бимодальный характер, два острых максимума соответствуют концентрациям Ю-7 и Ю-18 М (рис. 2а).
Степень активации фермента при этих концентрациях фенозана приблизительно одинакова и составляет 400%. Между максимумами находится «зона молчания», которая охватывает примерно пять порядков концентрации эффектора: от Ю-10 до Ю-14 М. В данной концентрационной области активность протеинкиназы С близка к базальной. Стимулирующий эффект активатора сравнения значительно ниже и составляет ~ 170%.
Таким образом, фенозан в концентрациях Ю-7 и Ю-18 М по своему эффекту значительно превосходит известный форболовый активатор протеинкиназы С и может рассматриваться как суперактиватор данного фермента.
По отношению к опухолевым клеткам 8ао5-2 кривая «доза-эффект» подобна бимодальной в интервале концентраций от Ю-4 до Ю-9 М (рис. 26). При этом степень активации фермента составляет 500% при самой большой из исследованных концентраций — Ю-4 М и 300% при сверхмалой его концентрации — 10"19 М. Необходимо отметить, что в случае опухолевых клеток была обнаружена не просто «зона молчания», а «мертвая зона», в пределах которой активность фермента равна нулю. Эта зона лежит в интервале концентраций фенозана от Ю-13 до Ю-17 М. Кроме
того, между «мертвой зоной» и максимумом при большой концентрации антиоксиданта (Ю-10—Ю-6 М) имеется область с относительно высокой и стабильной активностью фермента.
Отмеченные различия в характере дозовых зависимостей активности протеинкиназы С возможно связаны с тем, что одна из культур используемых клеток является опухолевой. Именно для опухолевых клеток такая растянутая по шкале концентраций кривая предсказана в математической модели клеточного цикла, основанной на анализе изменений физико-химических параметров плазматических мембран нормальных и опухолевых клеток [46].
Таким образом, в действии синтетического и природного антиоксидантов на протеинкиназу С обнаруживается, с одной стороны, аналогия дозовых зависимостей — бимодальный характер с максимумами в области обычных, физиологических и сверхмалых доз, с другой стороны, противоположный знак проявляемого эффекта: а-токоферол ингибирует фермент, а фенозан стимулирует его активность.
Соответственно возникает вопрос, почему продукты пероксидного окисления липидов и антиоксидант а-токоферол являются ингибиторами, а антиоксидант фенозан проявляет свойства суперактиватора фермента. Пока мы не можем ответить на такой вопрос, это предмет для дальнейшего изучения. Но на данный момент установлена принципиальная возможность модуляции активности протеинкиназы С антиокси-дантами в сверхмалой дозе — чрезвычайно важный факт, свидетельствующий о том, что эффект СМД может проявляться и на простых системах на молекулярном и клеточном уровнях.
Действие форболового активатора протеинкиназы С на систему пероксидного окисления лниидов мембран эндоплазматического ретикулума
Известно, что форболовые эфиры являются активными модуляторами систем вторичных посредников, которые локализованы в клеточной мембране [47—49]. Для некоторых из них, например, 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА), про-теинкиназа С является рецептором, а сам ТФА эффективно активирует фермент [50, 51]. Поскольку, как показано выше, концентрация антиоксидантов и состав липидов биологических мембран имеют существенное значение для проявления протеинкиназой С своей активности, а также для функционирования локализованных в них рецепторов [52, 53], представляется важным изучение вопроса о возможном влиянии форболовых эфиров на систему пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах, регулирующую именно эти свойства.
Действие форболового эфира было исследовано в широком спектре концентраций (Ю-3—Ю-16 М). Установлено [54], что ТФА ингибирует процесс ПОЛ; дозовая зависимость степени ингибирования (рис. 3) носит экстремальный характер с максимумом при 10"13—Ю-9 М, т. е. при весьма низких концентрациях.
Известно, что субстратом ПОЛ в биомембранах являются фосфолипиды, а именно, входящие в их молекулу ненасыщенные жирные кислоты. Способность смеси липидов к окислению определяется во многом степенью их ненасыщенности, отсюда следует
ОДТФА]
Рис. 3. Зависимость степени ингибирования пероксидного окисления липидов мембран эндоплазматического ретикулума от концентрации форболового эфира [ТФА]
также, что по мере окисления доля ненасыщенных липидов уменьшается. Действительно, в процессе ПОЛ происходит резкое снижение количества двойных связей на 1 мг липидов, а добавление ТФА тормозит этот процесс. Константы скорости расходования ненасыщенного субстрата, вычисленные в работе [54], составляют в контроле и в присутствии Ю-12 М ТФА соответственно 4,46- Ю-2 и 1,7* Ю-2 мин-1, т.е. различаются более, чем в два раза.
Существенное влияние на константу скорости расходования ненасыщенного субстрата характерно для веществ, изменяющих структурную организацию липидов и таким образом воздействующих на скорость радикальных стадий инициирования, продолжения и обрыва цепи. В связи с этим было исследовано изменение микровязкости липидной компоненты плазматических мембран клеток печени под влиянием ТФА in vitro. Для картирования мембраны были использованы три иминоксильных стабильных радикала (зонды I, II, III), локализующихся в различных областях ли-пидного бислоя мембраны [55].
На рис. 4 приведены кривые изменения времени вращательной корреляции тс зондов I, II, III (имеющего смысл времени переориентации зонда на угол я/2) в зависимости от концентрации форболового эфира. Видно, что под действием этого агента тс зондов I и II возрастает, а зонда III уменьшается. Наибольшие отклонения от нормы обнаруживаются в области концентраций от Ю-15 до Ю-10 М для зондов I, II и от Ю-15 до Ю-8 Мдля зонда III.
Аналогичные данные были получены при исследовании влияния ТФА в сверхмалых концентрациях на микровязкость липидного бислоя при использовании в качестве зондов двух диоксильных стабильных радикалов с различной длиной жирнокислотной цепи [56]. Во всех случаях максимальный эффект наблюдался при сверхмалых концентрациях ТФА.
Таким образом, форболовый эфир является для плазматической мембраны модификатором двойного действия: под его влиянием поверхностные слои липидов (локализация зондов I и II) становятся более жесткими, а более гидрофобные области липидов (локализация зонда III) увеличивают свою текучесть. Подобное изменение в структурной организации мембраны может отразиться как на параметрах пероксидного окисления липидов, так и на взаимодействии протеинкиназы С с мембраной.
__ -V
С7Н|5-С-0—{ N—О' зонд i
г
н
зонд II
С15Н31 с о
Л:
зонд III
-14 -10 -6 ^[ТФА]
Рис. 4. Изменение времени вращательной корреляции тс зондов I, II, III в плазматических мембранах клеток печени в ста от концентрации форболового эфира
Необходимо подчеркнуть, что ТФА ингибирует окисление липидов только в биомембранах. Проведение аналогичных модельных экспериментов — окисление метилового эфира олеиновой кислоты [54] при 37° С при скорости зарождения свободных радикалов, сопоставимой с таковой в микросомальных липидах [1,27- Ю-10 моль/(л-с)], показало, что ТФА в интервале концентраций Ю-14—Ю-3 М не влияет на окисление и, следовательно, не проявляет свойств антиок-сиданта. Аналогичные данные были получены ранее в работах В. Е. Кагана, с сотр. [57, 58], которые обнаружили действие ТФА на неферментативное окисление в микросомах печени, в то время как в модельных опытах на липосомах из липидов, выделенных из тех же самых мембран, эффект отсутствовал.
Таким образом, на основании результатов наших экспериментов и литературных данных можно сделать вывод, что ТФА ингибирует ПОЛ в мембранах эндо-плазматического ретикулума. Отличительными чертами этого ингибитора как антиоксиданта являются проявление ингибирующей активности в сверхмалых концентрациях, на 4—10 порядков ниже, чем используемых в практике жидкофазного окисления антиок-сидантов, и отсутствие воздействия на окисление в модельных системах (метилолеате и липосомах). Фор-бол-дидеканоат (ДДФ), структурный аналог ТФА, не обладает подобными свойствами и вообще не влияет на процесс окисления.
Совокупность перечисленных выше качеств, а также опубликованные данные о том, что точно такими же свойствами обладает ганглиозид ОМ] (из класса гликолипидов) [59, 60], дают основания полагать, что эффективным действующим началом является, вероятно,не само исходное вещество (ТФА или ОМ]), а их комплексы с рецепторами, находящимися на мембра-
с не. Известно, что ТФА рецепторно взаимодействует с мембраносвязанной протеинкиназой С [61]. Можно полагать, что образующийся комплекс затем вступает в реакции окисления.
Действие форболового эфира и протеинкииазы С на систему пероксидного окисления липидов в плазматических мембранах клеток мозга in vitro
С целью проверки высказанного выше предположения о механизме действия форболового активатора на ПОЛ было проведено изучение эффекта при совместном введении in vitro ТФА и протеинкиназы С в систему окисления (клеточные мембраны). Поскольку при выработке клеточного сигнала лиганд связывается с рецепторами, расположенными на плазматической мембране, исследовали процесс ПОЛ в плазматических мембранах клеток мозга с использованием протеинкиназы С, выделенной из тех же мембран, в широком спектре концентраций, а также при совместном введении обоих агентов [62]. Показано, что во всей области исследованных концентраций (Ю-17— Ю-7 М ) ТФА вызывает антиокислительный эффект. Неактивный в биологическом отношении аналог ТФА — ДДФ антиокислительное действие не проявляет. Степень торможения окисления составляла более 20% во всех случа-спиновых ях CpeflHHg ингибирующий эффект равен 40— зависимо- 45%> максимальный — 65%. Отметим, что эти значения превышают соответствующие характеристики, полученные при исследовании свойств ТФА на микросомальных мембранах клеток печени, где средняя степень ингибирования составила не более 25— 30%, а максимальная — 50% [55].
Зависимость «доза-эффект» для мембран клеток мозга имеет два статистически достоверных (Р < 0,05) максимума при Ю-15 и 10~12 М(рис. 5, кривая 7).
Таким образом, концентрационная зависимость эффекта ТФА на ПОЛ в плазматических мембранах
Рис. 5. Зависимость степени ингибирования пероксидного окисления липидов в плазматических мембранах клеток мозга от концентрации форболового эфира ТФА (I) и протеинкиназы С (2)
Степень ингибирования оценивали по накоплению первичных продуктов окисления — диеновых конъюгатов
клеток мозга отличается от аналогичной кривой, полученной для микросомальных мембран печени, которая имеет только один максимум [55].
Более высокая ингибирующая активность ТФА к плазматическим мембранам клеток мозга может быть связана с тем, что активным действующим началом, как полагают в работах [55, 57], является комплекс ТФА с рецептором — протеинкиназой С, содержание которой в плазматических мембранах клеток мозга выше, чем в мембранах эндоплазматического ретику-лума печени [63].
Для оценки справедливости этого предположения мы провели эксперименты по выяснению характера действия протеинкиназы С на ПОЛ, а также ТФА и фермента совместно, причем в экспериментах была использована протеинкиназа, выделенная в четырех независимых экспериментах из тех же плазматических мембран. мозга, на которых изучался процесс ПОЛ. Оказалось, что концентрационная зависимость степени ингибирования ПОЛ под действием протеинкиназы С, как и в случае ТФА, носит бимодальный характер (рис. 5, кривая 2) с двумя статистически достоверными максимумами (Р < 0,05) по сравнению с контролем или близлежащими точками при концентрациях фермента Ю-13 и Ю-16 М. Средний уровень ингибирования — 48%, максимальный — 90%, что превышает соответствующие значения для форболового активатора.
Совместное действие протеинкиназы С в концентрации Ю-16 М и ТФА в концентрации Ю-12 М, (ингибирующих ПОЛ при раздельном использовании на 65%), привело к значительно большему торможению окисления, чем следовало бы ожидать, исходя из аддитивности антиокислительных свойств этих агентов. Оценка влияния этих веществ на ПОЛ по периоду индукции х на соответствующих кривых накопления диеновых конъюгатов показала, что при совместном введении агентов эффект значительно превышает аддитивный.
Эти данные позволяют сделать вывод о синергети-ческом эффекте протеинкиназы С и форболового эффектора в сверхмалых дозах на ПОЛ в плазматических мембранах клеток мозга. В связи с этим возникает весьма важный вопрос о том, действуют ли фермент и его активатор на ПОЛ как независимые химические агенты или они образуют активный комплекс. Из экспериментальных данных следует, что протеинкиназа С способна тормозить ПОЛ в отсутствие форболового активатора, в то время как относительно ТФА определенно ответить на этот вопрос довольно трудно, так как в мембранах всегда присутствует протеинкиназа С; на окисление в липосомах ТФА не влияет [57].
Наблюдаемое явление синергизма при совместном присутствии протеинкиназы С и активатора скорее склоняет к предположению об образовании между ними комплекса, обладающего большими антиокислительными свойствами, чем исходные вещества. В пользу этого предположения свидетельствуют и полученные нами данные об отсутствии эффекта при использовании аналога ТФА — ДЦФ: известно, что из-за стерических препятствий ДДФ такого комплекса не образует и поэтому не активирует протеинкиназу С [64]. Есть сообщения о принципиальной возможности образования комплекса ТФА с протеинкиназой С, в его формировании может участвовать фосфатидилсе-рин, содержащийся в мембране [65, 66].
В общем, полученные нами результаты и литературные данные не исключают возможности действия исследуемых веществ на ПОЛ по второму механизму, однако при данном подходе в полной мере трудно объяснить действие форболового активатора в сверхмалых концентрациях. Для возможности реализации этого механизма эффективность комплекса должна быть выше эффективности отдельно взятого вещества на несколько порядков.
Анализ биологических эффектов под действием лигандов протеинкиназы С
На примере протеинкиназы С впервые удалось установить, что антиоксиданты — природный (а-то-коферол) и синтетический (фенозан) — проявляют в действие СМД и на молекулярном уровне. Отметим, что еще для двух ферментов обнаружен эффект снижения активности под влиянием лигандов в СМД в системах т уИто : это ацетилхолинэстераза [67, 68] и простагландин-Н-синтетаза [69]. Важно отметить, что в качестве лигандов в обоих случаях использовались вещества, модифицирующие систему пероксидного окисления липидов. На примере протеинкиназы С и а-токоферола впервые продемонстрировано, что на активность фермента сверхмалая доза регулятора может действовать эффективнее, чем физиологическая его концентрация.
В эффектах, вызванных а-токоферолом и феноза-ном, есть сходства и различия. Природный антиокси-дант — а-токоферол является довольно сильным ингибитором протеинкиназы С. Синтетический антиок-сидант — фенозан, активирующий протеинкиназу С в очищенном виде [69], действует как суперактиватор фермента, находящегося в плазматических мембранах нормальных и Опухолевых клеток, растущих в культуре. В этой связи 'еще раз подчеркнем, что как показали эксперименты, активирующее влияние фенозана значительно выше действия известного форболового стимулятора активности протеинкиназы С и опухолевого промотора [45, 63, 64].
Наряду с противоположным знаком направленности эффектов этих антиоксидантов и с различиями в способах их действия на фермент обнаруживается аналогия их дозовых зависимостей, которые в общих чертах совпадают с типом зависимости «доза—эффект», полученной на других биологических объектах при исследовании действия разнообразных биологически активных веществ [7, 8, 41, 42, 55, 62]. Это проявляется, во-первых, в определенном типе бимодальных зависимостей с характерными максимумами и в наличии «зоны молчания», а также в существовании острого максимума при высоких дозах как природного, так и синтетического антиоксиданта.
Различия в характере дозовых зависимостей выявляются прежде всего между нормальными и опухолевыми клетками, для последних обнаруживается так называемая «промежуточная зона» (между максимумом воздействия при высоких концентрациях фенозана и «мертвой зоной»), в которой эффект антиоксиданта достаточно высок. Мы связываем наличие такой области с особенностями регуляции активности протеинкиназы С в опухолевых клетках, что может дать новые подходы к разработке принципов и схем химиотерапии опухолей с помощью синтетических антиоксидантов. Кроме того, исследования убедительно показали, что такой активатор протеинкиназы С как
форболовый эфир ТФА, рецепторно взаимодействующий с ферментом, обладает способностью ингибиро-вать ПОЛ в сверхмалых дозах как в мембранах эндо-плазматического ретикулума, так и в плазматических мембранах. Сам фермент в СМД также оказывает антиоксидантное действие на ПОЛ. Эти экспериментальные факты, а особенно наличие синергизма при совместном использовании протеинкиназы С и фор-болового активатора в СМД наводят на мысль о тесной связи ПОЛ и модификацией активности фермента под действием сверхмалых доз лигандов.
Вполне естественно возникает вопрос о возможном механизме наблюдаемого явления. Предложено несколько основных механизмов, объясняющих существование феномена эффекта СМД в принципе [8, 42, 70-74]. Не останавливаясь подробно на этих механизмах, отметим лишь, что имеющиеся теоретические положения, объясняющие эффект СМД, можно подразделить на общие, такие как гипотеза Л.А. Блюмен-фельда о параметрическом резонансе [72], представления о роли структуры растворителя, как например воды [74] в данном явлении, и более частные — наличие высокоэффективных систем усиления сигнала, формирование ответа в условиях неравновесного связывания лиганда с рецептором. Одним из механизмов увеличения чувствительности к лиганду может быть кинетическая кооперативность его связывания с ферментом [42, 71].
Обсуждая концентрационные закономерности действия антиоксидантов в СМД на активность протеинкиназы С , а также ее форболового стимулятора, ганг-лиозида ОМ[ и влияние самого фермента на систему ПОЛ, следует отметить, что все эти вещества либо сами являются рецепторами протеинкиназы С, либо имеют рецептор на мембране (а-токоферол, фенозан, форболовый эфир). Поэтому в качестве предпочтительного механизма можно принять гипотезу Зайцева—Сазанова [71] о существовании нескольких (в простейшем случае двух) рецепторов, с которыми связывается лиганд. Рецепторы имеют различные константы перехода из начального состояния в активное (и обратно) и действуют в противоположных направлениях. Расчеты скорости проявления общего эффекта как разности эффектов, вызванных связыванием СМД вещества на разных рецепторах, выявляют существование бимодальной зависимости с максимумом для СМД биологически активных веществ. Эти положения и наши экспериментальные результаты хорошо согласуются с представлениями, развитыми в работе [42] об аллостерическом взаимодействии каталитических центров в молекуле фермента или рецептора, причем эти центры имеют существенно разное сродство к субстрату: малые дозы лиганда преимущественно связываются с высокоаффинным каталитическим центром. При увеличении дозы в реакцию включается второй центр, который аллостерически взаимодействует с первым, понижая его сродство к субстрату и вызывая тем самым «сход» с него молекул лиганда.
Другой аспект механизма эффекта СМД изучаемых лигандов связан с их антиоксидантными свойствами. Здесь необходимо также иметь ввиду, что исследуемые вещества (ТФА, протеинкиназа С) избирательно концентрируются в липидах. В пересчете на липиды их действующие концентрации возрастают на три порядка. Тогда антиокислительный эффект в интервале концентраций Ю-5—Ю-10 М (Ю-2— Ю-7 М в расчете на липиды) может быть объяснен в рамках свойств
обычных антиоксидантов. Действие лигандов в области концентраций 10-п—10"14 М (Ю-8—Ю-11 М на липиды) может быть связано с так называемым структурным фактором: вещества модифицируют вязкостные свойства липидов, препятствуя развитию процесса пероксидного окисления липидов [35]. Такими способностями обладает форболовый активатор, причем максимальный эффект наблюдался именно для интервала концентраций 10~и—Ю-14 М [55, 56]. Следовательно, и антиокислительные свойства активатора в этой области концентраций могут быть объяснены изменением структуры липидного бислоя, лишь для объяснения эффекта в интервале более низких концентраций (Ю-11—Ю-14 Мв липидной фазе) требуется принципиально новый подход.
Совокупность данных — проявление протеинкина-зой С антиокислительных свойств только в активном функциональном состоянии (потеря этих свойств после инактивации); отсутствие влияния форболового активатора на систему ПОЛ в искусственных безбелковых системах (метилолеат, липосомы); синергетиче-ское действие этого активатора на ПОЛ — приводит к заключению о том, что протеинкиназа С наряду со своими основными функциями (катализ фосфорили-рования белков) обладает дополнительно свойствами «антиокислительного» фермента, а активатор ТФА в интервале сверхмалых концентраций действует опосредованно через протеинкиназу С. Отсутствие в инкубационной среде АТФ исключает возможность реализации механизмов, связанных с фосфорилировани-ем и последующей активацией известных «антиокислительных» ферментов типа супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы.
Можно высказать и некоторые весьма умозрительные предположения относительно молекулярного механизма проявления протеинкиназой С свойств «антиокислительного» фермента. Известно, что регулятор-ный домен этого фермента содержит богатые цистеи-ном цинксодержащие участки («цинковые пальцы»), ответственные, в частности, за связывание форболо-вых эфиров [75, 76]. Строение этих участков весьма сходно со структурой каталитических центров «антиокислительных» ферментов, например супероксиддисмутазы, содержащей ионы Си2+ и 2п2+ [77]. Возможно, регуляторный домен протеинкиназы С обладает свойством катализировать антиокислительные процессы, чем и объясняется ингибирующее ПОЛ действие данного фермента в отношении пероксидного окисления липидов. Безусловно, это предположение носит сугубо гипотетический характер и требует основательной экспериментальной проверки.
По-видимому, во взаимодействие форболового активатора с протеинкиназой С вносят вклад две компоненты: специфическая — под влиянием ТФА активируются «антиокислительные» свойства фермента и неспецифическая. Вторая компонента возникает в результате влияния активатора на структуру мембраны (микровязкость липидного бислоя) таким образом, что создаются благоприятные условия для перехода дополнительных молекул протеинкиназы С из цитозоля в мембрану и закрепляется конформационное состояние фермента, которое наиболее выгодно для взаимодействия с субстратом и эффектором; указания на такую возможность есть в работе [78]. Обе компоненты, взаимодействуя синергетически, увеличивают активность протеинкиназы С и ее антиокислительные способности.
Результаты, полученные в работе, убедительно показывают существование эффекта СМД не только на системах повышенной сложности, но и на уровне молекулярных взаимодействий. В связи с этим общие факторы, обусловливающие данное явление, следует, вероятно, искать в области парадоксальных физико-химических изменений во взаимодействии молекулы со средой, в которой протекает реакция. И здесь полезно привлечь теории, связанные со структурой воды и ее «памятью», получившие развитие в последние годы. В частности, существует представление, подтвержденное некоторыми экспериментальными данными, о кластерных образованиях в воде, которые, согласно мнению авторов [74], способны менять физико-химические свойства воды и скорость химических и биохимических процессов, в ней протекающих.
Мы склоняемся к предположению о том, что растворение лигандов в воде вызывает изменение соотношения существующих в воде кластеров и/или приводит к формированию дополнительных структур, которые ранее отсутствовали. Затем эти структуры при последующих разбавлениях создают свои реплики, которые и определяют проявление свойств введенной ранее примеси. Иными словами, если растворение примеси вызвало изменение свойств воды как растворителя, то разбавляется уже не примесь, а сама вода. Вероятно, разработка данного научного направления весьма перспективна и приведет к разгадке феноменального явления эффекта сверхмалых доз.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурлакова Е. Б, Греченко Т. Н., Соколов Е. Н., Терехова С.Ф. Биофизика, 1986, т. 31, с. 921—923.
2. Богатыренко Т.Н., Редкозубова Г.П., Конрадов A.A., Бурлакова КБ. Там же, 1989, т. 34, с. 327—329.
3. Ашмарин И.П., Лелекова Т.В., Санжиева Л.Ц. Изв. АН, 1992, т. 4, с. 531-536.
4. Topchieva I.N., Erokhin V.N., Osipova S.V. Biomed. Sei.,
1991, v. 2, p. 41-47.
5. Гладышева Т.Б., Конрадов A.A., Лебедев KA. Биофизика, 1989, т. 34, с. 833-834.
6. Zaitsev S.V., Khegai L.A., Kim B.B. e.a. Immunol. Lett.,
1992, v. 32, p. 27-30.
7. Бурлакова КБ. Вест. РАН, 1994, т. 64, с. 425—431.
8. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова Т.В. Нейроим-мунология, эпидемиология и интерферонология рассеянного склероза. С.-П.: Лики России, 1996, с. 29—34.
9. Бурлакова Е.Б., Бойков П.Я., Папина Р.И., Карцев В.Г. Изв. АН, Сер. биол., 1996, с. 39-45.
10. Efanov А.М., Koshkin A.A., Sazanov L.A. е. a. FEBS Lett., 1994, v. 335, p. 114-116.
11. Takai Y., Kishimoto A., Inoue M., Nishizuka Y. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 3603-3610.
12. Nishizuka К Mol. Biol., Biochem. and Biophys., 1980, v. 32, p. 113.
13. Nishizuka K. Trends Biochem. Sei., 1983, v. 8, p. 13—17.
14. Newton A.C. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1993, v. 22, p. 1-12.
15. Takai Y, Kaibuchi K., Tsuda T., Hoshijima J. Cell. Biochem., 1985, v. 29. p. 143-149.
16. Nishizuka Y J. Amer. Med. Assoc., 1989, v. 262, p. 1826.
17. Protein kinase C, current concepts and future perspectives. Eds.: D. S. Lester, R. M. Epand. N.-Y., London, Toronto, Sydney, Tokyo, Singapore: Ellis Horwood, 1992, p. 216.
18. Azzi A., Boscoboinic D., Hensey C. Eur. J. Biochem., 1992, v. 208, p. 547-549.
19. Protein kinase C. Ed. J.-F. Kuo, N.-Y.: Oxford University Press, 1994, p. 223.
20. Dekker L. V, Parker L.J. Trends Biochem. Sei., 1994, v. 19, p. 73-77.
21. HugH., Scare TP. J. Biochem., 1993, v. 291, p. 329-332.
22. Bell R.M., Bums D.I. J. Biol. Chem., 1991, v 266, p. 4661.
23. Nishizuka Y. Science, 1992, v. 258, p. 607-609.
24. Murakami K., Routtenberg A. FEBS Lett., 1985, v. 192, p. 189-191.
25. Sekiguchi K, Tsukada M., Ogita K. e. a. Biochem. Biophys. Res. Commun.s, 1987, v. 145, p. 797-806.
26. Berdel W.E., Anderssen R., Munder P.G. Phospholipids and Cellular Regulation. Ed. J. F. Kuo, v. 2. Boca Raton: CRC Press, 1985, p. 41-64.
27. Wise B.C., Raynor R.L., Kuo J.F. J. Biol. Chem, 1982, v. 257, p. 694-699.
28. Мальцева Е.Л., Курнакова H.B., Бурлакова Е.Б., Пал'ьми-на Н.П. Биохимия, 1990, т. 50, с. 471-478.
29. Buriakova Ye.В., Palmina N.P., Maltseva Ye.L. In: Membrane Lipid Oxidation III. Ed.: С. Vigo-Pelfrey, Boca Raton: CRC Press, 1991, p. 209-238.
30.Kagan V.E, Bakalova R.A., Karakashev P. Ibid., p. 191-208.
31. Maltseva E.L., Kumakova N.V., Palmina N.P., Buriakova E.B. J. Chem. and Biochem. Kinetics, 1991, v. 1, p. 93—108.
32. Maltseva E.L., Kumakova N. V, Palmina N.P. Abstrs 22-th FEBS Meeting, Stokholm, Sweden, 1993, p. 153.
33. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Бурлакова Е.Б. Хим. физика, 1995, т. 14, с. 47-60.
34. О'Brian С.А., Ward N.E., Weinstein I.B. е. a. Biochem. Biophys. Res. Communs , 1988, v. 155, p. 1374—1376.
35. Бурлакова Е.Б., Крашаков C.A., Храпова Н.Г. Биол. мембраны, 1998, т. 15, с. 137—167.
36. Kagan V.E. Ann. N.-Y. Acad. Sei., 1989, v. 570, p. 121-135.
37. Shamovsky I.L., Yarovskaya I.Y. J. chim. phys. et phys.-chim. biol., 1991, v. 88, p. 2675-2680.
38. Machoney C. W., Azzi A. Biochim. Biophys. Res. Communs., 1988, v. 154, p. 694-696.
39. Boscoboinik D., Szewezyk A., Hensey C., Azzi A. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 6188-6191.
40. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Курнакова H.B., Бурлакова Е.Б. Биохимия, 1994, т. 52, с. 193—203.
41. Delikonsfantinos G., Kopeikina-Tsiboukidon L., ViUiton К. Biochem. Pharm., 1987, v. 36, p. 1153-1157.
42. Buriakova Ye.B., Konradov A.A.. Khudyakov I. Nonlinear Biol., 1991, v. 1, p. 77-82.
43. Pobedimsky D.G., Buriakova E.B. Atmospheric Oxidation and Anti-oxidants. North-Holland, Elsevier, 1993, v. 3, p. 223.
44. Azzi A., Boscoboinik D., Chateiain E. In: Soluble Antioxidants: Biochemistry and Clinical Applications. Basel, Birk-hauser Verlag, 1992, p. 123-132.
45. Kraft A.S., Anderson W.B. Nature, 1983, v. 301, p. 621-625.
46. Chemavskii D.S., Palamarchuk E.K., Polezchaev A.A. e. a. Biosystems, 1977, v. 9, p. 187—199.
47. Nishizuka Y. Science, 1992, v. 258, p. 607-614.
48. Nishizuka Y. J. Amer. Med. Assoc., 1989, v. 262, p. 1826.
49. Berridge M.J., Irvine R. Nature, 1984, v. 312, p. 315-321.
50. Rana R.S., Hokin L.E. Physiol. Rev., 1990, v. 37, p. 17167.
51. Jaken S. Meth. Enzymol., 1987, v. 41, p. 275-287.
52. Belokoneva O.S., Maltseva E.L., Zaitsev S. V, Palmina N.P. J. Chem. and Biochem. Kinetics., 1992, v. 2, p. 183-193.
53. Afaneri I.A. Biochem. and Biophys. Res. Communs, 1990, v. 166, p. 1365-1371.
54. Пынзарь Е.И., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. Биол. мембраны, 1995, т. 12, с. 279—287.
55. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г.,Мальцева ЕЛ., Пынзарь ЕЙ. Там же, 1992, т. 9, с. 810-820.
56. Мальцева ЕЛ., Пальмина Н.П. Там же, 1992, т. 9, с. 1023-1025.
57. Kagan V.E., Bakalova RA., Serbinova E.A. e. a. In: Free Radicals: Chemistry, pathology and medicine. London: Richelien Press, 1988, p. 417-438.
58. Kagan V.E. In: Lipid Peroxidation in Biomembranes. Boca Raton: CRC Press, 1988, p. 225.
59. Tyurin V.A., Tyurina Yu.Yu., Avrova N.F. Neurosci. Internat, 1992, v. 20, p. 401-407.
60. Tyurina Yu.Yu., Tyurin V.A., Avrova N.F. Mol. and Chem. Neuropath, 1993, v. 19, p. 205-207.
61 .Slaga T.I., Fisher S.M., Nelson K, Glenson G.L. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1980, v. 77, p. 3659-3663.
62. Пальмина Н.П., Пынзарь Е.И., Курнакова H.B., Бурлакова Е.Б. Биол. мембраны, 1997, т. 14, с. 376—384.
63. Leli U., Hauser С., Froimowitz M. Pharmacol., 1990, v. 37, p. 286-295.
64. Da Silva С., Fan X., Martelly J., Castanga M. Cancer Res., 1990, v. 50, p. 2081-2087.
65. Myung-Ho Lee, Bell R.M. J. Biol.Chem., 1989, v.264, p. 14797.
66. Молочкина E.M., Озерова И.Б. Тез. 2-го Межд. симп. «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва, 1995, с. 101.
67. Озерова И.Б., Молочкина Е.М. Там же , с. 102.
68. Сергеева М.Г., Гончар М.В., Намгаладзе Д.А. и др. Биохимия, 1997, т. 62, с. 216-222.
69. Хохлов А.П., Ярыгин К.Н., Бурлакова Е.Б. Биол. мембраны, 1989, т. 6, с. 133-141.
70. Blumenfeld L.A., Grosberg A. Yu., Tikhonov A.N. J. Chem.Physi., 1991, v. 95, p. 7541-7547.
71. Сазанов Jl.А., Зайцев C.B. Биохимия, 1992, т. 57, с. 1443.
72. Блюменфельд Л.А. Биофизика, 1993, т. 38, с. 129—132.
73. Koshland D.E. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 5829-5834.
74. Lo S. Y. In : Physical, Chemical and Biochemical Properties of Stable Water (ie™) Clasters, Singapore, World Scientific Publishing Co Ptc. Ltd., p 3-47.
75. Bell R.M., Bums D.J. J. Biol.Chem., 1991, v. 266, p. 4661.
76. Ono Y, Fujii Т., Jgarashi K. e. a. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1989, v. 86, p. 4868-4871.
77. Tainer JA., Getzoff E.D., Веет K.M. e. a. J. Mol. Biol., 1982, v. 160, p.181-217.
78. Lester D.S. Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1, p. 297—303.
УДК 577.325 + 577.15
Действие фенозана и экзогенного ацетилхолина на ацетилхолинэстеразу и систему липидной пероксидации в мембранах клеток головного мозга
Е. М. Молочкина, И. Б. Озерова, Е. Б. Бурлакова
ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА МОЛОЧКИНА — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института биохимической физики (ИБХФ) им. Н. М. Эмануэля РАН. Область научных интересов: мембранология, нейрохимия.
117334 Москва, ул. Косыгина 4, корп. 11, ИБХФ РАН, тел. (095)939-73-51, факс (095)137-41-01, E-mail [email protected]
ИРИНА БОРИСОВНА ОЗЕРОВА — научный сотрудник ИБХФ РАН. Область научных интересов: мембранология, нейрохимия.
К настоящему времени установлено, что сверхмалые дозы (СМД) биологически активных веществ и физических факторов (излучения) действуют на биологические системы самого разного уровня организации — от макромолекул, надмолекулярных комплексов, клеток, органов и тканей до растительных и животных организмов и целых популяций [1—5]. Спектр агентов, действующих в СМД, как и список объектов, по отношению к которым установлена эффективность сверхмалых воздействий, все более расширяется.
В настоящей статье дан обзор результатов изучения влияния сверхмалых доз синтетического антиоксидан-та фенозана
(СНз)зС
(СНз)зС
и важнейшего для организма нейромедиатора ацетилхолина на активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и на уровень пероксидного окисления липидов мембран клеток головного мозга [6—9]. Объектами воздействия исследуемых веществ были индивидуальный фермент — растворимая АХЭ и мембраны, выделенные из клеток головного мозга мышей, представляющие собой надмолекулярные структуры. При этом воздействию фенозана и ацетилхолина подвергали in vitro мембраны клеток мозга интактных животных, а также иссле-
довали мембраны, выделенные из мозга мышей, которым препарат вводили in vivo внутрибрюшинно, т.е. изучали проявление действия на целый организм.
Интервал используемых концентраций веществ был таков, что на 106 молекул фермента ацетилхолинэстеразы приходилось от 1 до 104 молекул изучаемых эффекторов фермента в области СМД и 1011—Ю10 молекул в области обычных концентраций.
Изучение влияния фенозана на активность ацетилхолинэстеразы
Эксперименты in vitro с растворимой АХЭ. Экспериментальные данные, представленные на рис. 1 а, характеризуют влияние фенозана К (калиевая соль) на кинетические параметры водорастворимой кристаллической АХЭ: на максимальную скорость ферментативного гидролиза VMaKC субстрата ацетилтиохолина и константу Михаэлиса Км, а также на эффективность фермента, выражаемую отношением VMaKC/KM. Видно, что под действием фенозана оба параметра Км и VMaKC изменяются, причем эти изменения одноналравлен-ны. Случай, когда VMaK¡. и АГМ изменяются под действием эффектора фермента однонаправленно, но в разной степени, означает, что в зависимости от концентрации субстрата будет проявляться либо ингиби-рующее, либо активирующее воздействие на фермент.
В наших экспериментах наблюдается уменьшение эффективности фермента К,акс/ЛГм, т.е. параметра, определяющего, согласно уравнению Михаэлиса—
