CC BY
9
серным эфиром экстрагировано 0,7—2 мг/л, хлороформом — 0,5— 1,2 мг/л, а бензолом — 0,3—1,3 мг/л.
Однако требуется еще разработка' методов раздельного определения в воде специфических ингредиентов или групп ингредиентов, входящих в общее число эфирорастворимых веществ, характерных для сточных вод предприятий нефтяной промышленности, а также выявление химической природы этих веществ.
На основании наших опытов можно рекомендовать при проведении контроля за условиями выпуска сточных вод и изучении гигиенической эффективности мероприятий по охране водоемов от загрязнения сточными водами предприятий нефтяной промышленности применение серного эфира как экстрагента, позволяющего выявить наибольшее количество органических веществ сточных вод, поступающих в водоем.
Поступила 25/1X 1964 г.
УДК 613-07 : 612.112.3-08 + 612.112.3-08 : 613-07
К МЕТОДУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ
ЛЕЙКОЦИТОВ В ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ1
А. И. Шустов
Военно-медицинская ордена Ленина академия им. С. М. Кирова,
Ленинград
Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов как высокочувствительный тест при характеристике защитных сил организма лолучил широкое распространение в гигиенических исследованиях.
Описано множество методов и их модификаций, пригодных для изучения фагоцитарной реакции в пробирочных условиях (in vitro). Наиболее распространенными являются методы, используемые в современных клинических и экспериментальных исследованиях. Методы гигиенических исследований идентичны по условиям постановки реакции тем, которые применяют в клинике и в крупных научно-экспериментальных учреждениях (М. А. Раздобудько; А. И. Пахомычев; А. П. Волкова2; Л. С. Митина, и др.), что ограничивает возможность использования фагоцитарного теста в производственных условиях, так как для этого требуется лабораторное оборудование (термостат, центрифуга, пробирки, пипетки и др.).
Наибольшее внимание привлекает метод Н. В. Пучкова и М. С. Титовой; в качестве объекта поглощения при этом используют частицы индифферентного вещества — кармина, что значительно упрощает подготовку к исследованию, но, как и другие исследования, оно нуждается в лабораторных условиях. Заглатывание фагоцитами частиц кармина как неживого агента происходит менее интенсивно, чем заглатывание микробных тел, но все же отражает общую динамику фазы поглощения в реакции фагоцитоза и поэтому не снижает чувствительности фагоцитарного теста.
Описанный авторами метод приготовления кармина не совсем совершенен; для удаления частиц размером менее 2 мк требуется около
1 Метод, предложенный автором статьи, удобен при изучении функционального состояния клеток крови; поскольку, однако, объектом фагоцитоза выбраны зерна кармина, он не может служить показателем напряженности естественной резистентности к микробам. — Ред.
2 Кандидатская диссертация. М., 1961.
2 недель; количество получаемой суспензии недостаточно для проведения обследования в широких масштабах; а в результате того, что в описании не указаны точные границы забора пригодной для фагоцитарных опытов суспензии, страдает и ее качество. Поэтому для работы в производственных условиях мы не смогли остановиться ни на одном из описанных методов определения фагоцитарной активности лейкоцитов. Все это побудило разработать новые модификации методов определения поглотительной способности фагоцитов и приготовления суспензии кармина для фагоцитарных опытов.
С целью получения суспензии кармина, содержащей пригодные для реакции по размерам частицы (1—5 мк), мы использовали принцип шламмового анализа (Н. А. Фигуровский). Если цилиндр, наполненный хорошо размешанной полидисперсной суспензией, оставить спокойно стоять, то в течение определенного времени, которое соответствует прохождению частицами критического размера (5 мк) расстояния Н от поверхности, выше уровня Н в суспензии уже исчезнут частицы размером больше критического. Опытным путем нами определены нижние уровни суспензии, в которой не встречаются частицы размером более 5 мк после 1-, 2- и 3-суточного отстаиваний, что дало возможность разделить суспензию на 2 фракции. Из верхней фракции путем промывания предварительно сконцентрированной суспензии дистиллированной водой на центрифуге удаляются частицы размером менее 1 мк. Применение принципа шламмового анализа значительно сократило время приготовления нужной суспензии, а получение ее из полидисперсной системы с более низкой концентрацией твердой фазы (0,5 г кармина на 260 мл воды) значительно улучшило ее качество.
В основу разработки упрощенного метода определения поглотительной способности фагоцитов к кармину легли следующие положения: 1) чтобы исключить необходимость использования большого количества лабораторного оборудования, применяют лейкоцитарный смеситель (меланжер) для забора ингредиентов реакции, смешивания их и температурной выдержки в подмышечной впадине исследуемого; 2) для уменьшения количества используемых реактивов (что способствует более точному забору ингредиентов) заблаговременно готовят кармино-цитратную суспензию, которая служит для стабилизации крови в опыте и одновременно содержит объект фагоцитоза; 3) использование минимальных разведений крови ингредиентами реакции (1 : 10) дает возможность считать лейкоцитарную формулу в приготовленном мазке, которая, по нашим наблюдениям, существенно не отличается от формулы, подсчитанной в цельной крови. Помимо этого, отпадает необходимость прибегать к центрифугированию опытной смеси после температурной экспозиции для концентрации фагоцитирующих клеток крови; 4) оценка результатов реакции по количеству частиц, поглощенных всеми фагоцитирующими элементами крови — нейтрофилами, эозинофилами и моноцитами (в 1 мм3), характеризует защитные силы организма более показательно, чем оценка по интенсивности поглощения частью фагоцитов (нейтрофилами) без учета их истинного количества, так как известно (И. Г. Грех1 и др.), что понижение интенсивности поглощения фагоцитов в первой стадии компенсируется увеличением их числа в циркулирующей крови.
Экспресс-метод определения поглотительной способности фагоцитов следующий: частицы кармина размером 1—5 мк, взвешенные в растворе антикоагулянта (кармино-цитратная суспензия), смешивают с кровью исследуемого в соотношении 1 : 10 и инкубируют в смесителе для лейкоцитов в подмышечной впадине. После экспозиции готовят мазки и рассматривают их при большом увеличении под иммер-
1 Кандидатская диссертация. Л., 1954.
сией. Оценка поглотительной способности фагоцитов выражается показателем, который отражает поглотительную способность в 1 лш3 крови, так как производится она по количеству частиц, поглощенных фагоцитами, содержащимися в 1 мм3 циркулирующей крови. При этом используют реактивы: а) кармино-цитратную суспензию; б) 3% раствор уксусной кислоты; в) метиловый спирт или сметь Никифорова; г) краску Романовского—Гимзы.
Для приготовления кармино-цитратной суспензии следует отвесить 0,5 г кармина, поместить его в аптечную ступку, добавить 2—3 мл воды и растирать в течение 10 мин. Путем 7—8-кратного промывания ступки 10 мл воды перенести суспензию в стандартный градуированный цилиндр с притертой пробкой и довести общий объем до 260 мл. Высота столба суспензии в цилиндре должна быть 30 см. Затем необходимо закрыть цилиндр пробкой, тщательно перемешать содержимое и поставить для отстаивания при комнатной температуре вдали от источников тепла (в шкаф, под стеклянный колпак, в сосуд с водой) на резиновую подкладку.
После отстаивания отсосать крючкообразно изогнутой пипеткой верхнюю фракцию суспензии, нижний уровень которой располагается следующим образом: после односуточного отстаивания—200 мл по шкале градуировки цилиндра (9 см от поверхности столба суспензии), после 2-суточного—100 мл (19 см) и после 3-суточного — 50 мл (24,3 см). Затем нужно разлить полученную суспензию в чистые центрифужные пробирки и центрифугировать в течение 20 мин. при 1400—1500 об/мин, осторожно слить центрифугат, оставив над осадком слой 1 —1,5 см, и наполнить пробирки опять суспензией. Центрифугирование производить все время в одинаковом режиме. После того как вся полученная фракция суспензии окажется сконцентрированной в пробирках, центрифугат осторожно слить, взболтать осадки, налить в пробирки дистиллированной воды, тщательно перемешать содержимое и центрифугировать.
Промывание суспензии рекомендуется повторять до появления в центрифугате бледно-розовой окраски. Потом следует слить центрифугат, оставив над осадком слой в 1 —1,5 см, взболтать и перенести освобожденную от ультрамикроскопических частиц суспензию в предварительно проградуированный флакон с притертой пробкой, отметить объем суспензии и определить концентрацию частиц в 1 мм3 путем подсчета в камере для счисления клеток крови.
При этом необходимо учесть, что частицы кармина имеют очень малые размеры (1—5 мк) по сравнению с объемом, в котором производят подсчет. Поэтому для оседания их на дно камеры необходимо после ее заполнения выждать не менее 15 мин. В противном случае выявляются большие расхождения в подсчете с действительной концентрацией. Суспензию разводят до концентрации 1 000 000 частиц в 1 лш3. Готовая суспензия кармина при хранении в комнатных условиях может быть пригодна до полного ее использования. Но мы рекомендуем для более высокой степени чистоты (так как при длительном хранении наблюдается диспергирование частиц) в случае, если суспензия простояла более 3 или 4 недель, перед предстоящим исследованием производить однократное «промывание» ее дистиллированной водой путем центрифугирования с последующим определением концентрации.
Кармино-цитратную суспензию готовят за несколько суток до исследования. В отдельный флакончик берут суспензию кармина и смешивают со свежеприготовленным 9% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 1:1. Оставшуюся после исследований кармино-цитратную суспензию можно использовать в дальнейшем при условии хранения ее при 4—5°.
Необходимое оборудование: 1) микроскоп, 2) камера для счисления клеток крови, 3) игла Франка, 4) лейкоцитарные меланжеры, 5) резиновая груша, 6) липкий пластырь, 7) холодильник.
Лейкоцитарные меланжеры следует подбирать с небольшим резервуаром смесителя. Перед началом работы в течение 10 мин. нужно прогреть меланжеры и кармино-цитратную суспензию при 37°.
При определении необходимо прежде всего взболтать кармино-цитратную суспензию и набрать ее в сухой и чистый лейкоцитарный меланжер до метки 1,0. В этот же меланжер вслед за кармино-цитрат-ной суспензией взять из пальца кровь до метки 11,0. Смешивать ингредиенты реакции следует в течение 1 мин., затем нужно выпустить 2—3 капли опытной смеси, закрыть короткую часть меланжера липким пластырем и продуть воздухом из резиновой груши так, чтобы опытная смесь находилась только в резервуаре смесителя; после этого поместить меланжер в подмышечную впадину исследуемого на 30 мин. В другой меланжер для подсчета количества лейкоцитов нужно набрать кровь до метки 0,5 и 3% уксусную кислоту до метки 11,0.
По истечении времени инкубации опыта требуется извлечь меланжер из подмышечной впадины, очистить от липкого пластыря и смешивать его содержимое в течение 1 мин., выдуть опытную смесь на стекло и приготовить мазки средней плотности.
После просыхания мазков следует фиксировать их метиловым спиртом или смесью Никифорова (1 часть винного спирта+1 часть эфира) и красить в течение 15 мин. краской Романовского—Гимзы (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).
Для ускорения окраски можно развести краску Романовского метиловым спиртом в соотношении 1:1; на край сухого нефиксированного мазка нанести 2 капли разведенной краски, шлифованным стеклом распределить краску по мазку тонким слоем. Экспозиция продолжается 1 — П/г мин. (в зависимости от плотности мазка), после чего следует смыть обильной струей воды, а мазок просушить фильтровальной бумагой.
Для оценки результатов следует определить количество лейкоцитов в 1 мм? крови; считать 100 лейкоцитов и одновременно учитывать количество поглощенных частиц кармина встречающимися при подсчете фагоцитами (нейтрофилами, эозинофилами и моноцитами)—А; вычислить поглотительную способность фагоцитов (ПСФ) 1 мм3 крови по формуле:
псф = -лх/-
100
где А — количество поглощенных частиц, сосчитанных при подсчете лейкоцитарной формулы, Ь — общее количество лейкоцитов.
Пример расчета. Количество лейкоцитов в 1 мм3 6400. Количество поглощенных частиц кармина фагоцитами при подсчете лейкоцитарной формулы 82.
„ _ 82-6400
ПСФ =--— = 5248 частиц в 1 мм3 крови.
100
ЛИТЕРАТУРА
Митина Л. С. Гиг. и сан., 1962, № 10, стр. 3.—П ахомычев А. И. Там же, 1960, № 11, стр. 77.—П у ч к о в Н. В., Титова М. С. Физиол. ж. СССР, 1952, № 6, стр. 756.—Раз добудь ко М. А. Гигиена труда, 1958, № 4, стр. 23.—Ф игу ровики й Н. А. Седиментометрический анализ. М.—Л., 1948.
Поступила 10/1II 1964 г.
