CC BY
26УДК 546.81 : 615.099
К методологии оценки типа комбинированной токсичности на основе данных эколого-эпидемиологического исследования
Кацнельсон Б.А.1, Казмер Ю.И.1 Вараксин А.Н. 2, Привалова Л.И.1, Панов В.Г. 2, Киреева Е.П. 1
1ФГУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпред-приятий» Роспотребнадзора МЗиСР 2 Институт промышленной экологии УрО РАН
На материалах ранее проведенного исследования, выявившего зависимость вероятности субклинического поражения почек у детей от концентрации свинца и кадмия в моче, показано, что комбинированная нефро-токсичность этих металлов является менее чем аддитивной (токсикологический антагонизм). Теоретический и методический интерес пред-
ставляет показанное совпадение этой оценки типа комбинированной токсичности независимо от того, проводится ли она на базе парадигмы аддитивности эффектов или аддитивности доз.
Ключевые слова: аддитивность доз, аддитивность эффектов, нефротоксичность, свинец, кадмий.
Введение. Комбинированное действие ядов оценивается в токсикологии исходя из двух парадигм, которые обозначаются различными терминами: аддитивность доз (изоаддитивность, аддитивность Лёве) и аддитивность эффектов (гетероаддитивность, независимость Блисса). На основе обеих парадигм действие комбинации двух или более вредных веществ может быть охарактеризовано как аддитивное, более чем аддитивное (потенцирование, синергизм) или менее чем аддитивное (антагонизм). Практической реализацией первой парадигмы является принятое в России, США и ряде других стран правило суммирования отношений содержания вредных веществ в воздухе к соответствующим нормативам; практической реализацией второй - рекомендация суммировать однотипные риски разных вредных факторов, принятая в методологии оценки риска для здоровья [3].
В литературе до сих пор нет единого мнения о том, лежат ли в основе названных парадигм принципиально разные биологические явления, или же они просто являются разными подходами к оценке комбинированного действия [1,2]. Для развития эффекта действия практически любого вещества, в особенности при хронической интоксикации, важную роль играют не одна, а многие точки приложения этого действия и/или различные его механизмы, часть из которых для веществ, рассматриваемых в комбинации, может совпадать (что должно бы обусловить изоадди-тивность), а часть - нет (гетероаддитивность). Неоднократно указывалось также, что подтверждение реальными данными той или иной из двух рассматриваемых моделей комбинированной токсичности существенно зависит от формы зависимости доза - эффект для изолированного воздействия каждого вещества и от того, на ка-
*Фрагмент кандидатской диссертации Ю.И.Казмер
ком отрезке этой зависимости рассматривается эффект присоединения второго вещества (напри-мер,[2,12,13]). Поэтому мы склонны рассматривать аддитивность доз и аддитивность эффектов как разные способы оценки типа комбинированного действия и считаем целесообразным не ограничивать оценку токсичности конкретных комбинаций априорным выбором той или иной модели, а по возможности испытывать подходы, основанные на каждой из них.
Следует особо отметить, что как сами рассматриваемые понятия, так и конкретная их реализация базируются почти исключительно на экспериментально-токсикологических и фармакологических данных, но пока не нашли применения в экологической эпидемиологии и при оценке риска для здоровья человека.
Материалы и методы исследования. Основой для проделанной работы явилось ранее опубликованное эпидемиологическое исследование по типу случай-контроль (2004-2005 гг.), выявившее зависимость вероятности субклинического поражения почек у детей от концентрации свинца и кадмия в моче [4, 8]. Оба металла являются по-литропными (полиорганными и полисистемными) ядами, но почки страдают как при свинцовой, так и при кадмиевой хронической интоксикации. Даже при тех относительно невысоких уровнях токсической экспозиции, которые связаны с загрязнением среды в зонах действия предприятий цветной металлургии, повышенный риск детских нефропатий показан многими исследователя-ми[5-9,12] и, по всей видимости, является одним из ключевых.
В базовом исследовании принимали участие 273 дошкольника (от 3 до 7 лет), проживающие в 4-х городах Свердловской области. Для каждого ребенка были измерены концентрации микро-
глобулина В2и (показателя субклинического поражения почечных канальцев), свинца и кадмия в утренней моче. 13 детей, данные для которых оказались неполными, мы исключили из нынешнего анализа.
Анализ на основе парадигмы аддитивности эффектов.
Первым шагом анализа являлся перевод концентраций металлов в категорийную форму. Для этого после упорядочения записей базы данных в восходящем порядке по концентрации кадмия (или свинца) весь ряд делился на три примерно равные по численности (86-87 детей) группы, соответствующие трём диапазонам уровней воздействия кадмия (или свинца) на почки (принимая, что концентрация металла в моче может служить биомаркёром этого воздействия). Средние значения концентраций по названным диапазонам: (а) для свинца «низкий» уровень - 10.5, «средний» -37.9, «высокий» - 74.6 мкг/л; (б) для кадмия - соответственно, 0.5, 2.3 и 9.8 мкг/л.
Затем для каждого уровня воздействия того или иного металла исчислялась вероятность более чем медианного (для всего массива данных) значения концентрации В2и при каждом из 3-х уровней воздействия второго металла.
В использованной нотации индексы 1=0,1,2 и ]=0,1,2 нумеруют группы по кадмию и свинцу, соответственно. Таким образом, мы вводим следующие обозначения вероятности "" :
Таблица 1
Двухфакторная таблица дисперсионного анализа с двумя трехуровневыми факторами
Pb Cd Pb = 0 Pb = 1 Pb = 2
Cd = 0 w 00 w 01 w 02
Cd = 1 w 10 w 11 w 12
Cd = 2 w 20 w 21 w 22
Эту таблицу можно рассматривать как двух-факторную таблицу дисперсионного анализа с двумя трехуровневыми факторами. Тогда условие отсутствия взаимодействия факторов на всех их уровнях приводят к следующей системе уравнений, которые можно рассматривать как условия аддитивности эффектов при действии рассматриваемых факторов на всех уровнях этих факторов:
w -W =W -W 22 21 12 тт11
W -W =W -W
22 20 12 тт10 СП
w -W =W -W 22 21 02 тт01
W -W =W -W
22 20 02 00
Действие кадмия и свинца признается аддитивным, если одновременно выполнены все четыре равенства, а статистически значимое отклонение хотя бы от одного из них означает супер- или субаддитивность эффектов при том или ином уровне воздействия.
Анализ на основе парадигмы аддитивности доз.
Для построения изоболы (линии равных значений W) используем уравнение множественной регрессии в виде квадратичной формы: W = b0 + b1 Cd + b2 Pb + b3 Cd*Pb + b4 Cd2 +
b5 Pb2 , (2)
где Cd и Pb - концентрации кадмия и свинца, b0, bp ... , b5 - коэффициенты уравнения регрессии. Если в выражении (2) принять, что W =const, то оно представляет собой неявное уравнение некоторой кривой, которая и будет искомой изоболой. Точки пересечения этой изоболы с осями будут соответствовать значениям изоэффективных концентраций при изолированном действии кадмия или свинца. Напомним, что в нашем случае W= 0.5, поскольку граничным значением уровня B2u, превышение которого рассматривалось как ориентировочный показатель доклинического повреждения почек, была принята медиана распределения этих уровней (обоснование этого допущения приведено в [4, 8]).
Для построения уравнения регрессии, выражающего W в виде функции концентраций кадмия и свинца, необходимо иметь набор значений W, полученных при разных значениях Cd и Pb. Этот набор значений был получен, преобразовывая первичную базу данных. Далее методом пошаговой (stepwise) регрессии вперед отбирались предикторы, наиболее важные для описания W. Из пяти предикторов уравнения (2) метод пошаговой регрессии отобрал три первых (два линейных и перекрестный член); коэффициент детерминации модели регрессии оказался равным R2=0,95 (очень высок). Два квадратичных члена уравнения (2) оказались статистически незначимы (p>0,9) и не дали никакого вклада в R2, вследствие чего были исключены. Таким образом, было получено уравнение регрессии (3), приводимое ниже в разделе «Результаты и обсуждение».
Результаты и обсуждение. Анализ, проведенный на основе условий (1), показал, что комбинированный эффект свинца и кадмия статистически значимо отличается от аддитивного на уровне P<0.1 (односторонний критерий). Важную дополнительную информацию для качественной характеристики этого отличия на разных уровнях воздействия даёт визуальный анализ кривых на рисунках 1 и 2, на которых приведены в графическом виде полученные нами зависимости Wij от уровня концентрации свинца при различных уровнях концентрации кадмия от и, наоборот, уровня концентрации кадмия в моче при различных уровнях концентрации свинца.
Легко увидеть, что зависимость рассматриваемого эффекта (т.е. вероятности над-медианного значения концентрации B2u) от концентрации любого из двух металлов в моче существенно неодинакова при разных уровнях концентрации второго. Так, например, эффект свинца отчётливо нарастает от уровня к уровню его концентрации только на фоне нижнего уровня концентрации кадмия, в то время как на фоне средних и высоких концентраций последнего повышение концентрации свинца даёт нарастание эффекта лишь при переходе от среднего уровня к высокому. То, что на фоне действия средних и высоких концентраций кадмия нарастание концентраций свинца не приводит к нарастанию эффекта (или даже ведёт к его снижению), свидетельствует о частичном подавлении первым нефротоксиче-ского действия второго, то есть об антагонизме.
Как видно из рис. 1, при низких уровнях свинца нарастание сопутствующего воздействия кадмия повышает комбинационный эффект, однако, примерно в равной степени для среднего и высокого уровней этого воздействия, то есть совместный эффект двух металлов несколько меньше аддитивного. При средних уровнях свинца только высокий уровень кадмия повышает этот эффект, в то время как средний уровень кадмия его даже несколько снижает. Однако высокие концентрации свинца дают эффект, не зависящий от уровня сопутствующего воздействия кадмия, то есть вклад последнего в нефротоксичность комбинации полностью подавлен. Все эти соотношения подтверждают принципиальную возможность неодинакового характера комбинированной ток-
сичности при разных количественных соотношениях между компонентами комбинации [2].
Таким образом, при относительно высоких уровнях обоих металлов нефротоксичность свинца явно доминирует; это соответствует и нашим экспериментальным данным, показавшим, что в дозах, равных в долях от соответствующих LD50, свинец вызывает при хроническом отравлении крыс более тяжёлое поражение почек, чем кадмий [10]. Однако, в терминах комбинированной токсичности, это «доминирование» означает подавление свинцом вклада кадмия в развивающийся эффект, то есть антагонизм.
Рассматривая зависимости эффекта от уровня воздействия кадмия при разных уровнях воздействия свинца (рис. 2), мы при всём заметном отличии от только что проанализированных кривых, можем прийти к тем же, в принципе, заключениям. Так, например, мы вновь видим, что при высокой концентрации свинца эффект комбинации не только максимален, но и не зависит от дополнительного вклада кадмия, то есть опять-таки имеет субаддитивный характер (антагонизм). Даже при средней концентрации свинца нарастание эффекта даёт переход от нижнего уровня кадмия только к верхнему, но не к среднему. И только при низкой концентрации свинца предполагаемый антагонизм этого металла действию кадмия не стирает полностью постепенное повышение эффекта с повышением уровня концентрации последнего.
Кроме того, судя по рассчитанным коэффициентам корреляции Спирмена (г^ для зависимости эффекта от уровня концентрации свинца (0.25 при нижнем уровне концентрации кадмия,
о.а
07 ■
0.6 ■
0.5 ■
ЕИ
0.3 ■
0,2 -
0.1
У ' .ш * л
_г "ьа ш — / / --□ / // /
с 1 К V X // //
N / /
■
-о Низкая
концентрация С(1
Средняя
концентрация СЛ
-О Высокая
концентрация са
1 7
Уровень концентрации РЬ
Рис. 1. Зависимость вероятности ) уровня В2и превышающего медианное значение, от уровня концентрации свинца в моче при различных уровнях концентрации кадмия.
0,7
11.1-1
ПЬ -
0.4
0.3
0.2
0.1
Е >--- --- С .--и
7-
_____ У У У
Щ г
-о Низкая
концентрация РЬ
Средняя
концентрация РЬ Высокая
концентрация РЬ
П 1 7
Уровень концентрации Сс1
Рис. 2. Зависимость вероятности )уровня В2и превышающего медианное значение, от уровня концентрации кадмия в моче при различных уровнях концентрации свинца.
свинца статистически значим при любом уровне воздействия кадмия. Напротив, для зависимости эффекта от нарастания воздействия кадмия соответствующий тренд значим только при нижнем уровне воздействия свинца (г = 0.25, p = 0.022), в то время как на среднем уровне он ослабевает (г = 0.13, p = 0.22), а на высоком исчезает (г = 0.02, p = 0.88).
Уравнение регрессии (2), преобразованное в ходе процедуры пошагового исключения переменных на основе использованной базы данных, приобрело следующее выражение:
w = 0,160 + 0,015 са + 0,008 рь - 0,0003 са*рь.
(3)
Приняв W = 0.5, получаем точки, позволившие построить изоболу, показанную на рисунке 3. Вид кривой, типичный для изобол Лёве в случаях менее, чем аддитивной комбинированной токсичности двух веществ [2, 13], подтверждает взаимный антагонизм нефротоксического действия свинца и кадмия.
Тот факт, что два использованных нами независимых подхода к анализу одного и того же массива данных привели к взаимно подтверждающим выводам, усиливает обоснованность заключения о неаддитивном характере действия свинца и кадмия на почки с основным значением (во всяком случае, в располагаемом диапазоне экспозиций) токсикологического антагонизма между этими металлами.
Рис. 3. Кривая линия - изобола равной вероятности ^=0,5) надмедианного значения концентрации микроглобулина В2и при различных соотношениях концентраций свинца и кадмия, построенная по уравнению (3); прямая линия - линия аддитивности.
0.25 при среднем и 0.21 при высоком) и по соответствующим значениям достигнутого уровня значимости р (0.018, 0.021 и 0.049) общий тренд нарастания эффекта при нарастании воздействия
Хотя мы и обозначили два использованных подхода как «анализ на основе парадигмы аддитивности эффектов» и «анализ на основе парадигмы аддитивности доз», однако, мы понимаем, что о полной аналогии соответствующим понятиям экспериментальной токсикологии говорить можно лишь с известной осторожностью: слишком отличается организация эпидемиологического исследования от возможностей строгого планирования эксперимента, например, по типу 22 хотя бы 21; заметно необычны и сами приёмы анализа, в частности, способ построения изоболы Лёве. Тем не менее, принципиальное соответствие наших подходов этим двум токсикологическим парадигмам представляется несомненным.
Заключение. Проведенная работа показала, что для эколого-эпидемиологического исследования вполне применимы сложившиеся в экспериментальной токсикологии понятия «аддитивность», «синергизм» и «антагонизм», и при наличии индивидуальных данных, которые могут рассматриваться как био-маркёры экспозиции к двум фак-
Р СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каган Ю.С., Штабский Б.М. Проблема изучения и оценки комбинированного действия ксенобиотиков // Токсикологический вестник, 1996. - № 5. - С. 2-9.
2. Кацнельсон Б.А. Комбинированное действие химических веществ // Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова. - М.: Медицина, 2002. - С. 497-520.
3. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Кузьмин С.В. и др. Оценка риска как инструмент социально-гигиенического мониторинга / Екатеринбург: АМБ, 2001- 244 с.
4. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Кузьмин С.В. и др. Связь доклинических изменений в почках у детей дошкольного возраста
с содержанием кадмия и свинца в моче // Токсикологический вестник, 2006. - № 4. - С. 35-41.
5. Bernard A.M, Vyskocil A., Roels H. et al. Renal effects in children living in the vicinity of a lead smelter // Environ. Research, 1995. -V. 68. - P. 91-95.
6. de Burbure C., Buchet P., Leroyer A. et al. Renal and neurological effects of cadmium, lead, mercury, and arsenic in children: evidence of early effects and multiple interactions at environmental exposure levels. Environ. Health Persp., 2006. -V. 114. - P. 584-590.
7. de Burbure C., Buchet J.P., Bernard A. et al. Biomarkers of renal effects in children and adults with low environmental exposure to
торам риска и общего для них вредного эффекта, удаётся достаточно простыми, но математически корректными методическими приёмами различить эти типы комбинированной токсичности. В частности, экологически обусловленное повреждающее действие свинца и кадмия на почки у детей является менее чем аддитивным (что является проявлением токсикологического антагонизма).
Показанное совпадение этой оценки типа комбинированной токсичности независимо от того, проводится ли она на базе парадигмы аддитивности эффектов или аддитивности доз является дополнительным аргументом в пользу признания этих парадигм скорее разными моделями сложного процесса комбинированного токсического действия, чем отражающими принципиально различные типы его. Это позволяет рекомендовать не ограничивать анализ эпидемиологических данных, проводимый в целях оценки комбинированного риска, априорным выбором одной из названных моделей, а тестировать подходы, основанные на каждой из них.
heavy metals // J. Toxicol. Environ. Health, 2003. - V. 66. - P. 783798.
8. Katsnelson B.A., Kireyeva E.P., Kuzmin S.V. et al. An association between incipient renal damage and urine cadmium and lead levels in young Russian children: a case control study // European Epi-marker, 2007. - V. 11. - P. 1-8.
9. Price R.G., Patel S., Chivers I. et al. Early markers of nephrotoxicity: detection of children at risk from environmental pollution // Ren. Fail., 1999. - V. 21. - P. 303-308.
10. Privalova L.I., Katsnelson B.A., Soloboyeva J.I. et al. Additional evidence of association between exposure to lead and cadmium and renal disease in children // Epiodemiology, 2008. - V.8. - P. 12.
11. Sühnel J. Zero interaction response surfaces, interactions functions and difference response surfaces for combinations of biologically active agents // Arzneimittelforsch, 1992. - V. 42. - P. 12511258.
12. Verberk M.M., Willems T.E., Verplanke A.J. et al. Environmental lead and renal effects in children // Arch. Environ. Health., 1996. -V. 51. - P. 83-87.
13. Yeh P.J., Hegreness M.J., Aiden A.P. et al. Drug interactions and evolution of antibiotic resistance // Nat. Rev. Microbiol., 2009. -V.7. - P. 460-466.
Katsnelson B.A.1, Kazmer Yu.I.1*,Varaksin A.N. 2, Privalova L.I.1, Panov V.G. 2, Kireyeva Ye.P.1
About the methodology of assessing a combined-type toxicity basing on data of an ecological
and epidemiological study
1 Medical Research Centre for Prophylaxis and Health Protection of Industrial Workers, Ekaterinburg
2 Institute of Industrial Ecology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences
Basing on a previously conducted study which had identified a relationship between the probability of sub-clinic lesion of kidneys in children and a lead and cadmium concentration in urine, it was shown that a combined nephrotoxicity of these metals is less than additive ( toxicological antagonism). The concordance shown of that assessment of a combined toxicity type irrespectively whether it is conducted basing on a paradigm of effects additivity or doses additivity is of theoretical and methodological interest.
Материал поступил в редакцию 28.01.2010 г.
