CC BY
148
БЕБЯКОВА Наталья Александровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой медицинской биологии и генетики Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск). Автор 140 научных публикаций, в т. ч. двух монографий, 7 учебно-методических пособий
ЛЕВИЦКИЙ Сергей Николаевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биологии и генетики Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск). Автор 38 научных публикаций, в т.ч. четырехучеб-но-методических пособий
КОМАНДРЕСОВА Татьяна Михайловна,
кандидат биологических наук, доцент кафедры нормальной физиологии Коми филиала Кировской государственной медицинской академии (г. Сыктывкар). Автор 28 научных публикаций
ШАБАЛИНА Ирина Алексеевна, старший преподаватель кафедры медицинской биологии и генетики Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск). Автор 12 научных публикаций
К МЕХАНИЗМАМ АНТИКОНСТРИКТОРНОГО ЭФФЕКТА ДАЛАРГИНА
Авторами изучен протективный эффект даларгина на тонус сосудов в условиях острого стресса. Установлены клеточные механизмы действия даларгина, ведущим из которых является изменение активности КО-синтаз.
Ключевые слова: стрессорная вазоконстрикция, опиоидные пептиды, даларгин.
Сдвиги в деятельности сердечно-сосудистой системы могут проявляться в росте тонуса периферических сосудов (ПТС). В связи с этим актуальным является поиск веществ, способных предупредить возникновение и развитие вазоконстрикторных реакций.
Опиоидные пептиды (ОП) способны модулировать стрессорную вазоконстрикцию (СВ), но клеточные механизмы их протективного действия на ПТС в условиях острого стресса изучены недостаточно. Ранее нами было выявлено протективное влияние селективных и неселективных агонистов р- и 5-опиатных рецеп-
торов (ОР) на стрессобусловленные изменения ПТС [1, 2].
В настоящее время установлено участие эндотелия сосудов в регуляции местного сосудистого тонуса и формировании системных гемодинамических реакций, кроме того, в эндотелии обнаружены различные типы ОР [3]. Учитывая данный факт, можно предположить, что ОП могут реализовывать свои стресс-лимитирующие эффекты на сердечно-сосудистую систему через эндотелиальные факторы, самыми мощными из которых являются оксид азота (N0) и эндотелин-1 (ЕТ-1) [4].
© Бебякова Н.А., Левицкий С.Н., Командресова Т.М., Шабалина И.А., 2012
Целью исследования являлось изучение взаимодействия лигандов р- и 5-ОР с эндотелиальными вазоактивными системами N0 и ЕТ-1 в условиях СВ.
Материалы и методы. Исследование проведено на половозрелых крысах - самцах популяции Wistar массой 210-250 г. Моделью острого стресса являлась часовая иммобилизация животных в камере без жесткой фиксации. ПТС оценивали по реовазограммам хвостовой артерии крысы, снятым при помощи многофункционального диагностического компьютерного комплекса «Диастом-01» с 5-й по 60-ю минуту стрессирования с интервалом 15 мин, с последующим анализом индекса периферического сопротивления (ИПС).
Уровень продукции N0 оценивали по содержанию его стабильных конечных метаболитов - нитратов и нитритов в плазме крови с использованием реакции Грисса, уровень ЕТ-1 определяли иммуноферментным методом.
Контрольным животным вводили 0,9 мл раствора Рингера внутрибрюшинно перед началом стрессирования.
Даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) - неселективный агонист р- и 5-ОР вводили аналогичным способом в дозе 0,1 мг/кг непосредственно перед началом стрессирования. Блокаду ОР проводили налоксоном (-17-А11у1-4,5-a-epoxy-3,14-dihydroxymorphinan-6-one-hydrochloride) (С19Н2Ш04) - неселективным антагонистом ОР в дозе 0,7 мг/кг, в которой он
проявляет свойства антагониста, а не только оказывает анальгетический эффект. Считается, что механизм действия налоксона основан на конкурентном антагонизме вытеснения агониста опиоидов из его связи с ОР Налоксон устраняет действие эндогенных и экзогенных ОП, предотвращает эффекты опиоидных анальгетиков, ослабляет гипотензивный эффект и традиционно применяется при проведении исследований роли эндогенных и экзогенных опиоидов в функционировании сердечно-сосудистой системы [5, 6].
Для оценки степени участия NO в модулирующем эффекте даларгина проводили предварительную блокаду NO-синтаз. В качестве бло-катора использовали L-NG-нитро-L-аргинин (LNNA), который вводили в дозе 20 мг/кг за 10 мин до начала стрессирования.
Для блокады эндотелиновых рецепторов (ЭР) использовали их неселективный антагонист N-Acetyl-a-[10,11-Dihydro-5H-dibenzoacycloheptadien-5yl]-D-Gly-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (PD 145,065), который вводили в дозе
0,3 мг/кг аналогичным способом. Дозу и способ введения препаратов подбирали исходя из литературных данных об их кардиоваскулярных эффектах [7-9].
Обработка результатов предусматривала вычисление среднего значения показателей и стандартной ошибки среднего. Оценка статистической значимости различий между контрольной и экспериментальными группами
СТРЕССОБУСЛОВЛЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЕ ИПС
Экспериментальная ИПС, усл. ед. на 5-й минуте ИПС, усл. ед. на 60-й минуте
серия стрессирования стрессирования
Контроль 72,5±1,8 133,6±2,1
Налоксон 79,8±2,3 156,8±2,5***
LNNA 95,7±1,2*** 161,2±1,9***
PD 145,065 70,4±1,3 113,5±1,7***
PD 145,065+даларгин 44,2±2,0*** 92,2±1,5***
Даларгин 55,6±2,4** 114,1±5,3**
LNNA+даларгин 81,2±0,8 155,9±2,5***
Примечание. Достоверные изменения по сравнению с контролем: *** - р<0,001, ** - р<0,01.
проводилась с помощью ^критерия Стьюдента при помощи программы «Biostatistica». Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
В контрольной серии экспериментов на протяжении всего срока иммобилизации наблюдался стрессобусловленный рост ПТС: ИПС к 60-й минуте иммобилизации увеличивался на 84,3 % по сравнению с 5-й минуты (р<0,001) (см. таблицу). При этом уровень N0 снижался на 30,8 % (р<0,001), а уровень ЕТ-1 повышался на 14,0 %, что доказывает процесс функциональной перестройки эндотелия сосудов, в результате чего повышается его синтетическая активность и изменяется сбалансированная секреция вазоактивных эндотелиальных факторов, регулирующих сосудистый тонус (рис. 1, 2).
На фоне блокады ОР налоксоном рост ИПС был более выраженным по равнению с контролем: к 60-й минуте он был выше на 33,2 % (р<0,001), что доказывает участие ОР в регуляции ПТС в условиях острого стресса (см. таблицу). В данных условиях уровень ЕТ-1 был выше контрольных значений на 142,0 % (р<0,001) и на 177,0 % выше, чем у интактных животных (р<0,001), что говорит о том, что в условиях СВ эндогенные ОП сдерживают выброс данного вазоконстрикторного фактора, а блокада ОР устраняет сдерживающий фактор, что и проявляется в гиперпродукции ЕТ-1 и ро-
сте ПГС. При введении налоксона уровень NO также увеличивался по сравнению с контролем на 54,5 % (р<0,001), что связано с активацией специфических ЭP, гиперпродукцией ET-1 и является, скорее всего, компенсаторным механизмом (рис. 1, 2).
Активация р- и 5-OP даларгином приводила к менее выраженной вазоконстрикторной реакции: ИПС на 60-й минуте был на 14,6 % ниже контрольных значений (р<0,001), что показывает его протективное действие на стрессобус-ловленный рост ПТС (см. таблицу). При этом уровень NO повышался на 134,1 % по сравнению с контролем (р<0,001), в то время как уровень ET-1 понижался незначительно (на 18,3 %) (р<0,05) (рис. 1, 2).
Следует отметить, что предварительная блокада OP снимала протективный эффект даларгина на СВ: ИПС к 60-й минуте стрессирования был на 37,4 % выше, чем на фоне введения даларгина (р<0,001), что свидетельствует о рецепторной природе действия даларгина на рост ПТС. При этом уровень NO был на 37,5 % выше, чем при блокаде OP и на 10,2 % ниже, чем при активации OP, что говорит о взаимосвязи между OП и системой синтеза NO. Уровень ET-1 был на 55,7 % ниже, чем при блокаде OP налоксоном и на 50,0 % выше, чем активации OP даларгином (р<0,001).
Для решения вопроса о степени участия ET-1 в регуляции стрессобусловленных изме-
экспериментальные серии
уровень
□ контроль Ш налоксон ■ даларшн
В налоксон+даларгин
□ LNNA
□ LNNA+даларгин Ш PD145,065
рис. 1. Стрессобусловленные изменения уровня оксида азота
экспериментальные серии
ЕШ базовый уровень Шконтроль ■ налоксон □ даларгин И налоксон+даларгин HLNNA
Щ LNNA+даларгин HPD145.065 В Р0145,065+даларгин
рис. 2. Стрессобусловленные изменения уровня эндотелина-1
нений ПТС была проведена серия экспериментов с введением неселективного антагониста ЭР - PD 145,065. Блокада ЭР также приводила к протективному эффекту на стрессобуслов-ленные изменения ПТС, так как гемодинами-ческие изменения на стресс были менее выраженными по сравнению с контролем: ИПС на 60-й минуте стрессирования был на 15,0 % ниже, чем в контроле (р<0,001), хотя протек-тивный эффект начинался только с 15-й минуты иммобилизации (см. таблицу).
В условиях блокады ЭР наблюдалось резкое увеличение уровня ЕТ-1. Это вероятно, связано с тем, что снижение концентрации активных ЭР в эндотелии кровеносных сосудов при их блокаде, приводит к увеличению концентрации соответствующего агониста [10]. Причем введение PD 145,065 интакт-ным животным повышало уровень ЕТ-1 на
47.9 % (р<0,05), а при блокаде ЭР на фоне стресса уровень ЕТ-1 повышался на 77,7 % (р<0,001) (рис. 1, 2).
В условиях блокады ЭР наблюдалось изменение концентрации N0. Так, введение PD 145,065 интактным животным повышало уровень N0 на 17,7 % (р<0,001) по сравнению с интактными животными без блокады ЭР и на
81.9 % по сравнению с уровнем N0 у животных в контрольной серии (р<0,001). На фоне блокады ЭР в условиях острого стресса уровень N0 повышался на 22,9 % (р<0,001) по сравнению с контролем и был ниже, чем у интактных животных на 16,0 % (р<0,001). Эти данные подтверждают важную роль ЕТ-1 и N0 в формировании СВ.
На фоне сочетанного действия блокады ЭР и последующей активации ОР даларгином наблюдался суммарный протективный эффект на СВ, который был выше протективного эффекта как на фоне изолированного действия блокато-ра ЭР, так и изолированного действия даларги-на: ИПС в данной серии эксперимента был на 18,8 % ниже, чем на фоне введения блокатора
ЭР (р<0,001) и на 19,2 % ниже, чем на фоне введения даларгина (р<0,001).
Стимулированный блокадой ЭР уровень ЕТ-1 на фоне введения даларгина снижался лишь на 10,5 %. При этом уровень NO повышался на 35,6 % (р<0,001) (рис. 1, 2).
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что протективный эффект даларгина на СВ в большей степени связан с изменением активности системы NO, но нельзя исключить и влияние даларгина в условиях стресса на уровень ЕТ-1.
Для выявления участия NO в регуляции СВ была проведена серия экспериментов с введением ингибитора NO-синтаз - LNNA. На фоне блокады синтеза NO в условиях острого стресса направленность изменений показателей ПТС совпадала с контролем, однако приводила к более существенному росту ИПС: к 60-й минуте иммобилизации ИПС был выше контрольного на 20,7 % (р<0,001) (см. таблицу). На фоне введения LNNA уровень NO понижался на 39,8 % (р<0,001) по сравнению с контролем и на 61,0 % по сравнению с базовым уровнем (р<0,001). Однако в данных условиях не наблюдалось достоверного снижения уровня ЕТ-1 по сравнению с контрольными значениями: он был ниже соответствующих показателей лишь на 7,3 % (рис. 1, 2).
Предварительная блокада NOS с последующей активацией р- и 5-ОР даларгином не приводили к снижению стрессобусловленных показателей ПТС: ИПС к концу иммобилизации был лишь на 3,3 % ниже, чем на фоне изолированного введения LNNA. В этих условиях не наблюдался повышенный уровень NO, который был выявлен в условиях стресса на фоне введения даларгина, что свидетельствует о связи даларгин-опосредованного увеличения уровня NO в условиях острого стресса с активацией NO-синтаз.
Таким образом, было установлено, что предварительная блокада NOS приводила к ис-
чезновению протективного эффекта даларгина на стрессобусловленный рост ПГС. Учитывая, что даларгин-индуцированный уровень NO был связан с изменением активности NOS, а также тот факт, что на фоне сочетанного действия блокады ЭP с последующей активацией OP даларгином наблюдался суммарный про-тективный эффект на стрессобусловленную
вазоконстрикцию, который был выше протективного эффекта как на фоне изолированного действия блокатора ЭP, так и изолированного действия даларгина, можно сделать вывод, что ведущим механизмом в протек-тивном эффекте даларгина на стрессорную вазоконстрикцию является изменение активности NO-синтаз.
Список литературы
1. Роль опиоидергической системы в модуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса / Н.А. Бебякова, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын и др. // Клиническая физиология кровообращения. 2006. № 3. С. 45-49.
2. Влияние агониста д-опиатных рецепторов DAGO на тонус периферических сосудов при остром стрессе / Н.А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Семушкина, С.Д. Михайлова // Вестн. РГМУ 2010. № 3. С. 70-73.
3. Presence of the 3 Opiate Receptor in Endothelial Cell / G.B. Stefano, A. Hartman, T.V Bilfinger et al. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 27. №51. Р. 30290-30293.
4. Омельянович Д.А. Паракринная функция эндотелия // Вопросы биол. мед. и фармак. химии. 2006. №3. С. 51-56.
5. Молекулярные аспекты фармакологической активности налтрексона и налоксона / А.И. Головко,
С.И. Головко, Л.В. Леонтьева и др. // Эксперим. и клин. фармакология. 2005. № 1. С. 71-78.
6. Осадчий О.Е. Кардиоваскулярные эффекты блокатора опиоидных рецепторов налоксона // Эксперим. и клин. фармакология. 2001. № 3. С. 72-75.
7. Куприна А.А. Ингибиторы эндотелиновых рецепторов: новый класс лекарственных средств для лечения сердечной недостаточности // Фарматека. 2005. № 8. С. 32-35.
8. Стимуляция д- и 5- опиатных рецепторов и устойчивость изолированного сердца к окислительному стрессу: роль NO-синтазы / Т.Ю. Реброва, Л.Н. Маслов, А.Ю. Лишманов, С.В. Там // Биохимия. 2001. Т. 66. № 4. С. 520-527.
9. Chronic Endothelin Receptor Blocade Attenuates Progressive Ventricular Dilatation and Improves Cardiac Function in Rats with Myocardial Infarction: Possible Involvement of Myocardial Endothelin System in Ventricular Remodeling / D. Fraccarollo, K. Hu, P. Galuppo et al. // Circulation. 1997. Vol. 96. P. 3963-3973.
10. Alration in Cardiac Autonomic Receptors Following Chemical Sympathectomy / S. Yamada, H. Yamamura,
W. Roeske // Circulation. 1979. Vol. 60. № 4. Р. 275.
Bebyakova Natalia Alexandrovna
Northern State Medical University, Department of Medical Biology and Genetics,
Levitsky Sergey Nikolaevich
Northern State Medical University, Department of Medical Biology and Genetics,
Komandresova Tatiana Mikhailovna
Komi Branch of the Kirov State Medical Academy, Normal Physiology Department,
Shabalina Irina Alexeevna
Northern State Medical University, Department of Medical Biology and Genetics
ON THE MECHANISMS OF DALARGIN ANTI-CONSTRICTOR EFFECT
The protective effect of dalargin on the vascular tone under sharp stress has been studied. Cellular mechanisms of dalargin effect have been assertained, the main one being the change of NOS activity.
Key words: stress-induced vasoconstriction, opioid peptides, dalargin.
Контактная информация: Бебякова Наталья Александровна e-mail: nbebyakova@mail.ru Левицкий Сергей Николаевич e-mail: sergeylevitski@yandex.ru Шабалина Ирина Алексеевна e-mail: _ira_sha@mail.ru
Рецензент - Щёголева Л.С., доктор биологических наук, профессор, заведующая отделом экологической иммунологии, заведующая лабораторией физиологии иммунокомпетентных клеток Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения Российской академии наук (г. Архангельск)
