CC BY
132
УДК 579.66
Ефименко Т.А.1, Маланичева И.А.1, Зенкова В.А.1, Королев А.М.1, Остерман И.А.2, Сергиев П.В.2, Ефременкова О.В.1
1Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. ГФ. Гаузе Российской академии медицинских наук 2Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова E-mail: efimen@inbox.ru
ИЗЫСКАНИЕ АНТИБИОТИКОВ, ЭФФЕКТИВНЫХ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ С ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ, НА ПРИМЕРЕ BACILLUS PUMILUS -ПРОДУЦЕНТА АНТИБИОТИКА АМИКУМАЦИНА А
Изыскание продуцентов антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость патогенных бактерий, проводили с применением на ранних этапах отбора резистентных тест-штаммов -метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) и сапрофита Leuconostoc mesenteroides с высоким уровнем устойчивости к гликопептидным антибиотикам группы ванкоми-цина. Среди отобранных природных изолятов исследован штамм, отнесенный на основании морфологических и генетических данных к виду Bacillus pumilus. Показано, что из трех образуемых им антибиотиков эффективным в отношении обоих устойчивых тест-штаммов является амикумацин А.
Ключевые слова: Bacillus pumilus, Leuconostoc mesenteroides, лекарственная устойчивость бактерий, MRSA, устойчивость к гликопептидным антибиотикам, амикумацин А.
Введение
За прошедшие годы после открытия в 1928 году пенициллина описано более 30000 природных антибиотиков [1], из которых в медицине применяется примерно 150. Однако развитие механизмов устойчивости у патогенных бактерий в настоящее время привело к критической черте - многие возбудители инфекционных заболеваний становятся невосприимчивыми к современным лекарственным средствам. Такое положение требует поиска новых антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость бактерий , а также анализа известных антибиотиков на соответствие современным вызовам и возможности их использования в медицине. В настоящей работе проводили поиск продуцентов антибиотиков, основанный на использовании при отборе тест-штаммов с определенной лекарственной устойчивостью, и описание выделенного из почвы штамма Bacillus pumilus INA 01087 - продуцента антибиотика амикумацина А.
Материалы и методы
Тест-штаммы. В качестве тест-штаммов для определения антимикробной активности использовали следующие микроорганизмы: грам-положительные бактерии - Bacillus subtilis АТСС 6633, B. pumilus NCTC 8241, B. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, Leuconostoc mesenteroides VKPM B-4177 (штамм, устойчивый
к гликопептидным антибиотикам группы ван-комицина, с минимальной подавляющей концентрацией (МПК) 400 мкг/мл), Staphylococcus aureus FDA 209P (штамм, чувствительный к бета-лактамным антибиотикам, - meticillin-sensitive S. aureus - MSSA), S. aureus INA 00761 (штамм, устойчивый к бета-лактамным антибиотикам, -meticillin-resistant S. aureus - MRSA, с МПК 32 мкг/мл), грамотрицательные бактерии -Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, и грибы - Aspergillus niger INA 00760, Saccharomyces cerevisiae RIA 259.
Условия культивирования. На агаровой среде штамм INA 01087 выращивали при температуре 37°С, глубинное культивирование проводили при 28°С. Для поверхностного культивирования использовали модифицированную агаровую среду №2 Гаузе следующего состава (%): глюкоза - 1, пептон - 0,5, триптон - 0,3, NaCl - 0,5, агар - 2; рН 7,2-7,4. Для глубинного культивирования использовали ту же среду без агара. Глубинное культивирование осуществляли в колбах Эрленмейе-ра объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (220 об/мин). Среду засевали суспензией спор в количестве 105 мл.
Грибные тест-штаммы и L. mesenteroides выращивали при температуре 28°С, все другие штаммы - при 37°С.
Выделение штаммов бактерий из почвы. Водную суспензию почвы тщательно перемешивали на шейкере и рассевали на агаровую
среду. Отдельные колонии пересевали в пробирки на скошенный агар, инкубировали несколько суток, подтверждали гомогенность культуры с помощью микроскопирования и высевали в колбы. На 2, 4, 7 и 9 сутки культивирования культуральную жидкость исследовали на антимикробную активность методом диффузии в агар в отношении 11 тест-штаммов.
Продуцент антибиотика. Бактериальный штамм - продуцент антибиотика амикумаци-на А, был выделен из образца выщелоченного чернозема (Краснодарский край, Россия). Штамм депонирован в Коллекции культур Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН под номером INA 01087.
Микроскопирование. Исследование проводили с помощью светового микроскопа Olympus BX41TF (Япония). При окрашивании по Граму в качестве положительного и отрицательного контроля использовали штаммы B. subtilis АТСС 6633 и E. coli ATCC 25922, соответственно.
Определение антимикробной активности. Антимикробную активность определяли методом диффузии в агар. Об уровне антимикробной активности в культуральной жидкости судили по диаметрам зон задержки роста тест-культур вокруг лунок в агаровой среде диаметром 9 мм, в которые закапывали испытуемый раствор. По ходу выделения и очистки антибиотика испытуемые образцы наносили на бумажные диски, которые помещали на поверхность агаровой среды с высеянной тест-культурой.
Анализ нуклеотидных последовательностей части гена 16S рРНК бактериальных штаммов. ДНК выделяли методом [2]. Для амплификации ДНК гена 16S рРНК методом по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали универсальные консервативные прайме-ры прокариот 27f и 1492г. Были выбраны режимы проведения ПЦР: (1) 94°С - 5 мин, (2) 30 циклов с чередованием температурных интервалов 94°С - 1мин, 51°С - 1 мин, 72°С -2мин, (3) 72°С - 7мин. Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1% ага-розном геле при напряженности электрического поля 5 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР осуществляли методом спиртового переосаждения ДНК в мягких условиях (0,125М ацетата аммония в 70% этиловом спирте). Секвенирование ДНК очищенных фрагментов проводили на автоматическом секве-
наторе Genetic Analyzer 3500 (Applied biosystems, США). Для анализа последовательностей и построения дерева родства использовали базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) [3] и Ribosomal Database Project (http://www.cme.msu.edu) [4].
Выделение и очистка амикумацина А. Фильтрат культуральной жидкости, содержащей антибиотики амикумацины А и В, наносили на сорбент Amberlyte XAD-2 и элюиро-вали смесью н-бутанол-ацетон-вода (1:1:1). Полученные элюаты упаривали в вакууме досуха при 37°С, сухой остаток растворяли в 60%-м водном этаноле. Дальнейшую очистку амикумацина А проводили на колонке размером 14x180 мм, заполненной силикагелем Kieselgel 60 (Merck, США). Антибиотики последовательно элюировали системами растворителей - этилацетат-этанол (4:1) и хлороформ-метанол (7:3). Полученные фракции анализировали методом UV-VIS-спектрофо-тометрии на приборе Thermo Scientific™ NanoDrop 2000 (США) и методом диффузии в агар для выявления антимикробного действия в отношении тест-бактерии S. aureus INA 00761 (MRSA). Окончательную очистку проводили с помощью препаративной ВЭЖХ, используя хроматограф Agilent1200 (США) на колонке Luna 5u C18(2) 100A размером 250x4,60 мм (Phenomenex, США). Объем петли инжектора - 20 мкл. Детектирование проводили при длине волны 240 нм (^max выделяемых антибиотиков). Элюирование проводили системой 0,2 М ацетат аммония рН 7,5 - ацетонитрил в градиентном режиме, повышая содержание ацетонитрила от 0 до 80% при скорости потока - 1мл/мин-1. Раствор амикумацина А лиофилизировали и хранили в сухом виде в темноте при -70°С. Структуру амикумацина А подтвердили методом MALDI-TOF-TOF масс-спектрометрии на приборе Ultraflextreme (Германия).
Результаты и обсуждение
Одними из самых распространенных опасных патогенов, устойчивых к антибиотикам, в настоящее время являются метициллинрезис-тентный золотистый стафилококк (MRSA). Последнее десятилетие для лечения заболеваний, вызванных MRSA, применяют гликопеп-тидные антибиотики группы ванкомицина, од-
Ефименко Т.А. и др.
Изыскание антибиотиков, эффективных в отношении...
нако стали все чаще фиксироваться патогенные бактерии, устойчивые также и к этой группе антибиотиков. Учитывая это, мы на раннем этапе поиска проводили отбор продуцентов антибиотиков для химического изучения на основании эффективности их культуральной жидкости в отношении тест-штаммов S. aureus INA 00761 и L. mesenteroides VKPM B-4177.
Среди выделенных штаммов нами был отобран для дальнейшего исследования штамм INA 01087, культуральная жидкость которого проявляет на высоком уровне антимикробную активность в отношении S. aureus INA 00761 и L. mesenteroides VKPM B-4177 начиная со вторых суток роста. Выделение и очистку проводили при анализе антибиотической активности в отношении тест-штамма S. aureus INA 00761. Показано, что штамм INA 01087 образует не менее трех антибиотиков, из которых один представляет наибольший интерес, проявляя активность в отношении как S. aureus INA 00761, так и L. mesenteroides VKPM B-4177, но не в отношении грамотрицательных бактерий и грибов (табл. 1).
Морфологическое исследование показало, что клетки штамма INA 01087 грамположитель-
ны, палочковидны, размером 1х(3-4) мкм, на вторые сутки культивирования на агаровой среде формируют характерные для бацилл эндоспоры, содержание которых на 11 сутки близко к 100%. Штамм формирует круглые бежевые блестящие колонии с ровным краем, экзопигмент отсутствует.
Таблица 1. Спектр антибиотической активности культуральной жидкости штамма INA 01087.
Тест-штаммы Зоны задержки роста (мм)
Bacillus subtilis АТСС 6633 (=RIA 445) 11
Bacillus mycoides 537 11
Bacillus pumilus NCTC 8241 0
Leuconostoc mesenteroides VKPM B-4177 25
Micrococcus luteus NCTC 8340 30
Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA) 28
Staphylococcus aureus INA 00761 (MRSA) 28
Escherichia coli ATCC 25922 21
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0
Aspergillus niger INA 00760 12
Saccharomyces cerevisiae RIA 259 14
98
Ё1 34
45
ЭЭ
100
47j— AJ276351.1 _ 51 [L HQ223107.1 -AF074970.1. — АВ021191.1 -АВ021198.1. -GQ281299.1 АВ255669.1 EU194897.1. АВ021181.1 СР000002.3
5о|__| бсП—
92
90|KF717600.1
AY876289.1. — AF234854.2_ AJ831844.2. AJ831842.1_ AJ831841.2. AY904033.1
ЭЭ
Bacillus_subtilis_(T)_DSM10 _Bacillus_tequilensis_(T)_10b _Bacillus_subtilis_(T)_NRRL_B-23049 _Bacillus_niojavensis_(T)_IF015718 _Bacillus_vallisniortis_(T)_DSM11031 _Bacillus_siamensis_(T)_PD-A10 _Bacillus_arriyloliquefaciens_(T)_NBRC_15535 .Bacillus jriethylotrophicus_(T)_CBMB205 _Bacillus_atrophaeus_(T)_JCM9070 _Bacillus_licheniforrni s_(T)_ATC C_14580_D S M_13
_B а с 111 u s_p u mi I u s_(T)_ATC C_7061 _Bacillus_safensis_(T)_FO-036b Bacillus_aerophilus_(T)_1y pe_strain:2BK Bacillus_altitudims_(T)_type_stram:41 KF2b Bacillus_stratosphericus_(T)_type_strair:41 KF2a _Bacillus_idriensis_(T)_SMC_4352-2
4
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
Рисунок 1. Филогенетическое положение штамма Bacillus pumilus INA 01087 на основе последовательности гена 16SpPHK (последовательность гена депонирована в Genbank под номером KF17600.1). Масштаб - 5 нуклеотидных замен на 1000 нуклеотидов. Цифры - достоверность ветвления по «bootstrap^-анализу 100 альтернативных деревьев
Для дальнейшего изучения штамма ампли-фицировали ДНК гена 16S рРНК с помощью ПЦР и провели ее секвенирование. Была проанализирована последовательность гена длиной 1503 н.о., депонированная в GenBank под номером KF717600. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что анализируемая последовательность ДНК на 100% идентична с последовательностями штаммов B. pumilus. Последовательность была выровнена с соответствующими последовательностями типовых штаммов ближайших видов бактерий из базы данных RPD. С помощью программы Mega 5.2.2 на основе типовых штаммов было построено дерево филогенетического родства (рис. 1).
На основании морфологических и генетических данных штамм был отнесен к виду Bacillus pumilus и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН под номером INA 01087.
Выделение и очистка антибиотика с последующим анализом методом MALDI-TOF-TOF масс-спектрометрии показали наличие двух ранее описанных антибиотиков - амикумаци-нов А и В (рис. 2), из которых указанной биологической активностью обладает амикумацин А.
Структура амикумацина А и его антибиотическое действие в отношении грамположи-тельных бактерий впервые были описаны в 1981 году, при этом авторы особое внимание отдавали не антибактериальным свойствам вещества, а его способности купировать отеки конечностей и язву желудка у мышей [5]. В настоящее время известно 11 антибиотиков
OR, О
R, = н. R;=NH; -423 (амикуиацин А) R, = Н, - ОН -424 (амикуиацин В)
ОН О .¿(об (иетабошгг-
пре щнес твенник или продукт расще пленил амикумацина В)
Рисунок 2. ВЭЖХ н структуры антибиотиков амикумацинов А и В, выделенных из культуральной жидкости штамма Bacillus pumilus INA 01087
амикумацинов - аналогов амикумацина А, которые наряду с антибактериальной активностью обладают разнообразным спектром биологической активности, включая противоопухолевую, антивирусную, антигельминтную, ре-тардантную. В соответствии с потребностью времени в 2012 году опубликована информация об эффективности этого антибиотика в отношении штаммов MRSA и VISA (vancomycin intermediate Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus с умеренным уровнем устойчивости в ванкомицину) [6], [7]. Нами установлено, что амикумацин А эффективен как в отношении MRSA, так и штамма L. mesenteroides VKPM B-4177 с высоким природным уровнем устойчивости к гликопептид-ным антибиотикам группы ванкомицина. Таким образом, амикумацин А является примером «старых новых антибиотиков», интерес к которым возник на современном этапе.
14.10.2014
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект №13-04-01658 А) и Российского Научного Фонда (грант номер 14-24-00061)
Список литературы:
1. Berdy J. Bioactive microbial metabolites // J. Antibiot. - 2005. - V. 58. - №1. - Р. 1 - 26.
2. PCR protocols: a guide to methods and applications / Eds. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White; New York: Academic Press. 1990. - 26 с.
3. The National Center for Biotechnology Information (NCBI) [Электронный ресурс] // Maryland, USA. GenBank. URL: (www.ncbi.nlm.nih.gov) (дата обращения 18.09.2014).
4. The Center for Microbial Ecology (CME) [Электронный ресурс] // Michigan State University. RDP (Ribosomal Database Project). URL: (http://www.cme.msu.edu). (дата обращения 18.09.2014).
5. Itoh J., Omoto S., Shomura T., Nishizawa N., Miyado S., Yuda Y., Shibata U., Inouye S. Amicoumacin-A, a new antibiotic with strong antiinflammatory and antiulcer activity // J. Antibiot. - 1981. - V. 34. - №5. - Р. 611-613.
6. Lama A., Jan Pane-Farre J., Chon T., Weirsma AM, Sit C.S., Vederas J.C., Hecker M, Nakano M.M. Response of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus to Amicoumacin A // PLoS One. - 2012. - V. 7. - №3. - Р. 1-13.
7. Li Y., Xu Y., Liu L., Han Z., Lai P.Y., Guo X, Zhang X, Lin W, Qian P. Five new amicumacins isolated from marine-derived bacterium Bacillus subtilis // Mar. Drugs. - 2012. - V. 10. - №2. - Р. 319-328.
Ефименко Т.А. и др.
Изыскание антибиотиков, эффективных в отношении..
Сведения об авторах:
Ефименко Татьяна Александровна, младший научный сотрудник, аспирант Сектора поиска природных соединений, преодолевающих устойчивость бактерий отдела Микробиологии Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: efimen@inbox.ru
Маланичева Ирина Алексеевна, старший научный сотрудник Сектора поиска природных
соединений, преодолевающих устойчивость бактерий отдела Микробиологии Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: malanicheva.irina@yandex.ru
Зенкова Валентина Александровна, старший научный сотрудник лаборатории химического изучения биологически активных соединений микробного происхождения Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: ovefr@yandex.ru
Королев Александр Михайлович, ведущий научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, е-mail: korolev_am@mail.ru
Ефременкова Ольга Владимировна, руководитель сектора поиска природных соединений, преодолевающих устойчивость бактерий отдела Микробиологии Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, кандидат биологических наук, е-mail: ovefr@yandex.ru
119021, г. Москва, Б. Пироговская, 11, стр. 1
Остерман Илья Андреевич, старший научный сотрудник факультета биоинформатики и биоинженерии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, кандидат биологических наук, е-mail: osterman@yandex.ru
Сергиев Петр Владимирович, профессор факультета биоинформатики и биоинженерии Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова, доктор химических наук,
е-mail: petya@mail.genebee.msu.ru
119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 73
