CC BY
22
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ CD40 И CD40L В КАЧЕСТВЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРОВ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ, ВЫЗВАННЫХ ПРИМЕНЕНИЕМ БЕТА-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ
А.О. Чикало, Д.А. Сычёв
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва doltshpir@gmail. сот
Резюме: Бета-лактамные антибиотики находят широкое применение в клинической практике, являясь препаратами выбора для лечения внебольничных инфекций в т.ч. JIOP-органов, верхних и нижних дыхательных путей и т.д. Однако их применение на практике ограничено целым спектром неблагоприятных побочных реакций, наиболее частыми из них в клинической практике являются аллергические реакции. Аллергия на пеницилпины и цефалоспорины чаще всего проявляется в виде гиперчувствительности немедленного типа вплоть до анафилактического шока. В настоящее время для прогнозирования такого рода неблагоприятных реакций активно идёт поиск генетических предикторов, которые позволили бы быстро и заблаговременно определять наличие аллергии на антибиотики у пациента. В данной статье даются результаты генотипирования российской популяции пациентов по полиморфным маркерам rs1883832 гена CD40 и rs3092952 гена CD40L, с оценкой возможности использования их в качестве генетических предикторов.
Ключевые слова: Бета-лактамные антибиотики, неблагоприятные побочные реакции, генетические предикторы, CD40, CD40L.
STUDY OF APPLICATION OF GENE POLYMORPHISMS CD40AND CD40LAS GENETIC PREDICTORS OF HYPERSENSITIVITY REACTIONS CAUSED BY THE USE OF BETA-LACTAM ANTIBIOTICS
A. O. Chikalo, D.A. Sychev
Abstract: Beta-lactam antibiotics are still widely used in clinical practice, as the drugs of choice for the community-acquired infections treatment ineluding ENT, upper and lower respiratoiy tract infections. However, their application in practice is limited to a range of adverse drug reactions, the most common of these in clinical practice are allergic reactions. Allergy to penicillins and cephalosporins is most often seen in the form of cutaneous immediate hypersensitivity, up to anaphylactic shock and death. At the present time the world is searching for genetic predictors to predict these kind of adverse reactions and to detect the presence of allergy to antibiotics in patient. This article describes the results ofgenotyping of the Russian patients population for polymorphic markers rs1883832 ofCD40gene and rs3092952 of CD40L gene, an assassment estimate of the possibility of using them as genetic predictors.
Key words: Beta-lactam antibiotics, adverse drug reactions, genetic predictor, CD40, CD40L.
Открытие пенициллина — огромная победа современных биологической, медицинской и химической наук, что особенно наглядно проявилось в годы Второй мировой войны. Применение пенициллина при лечении раненых на фронтах Второй мировой войны спасло многие тысячи жизней. С не меньшим успехом бета-лактамные антибиотики применяются в медицинской практике и в настоящее время [1]. Однако бета-лактамные антибиотики могут принести не только пользу, но и вред: на фоне их применения в ряде случаев наблюдаются неблагоприятные побочные реакции (НПР), чаще всего в виде реакций гиперчувствительности немедленного типа, наиболее опасные из которых — анафилактический шок, который может привести к смерти.
В настоящий момент времени мы фокусируем свои исследования на поиске генетических предикторов развития реакций гиперчувствительности,
вызванных применением бета-лактамных антибиотиков. В качестве потенциальных мишеней, нас в первую очередь интересуют полиморфизмы (в виду относительной лёгкости их обнаружения) генов, отвечающих за функционирование элементов иммунной системы, которые в свою очередь и формируют аллергическую реакцию.
ВЫБОР ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ И ОДНО НУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ
В соответствии с нашей стратегией поиска генетических предикторов реакций гиперчувствительности немедленного типа (более подробно и полно наша стратегия подбора генетических мишеней изложена в статье «Поиск генетических предикторов реакций гиперчувствительности, вызванных применением бета-лактамных антибиотиков») для данного исследования мы выбрали полиморфизм гб1 883832 гена СБ40 и полиморфизм гз3092952 гена СБ40Ь.
Таблица Характеристика мишеней-предикторов развития реакций гиперчувствительности, вызванных применением бета-лактамных антибиотиков
Полиморфизм Ген Число сообщений Функции гена MAF*(NCBI)
rsl 883832 CD40 ОТ Костимуляция выработки антител В-клетками [2] 0,245
rs3092952 CD40L А > G Белок, кодируемый этим геном экспрессируется на поверхности Т-клеток. Регулирует функцию В-клеток путём привлечения СС40 на поверхности В-клеток [2]. 0,286
MAF = (minor allele frequency) (частота встречаемости рецессивного аллеля, данные NCBI).
Выбор был сделан в пользу именно этих полиморфизмов, так как к настоящему времени уже достаточно хорошо изучены функции белков, которые кодируют гены-мишени, известен и находится в свободном доступе их генетический код и что очень важно ранее они были изучены на корейской популяции пациентов исследователями Sae-H Kim, J-E Lee и другими. В результате своего исследования [4] Sae-H Kim et. al. обнаружили, что, взятые по отдельности, полиморфизмы rsl883832 и rs3092952 не могут быть проассоциированы с развитием реакций гиперчувствительности, вызванных применением бета-лак-тамных антибиотиков. Однако это же исследование показало, что с реакциями гиперчувствительности может быть проассоциировано единовременное но-сительство человеком этих двух полиморфизмов.
Таким образом, опираясь на всё вышеизложенное, с помощью описываемого исследования мы решили оценить возможный вклад полиморфизмов rsl883832 и rs3092952 в развитие реакций гиперчувствительности немедленного типа, вызванных применением бета-лактамных антибиотиков, для российской популяции пациентов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытную группу включили 58 пациентов с атопической формой бронхиальной астмы и с кожными проявлениями гиперчувствительности немедленного типа, обнаруженных при применении бета-лак-тамных антибиотиков. В контрольную группу вошло 103 человека из общей российской популяции.
Для идентификации генотипов по полиморфным маркерам rsl883832 (ген CD40), rs3092952 (ген CD40L) в своём исследовании мы применили метод аллель-специфической ПЦР (аллель-специфическая полимеразная цепная реакция). Метод основан на неспособности Taq-ДНК полимеразы инициировать синтез ДНК на праймерах, 3’- концевой нуклеотид которых некомплементарен матричной ДНК [3].
Праймеры были подобраны с помощью программы Vector NTI advance 10 (Invitrogen, США) в соответствии с требованиями метода. Затем их специфичность была проверена с помощью находящейся в свободном доступе программы primer BLAST (NCBI).
Статистические расчёты выполняли с помощью программы GraphPad InStat 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате исследования мы получили следующие распределения генотипов в опытной и контрольной группах:
Ген СБ40 (гв1883832)
"Опытная группа"
Т\Т 6 человек 10,30%
т\с 20 человек 34,50%
с\с 32 человек 55,20%
Всего: 58 человек
"Контрольная группа"
Т\Т 11 человек 10,70%
т\с 44 человек 42,70%
с\с 48 человек 46,60%
Всего: 103 человек
Различия оказались статистически не значимы-
ми: Xi2= 0,109; р= 0,94.
Ген CD40L (rs3092952)
"Опытная группа"
G\G 4 человек 6,90%
G\A 12 человек 20,70%
А\А 42 человек 72,40%
Всего: 58 человек
"Контрольная группа"
G\G 8 человек 7,80%
G\A 29 человек 28,20%
А\А 66 человек 64,00%
Всего: 103 человек
И в этом случае различия оказались статистически не значимыми:
Х2= 1,234 р=0,5395
Как видно из вышеприведённых таблиц, взятые по отдельности, полиморфизмы гэ1883832 и ге3092952 не могут быть проассоциированы с реакциями гиперчувствительности на бета-лактамные антибиотики.
Затем, используя опыт и алгоритмы корейских исследователей, мы попробовали обнаружить взаимодействие между нашими выбранными полимор-
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
физмами. В идеальном случае как результат такого взаимодействия мы бы хотели наблюдать статистически значимое превышение в опытной группе по сравнению с контрольной числа людей, у которых одновременно есть два рецессивных аллеля Т и О (в независимости от того будет ли человек гомозиготен или гетерозиготен по данному аллелю, то есть мы считаем обладателей Т\Т или Т\С генотипов плюс 0\0 или С\А генотипов).
значимые ассоциации между полиморфизмами гена 1Ь-4га и кожными проявлениями реакций гиперчувствительности у женщин (то есть, скорее всего, они обнаружили действие какого-то регуляторного по отношению к 1Ь-4га гена, который расположен на половой X хромосоме) [5]. Имея данные о поле людей входящих в опытную и контрольные группы мы так же попробовали найти взаимосвязь между полиморфизмами генов СБ40, СБ40Ь и полом пациентов.
"Опытная группа"
Т\Т + Т\С + С\С + С\А 10 человек
С\С + А\А 48 человек
Всего: 58 человек
"Контрольная группа"
Т\Т + Т\С + С\С + С\А 19 человек
С\С + А\А 84 человек
Всего: 103 человек
"Опытная группа" Женщины
т\т + т\с 11 человек 35,50%
с\с 20 человек 64,50%
Всего: 31 человек
"Контрольная группа" Женщины
т\т + т\с 13 человек 46,40%
с\с 15 человек 53,60%
Всего: 28 человек
Реальное распределение генотипов оказалось не таким оптимистичным, как ожидалось, статистически значимых различий мы не обнаружили.
X2 (с поправкой Йетса) = 0,036 р=0,84 Это означает, что мы не можем использовать выбранные полиморфизмы для предсказания развития реакций гиперчувствительности немедленного типа при применении бета-лактамных антибиотиков.
Это означает также, что, скорее всего, российская популяция пациентов отличается от корейской популяции пациентов и, что в дальнейшем нам надо ориентироваться на полиморфизмы, которые так или иначе «проявили» себя в исследованиях на европейских популяциях пациентов. Возможно так-же, что данные полиморфизмы ещё проявят себя при взаимодействии с другими мишенями.
Ген СБ40 (гв 1883832)
"Опытная группа" Женщины
В связи с тем, что число обладателей Т\Т генотипа человек в опытно и контрольной группах меньше 5, для корректного статистического сравнения выборок нам пришлось объединить в одну группу рецессивные гомозиготы и гетерозиготы (то есть людей, являющихся носителем хотя бы одного рецессивного аллеля). В скорректированном виде наши выборки выглядят следующим образом:
X2 (с поправкой Йетса) = 0,347; р = 0,55 итаким образом статистически значимой разницы не наблюдается.
Ген СБ40 (гв 1883832)
"Опытная группа" Мужчины
Т\Т 3 человек 11,10%
т\с 12 человек 44,45%
с\с 12 человек 44,45%
Всего: 27человек
"Контрольная группа" Мужчины
Т\Т 3 человек 9,70%
т\с 8 человек 25,80%
с\с 20 человек 64,50%
Всего: 31 человек
"Контрольная группа" Женщины
туг 3 человек 10,70%
1\С 10 человек 35,70%
с\с 15 человек 53,60%
Всего: 28 человек
Помимо опыта 8ае-Н Ют е1\ а1. мы так же располагаем данными об исследованиях наших французских коллег, которые обнаружили статистически
туг 8 человек 11,00%
т\с 33 человек 45,20%
с\с 32 человек 43,80%
Всего: 73 человек
Аналогичным образом мы проанализировали распределение генотипов у мужчин:
По той же причине, как и в случае с женщинами, нам пришлось объединить носителей рецессивного Т-аллеля в одну общую группу:
X2 (с поправкой Йетса) = 0,003; р = 0,95 и таким образом статистически значимой разницы не наблюдается.
Мы также оценили распределение генотипов с привязкой к полу и для второй «мишени» полимор-
"Опытная группа" Мужчины
т\т + т\с 15 человек 55,55%
с\с 12 человек 44,45%
Всего: 27 человек
"Опытная группа" Мужчины
G\G + G\A 5 человек 18,50%
А\А 22 человек 81,50%
Всего: 27 человек
"Контрольная группа" Мужчины
т\т + т\с 41 человек 56,20%
с\с 32 человек 43,80%
Всего: 73 человек
"Контрольная группа" Мужчины
G\G + G\A 23 человек 31,50%
А\А 50 человек 68,50%
Всего: 73 человек
физму ге3092952 гена СБ40Ь. Распределение генотипов приведено в таблицах с учётом всё той же коррекции, что и в предыдущих случаях.
ХР (с поправкой Йетса) = 0,747; р=0,38 X2 (с поправкой Йетса) = 0,89; р=0,34 Следует обратить внимание, что, хотя и в этом случае различия статистически не значимы, вероятность справедливости нулевой гипотезы существенно уменьшилась после того как мы попытались проассоциировать наши полиморфизмы с полом пациентов. Вполне вероятно, что если нам удастся увеличить выборку (общую численность опытной груп-
"Опытная группа" Женщины
G\G + G\A 11 человек 35,50%
А\А 20 человек 64,50%
Всего: 31 человек
"Контрольная группа" Женщины
G\G + G\A 14 человек 50,00%
А\А 14 человек 50,00%
Всего: 28 человек
ЛИТЕРАТУРА
1. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / под ред. Л.С.Страчунского, Ю.Б.Белоусова, С.Н.Козлова. Смоленск: МАКМАХ, 2007. 464 с.
2.Яриллин А.А. Основы иммунологии. // М.: Медицина. 1999. 1655 с.
3. Патрушев Л.И. «Генная и белковая инженерия» том 1// М: Наука. 2004.214 с.
4. Kim S.H., Lee J.E., Kim S.H., Jee Y.K., Kim Y.K., Park H.S., Min K.U., Park H.W. Adverse Drug Reaction Research Group in Korea. Allelic variants of CD40
and CD40L genes interact to promoteantibiotic-induced cutaneous allergic reactions// Clin Exp Allergy. 2009 Dec;39(12):1852-6..
5. Guglielmi L„ Fontaine C„ Gougat C„ Avinens O., Eliaou J.F., Guglielmi P., Demoly P. IL-10 promoter and IL4-Ralpha gene SNPs are associated with immediate beta-lactam allergy in atopic women. Allergy. 2006 Aug;61(8):921-7.
пы) и выровнять соотношение мужчин и женщин в контрольной группе результаты станут статистически значимыми. Пока же главный вывод исследования состоит в том, что выбранные мишени нельзя использовать для предсказания реакций гиперчувствительности немедленного типа, вызванных применением бета-лактамных антибиотиков.
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
