Изучение воздействия наночастиц TiO2 и Al2O3 на бактерии Pseudomonas fluorescens и Bacillus mucilaginosus Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Вестник Томского государственного университета. Биология

2009 № 4 (8)

УДК 579.26

И.В. Лущаева, С.Н. Моргалев

Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета (г. Томск)

Е-mail: [email protected]

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ TiO2 и AI2O3 НА БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS FLUORESCENS И BACILLUS MUCILAGINOSUS

Аннотация. Изучено воздействие наночастиц TiO2 (размером 5,50 и 350 нм) и Al2O3 (размером 7,70 нм и 4 мкм) на бактерии Pseudomonas fluorescens AP-33 и Bacillus mucilaginosus В-1574. Тестирование показало, что бактериальные тест-культуры наиболее чувствительны к дисперсной системе наночастиц оксида титана (TiO2) размером 5 нм и дисперсной системе частиц оксида алюминия (Al2O3) размерами 70 нм и 4 мкм.

Ключевые слова: наночастицы; биотестирование; тест-культуры; Pseudomonas fluorescens; Bacillus mucilaginosus.

В настоящее время всё возрастающее внимание во всем мире уделяется перспективам развития технологий направленного получения и использования материалов в диапазоне размеров до 100 нм. Уникальные свойства наноматериалов и их биологическая активность могут быть использованы в микроэлектронике, энергетике, строительстве, химической, фармацевтической, парфюмерно-косметической и пищевой промышленности и др. Однако до сих пор не проведена полноценная оценка биологических рисков применения наночастиц. За рубежом проблема безопасности наноматериалов в настоящее время выдвигается на первый план. Такие исследования проводятся в США, Евросоюзе, а также в ряде других международных организаций [1-3]. Необходимо учитывать, что при переводе исходного вещества в наносостояние происходит коренное изменение его свойств. В литературе неоднократно отмечалось, что неблагоприятное воздействие наночастиц нельзя с надежностью предсказать или установить, исходя из известных токсических свойств более крупных частиц того же самого химического вещества [4, 5].

Целью настоящей работы было изучение воздействия наночастиц оксида титана и оксида алюминия на бактерии Pseudomonas fluorescens АР-33 и Bacillus mucilaginosus В-1574.

Материалы и методы исследований

Проведение работ по исследованию воздействия наночастиц в зависимости от их размера и интерпретация результатов соответствуют общепринятым методам изучения биокинетических параметров культур тестовых мик-

роорганизмов. Принцип использованных методов основан на определении удельной скорости роста популяции бактерий при их культивировании на питательной среде без внесения дисперсной системы наночастиц (ДС НЧ) TiO2 и Al2O3 и на питательной среде с их внесением в различной концентрации. Удельная скорость роста бактериальных периодических культур определялась методом нелинейной регрессии [6, 7].

В данной работе использовали культуры бактерий Ps. fluorescens AP-33 и Bac. mucilaginosus В4574. Известно, что в почвах доминирующее положение занимают неспорообразующие флюоресцирующие бактерии рода Pseudomonas и спорообразующие бактерии рода Bacillus [В, 9]. Данные виды микроорганизмов присутствуют в микробоценозах практически всех почв. Изменение их количества или свойств может повлиять на состав почвенного микробоце-ноза и, как следствие, привести к нарушениям химических свойств почв. Кроме того, в результате проведенных нами предварительных исследований данные виды тест-культур почвенных микроорганизмов были отобраны как чувствительные к присутствию в среде ДС НЧ.

Опыты проводили в трех повторностях. Прирост биомассы бактерий оценивали по изменению оптической плотности клеточной суспензии на спектрофотометре КФК-3 при длине волны 59G нм.

При проведении работ по оценке воздействия наночастиц в зависимости от их размера бактерии высевали на питательный бульон (3G г готового сухого питательного бульона на i л дистиллированной воды). Первоначально готовили концентрированные растворы питательной среды. Дисперсные системы наночастиц TiO2 и Al2O3 из расчета концентрации i; G, i; G,Gi; G,GGi и G,GGGi мг/л среды добавляли в стерильную концентрированную питательную среду. После внесения ДС НЧ в колбу с питательной средой содержимое колбы тщательно перемешивали. В приготовленную питательную среду для культивирования бактерий вносили посевной материал (суточную культуру бактерий в количестве 5% от объема питательной среды). Культивирование клеток проводили при температуре +2В °С и необходимом уровне аэрации.

Нанопорошки TiO2 и Al2O3 были получены в ООО «Мипор» (г. Томск). Дисперсные системы наночастиц были приготовлены в центре «Биотест-нано» Томского государственного университета.

Результаты

Изучение воздействия наночастиц TiO2 на бактерии Ps. fluorescens AP-33 и Bac. mucilaginosus В-1574. В результате проведенных исследований было оценено воздействие наночастиц TiO2 размером 5 и 5G нм и микрочастиц TiO2 размером 35G нм различных концентраций на бактерии Ps. fluorescens АР-SS и Bac. mucilaginosus В-1574.

При культивировании бактерий в колбах с добавлением к питательной среде различных концентраций ДС НЧ TiO2 были зафиксированы различия по оптической плотности культуры по сравнению с контролем без внесения ДС НЧ TiO2. Удельные скорости роста ц культур, рассчитанные по изменению оптической плотности культур в экспоненциальной фазе роста, представлены в табл. i.

Т а б л и ц а 1

Удельная скорость роста Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в контроле и при внесении в питательную среду ДС НЧ TiO2

Тест- культура Размерность ДС частиц TiO2, нм Удельная скорость роста культур в контроле, ч-1 Удельная скорость роста культур (ч-1) в средах с добавлением ДС НЧ ТЮ2 различных концентраций, мг/л

1 0,1 0,01 0,001 0,0001

Ps. fluorescens 5 0,1931 ±0,0056 0,1487 ±0,0042 0,1426 ±0,0039 0,1872 ±0,0054 0,1562 ±0,0068 0,1659 ±0,0057

50 0,1704 ± 0,0043 0,1725 ±0,0098 0,1760 ±0,0121 0,1886 ±0,0087 0,1776 ±0,0114 0,1824 ±0,0085

350 0,0982 ± 0,0052 0,0963 ±0,0048 0,0935 ±0,0032 0,0943 ±0,0052 0,0993 ±0,0036 0,0899 ±0,0021

Bac. mucilaginosus 5 0,2598 ±0,0086 0,3079 ±0,0124 0,3025 ±0,0096 0,3030 ±0,0054 0,3095 ±0,0118 0,3055 ±0,0078

50 0,1243 ±0,0054 0,1316 ±0,0036 0,1383 ±0,0028 0,1304 ±0,0075 0,1413 ±0,0053 0,1382 ±0,0042

350 0,0812 ± 0,0075 0,0929 ±0,0036 0,0835 ±0,0028 0,0720 ±0,0045 0,0873 ±0,0036 0,0804 ±0,0057

Как видно из табл. 1, при культивировании бактерий Ps. fluorescens в питательной среде с добавлением ДС НЧ TiO2 размером 5 нм удельная скорость роста культуры во всех вариантах опыта ниже, чем в контроле. Однако можно отметить, что на последующих стадиях развития периодических бактериальных культур (стадия замедления и стационарная фаза) происходит стимуляция роста бактериальных культур во всех опытных вариантах (рис. 1). Таким образом, выбранная для расчетов удельной скорости роста экспоненциальная фаза развития периодических бактериальных культур не отражает влияния наночастиц, и в дальнейшей работе следует проводить расчет удельной скорости с использованием логистической кривой.

При культивировании бактерий Bac. mucilaginosus с внесением ДС НЧ TiO2 размером 5 нм в питательную среду удельная скорость роста культуры, по сравнению с контролем, увеличивается. Однако при выходе в стационарную фазу развития культуры наблюдается некоторое ингибирование роста бактерий, что также свидетельствует о необходимости выбора для расчетов логистической кривой.

Аналогичные результаты были получены для роста бактериальных культур в присутствии ДС НЧ TiO2 размером 50 нм. Добавление дисперсной системы микрочастиц TiO2 размером 350 нм практически не повлияло на рост бактерий Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus.

В целом, присутствие в питательной среде ДС НЧ TiO2 размерами 5 и 50 нм влияет на рост популяции бактерий: стимулирует рост Ps. fluorescens и подавляет рост Bac. mucilaginosus. Для интерпретации полученных данных необходимо проведение дополнительных исследований.

Время, ч

к — ■ 1 мг/л — — Q, 1 мг/л - - - Q,Q1 мг/л ■ ■ Q,QQ1 мг/л Q,QQQ1 мг/л

а

Время, ч

I к — ~1 мг/л-Q,1 мг/л ■ - ■ Q,Q1 мг/л - ■ Q,QQ1 мг/л Q,QQQ1 мр/п]

б

Рис. 1. Динамика роста Pseudomonas fluorescens (а) и Bacillus mucilaginosus (б) в контроле (к) и в присутствии ДС НЧ TiO2 (5 нм)

Изучение воздействия наночастиц Al2O3 на бактерии Ps. fluorescens АР-33 и Bac. mucilaginosus В-1574. В результате проведенных исследований было оценено воздействие наночастиц Al2O3 размером 7 и 7Q нм и микрочастиц Al2O3 размером 4 мкм в концентрациях ДС от 1 до G,GGG1 мг/л на бактерии Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus.

При культивировании Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в колбах с добавлением к питательной среде различных концентраций ДС НЧ Al2O3 были определены удельные скорости роста культуры, рассчитанные по изменению оптической плотности культур в экспоненциальной фазе роста (табл. 2).

Т а б л и ц а 2

Удельная скорость роста Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в контроле и при внесении в питательную среду ДС НЧ Al2O3

Тест- культура Размерность ДС частиц Al2O3 Удельная скорость роста культур в контроле, ч-1 Удельная скорость роста культур (ч-1) в средах с добавлением ДС НЧ А1203 различных концентраций, мг/л

1 0,1 0,01 0,001 0,0001

Ps. fluorescens 7 нм 0,1157 ±0,0086 0,1146 ±0,0028 0,1151 ±0,0048 0,1323 ±0,0013 0,1218 ±0,0011 0,1256 ±0,0012

70 нм 0,0915 ±0,0021 0,0848 ±0,0018 0,0846 ±0,0007 0,0891 ±0,0012 0,1551 ±0,0024 0,1339 ±0,0028

4 мкм 0,1003 ±0,0044 0,0979 ±0,0032 0,0813 ±0,0056 0,0948 ±0,0023 0,1120 ±0,0045 0,1048 ±0,0039

Bac. mucilaginosus 7 нм 0,3418 ±0,0035 0,3528 ±0,0063 0,3422 ±0,0072 0,3296 ±0,0032 0,3194 ±0,0026 0,3211 ±0,0035

70 нм 0,4561 ±0,0089 0,4175 ±0,0116 0,4624 ±0,0091 0,4579 ±0,0058 0,4365 ±0,0080 0,4198 ±0,0088

4 мкм 0,1975 ±0,0042 0,1848 ±0,0056 0,1772 ±0,0047 0,2123 ±0,0023 0,1936 ±0,0042 0,2468 ±0,0087

В результате проведенных исследований установлено, что внесение ДС НЧ Al2O3 размером 7 нм в малых концентрациях (0,01, 0,001 и 0,0001 мг/л) в питательную среду для культивирования бактерий Ps. fluorescens незначительно стимулирует удельную скорость роста бактериальной культуры, о чем свидетельствует увеличение удельных скоростей в данных опытных вариантах.

Как и в отношении оксида титана, для оценки воздействия наночастиц оксида алюминия следует использовать расчет удельных скоростей по логистической кривой, т.к. удельные скорости, полученные при учете роста только на стационарной фазе, противоречат экспериментальным данным, приведенным на рис. 2.

Добавление ДС НЧ Al2O3 размером 7 нм в питательную среду для культивирования бактерий Bac. mucilaginosus стимулирует рост культуры на стадии замедления - стационарной фазе, за исключением варианта с добавлением ДС НЧ Al2O3 в концентрации 0,0001 мг/л, а учитывая только экспоненциальную часть кривой, удельные скорости роста несколько ниже контрольных показателей.

Удельная скорость роста бактерий Ps. fluorescens при культивировании на питательной среде с добавлением ДС НЧ Al2O3 размером 70 нм в концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/л возрастает, по сравнению с контролем, в 1,5 раза.

При культивировании бактерий Bac. mucilaginosus с внесением ДС НЧ Л120з размером 70 нм в питательную среду удельная скорость роста культуры возрастает, по сравнению с контролем, причем в данном опыте наблюдается прямая зависимость от концентрации, вносимой ДС НЧ Л1203. Однако при расчете удельных скоростей данной зависимости отмечено не было, что, вероятно, связано с неправильно выбранной моделью расчета.

Время, ч

к — - 1 мг/л — -Q,1 мг/л - - - Q,Q1 мг/л - - - Q,QQ1 мг/л Q,QQQ1 мг/л

Рис. 3. Динамика роста Bac. mucilaginosus в присутствии ДС H4 A^O3 (7 нм)

G

о

5 1Q 15 2Q 25 3Q 35 4Q 45 5Q 55 6Q 65 7Q 75

Время, ч

-к — - 1 мг/л — -G,1 мг/л - - - G,G1 мг/л ■ ■ G,GG1 мг/л G,GGG1 мг/л|

Q

Рис. 4. Динамика роста Bac. mucilaginosus в присутствии ДС H4 Al2O3 (7Q нм)

Внесение ДС микрочастиц Al2O3 размером 4 мкм в питательную среду для культивирования бактерий Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus стимулировало рост обеих тест-культур (рис. 5, а, б).

Время, ч

к — - 1 мг/л — -0,1 мг/л - - - 0,01 мг/л - - - 0,001 мг/л 0,0001 мг/л

а

_____________________________Время, ч___________________________

| к — - 1 мг/л — -0,1 мг/л ■ ■ ■ 0,01 мг/л ■ ■ - 0,001 мг/л 0,0001 мг/л]

б

Рис. 5. Динамика роста Ps.fluorescens (а) и Bac. mucilaginosus (б) при воздействии ДС частиц A^O3 размером 4 мкм

Таким образом, при культивировании бактерий Ps. fluorescens и Bac. muci-laginosus на питательной среде с добавлением ДС частиц Al2O3 размером 7,

70 нм и 4 мкм наблюдается стимуляция роста культуры бактерий. Для Ps. fluorescens наибольшая удельная скорость роста культуры достигается на малых концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/л ДС частиц Al203 размером 70 нм и 4 мкм. Для Bac. mucilaginosus эффект стимуляции роста отмечен на всех концентрациях всех исследованных размерностей ДС частиц Al203.

Обсуждение

В результате проведенных исследований было выявлено, что бактерии различных систематических групп по-разному реагируют на присутствие в среде ДС НЧ. Происходит как угнетение, так и стимуляция роста тест-культур. При этом четкой зависимости от концентрации наночастиц не выявлено.

Влияние нанопорошков на рост бактерий изучено недостаточно. По данным Вильямса с соавт. [10], которые изучали динамику роста E. coli в присутствии наночастиц оксида кремния, оксида железа и наночастиц золота, не было выявлено значимых различий роста культуры E. coli при добавлении в среды суспензии наночастиц по сравнению с контролем. Авторами было сделано предположение, что изменения происходят на более тонком клеточном уровне - на уровне гена или белков.

В ходе проведенных исследований выявлено, что при воздействии наночастиц на бактериальные тест-культуры существует зависимость от размерности и химической природы вещества. Тестирование показало, что бактериальные тест-культуры наиболее чувствительны к ДС НЧ оксида титана размером 5 нм и ДС оксида алюминия размерами 70 нм и 4 мкм. При оценке воздействия дисперсных систем наночастиц необходимо рассматривать каждую ДС с определенной концентрацией наночастиц как самостоятельный объект оценки. Для интерпретации полученных результатов необходимо изучение механизмов воздействия наночастиц на бактерии. Можно предположить, что бактерии Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в некоторых случаях по-разному реагируют на введение одних и тех же наночастиц из-за принципиально различного строения клеточной мембраны.

Исследование выполнено в рамках государственного контракта Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Томский государственный университет» с Федеральным агентством по науке и инновациям № 01.648.11.3005 от 11 сентября 2008 г. «Разработка методологии биотестирования и создание средств обнаружения наночастиц в окружающей среде для оценки их безопасности, распространения и воздействия».

Литература

1. Chen Z. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo // Toxicology Letters.

2006. Vol. 163, iss. 2. P. 109-120.

2. Lin D. Phytotoxicity of nanoparticles: inhibition of seed germination and root growth // Envi-

ronmental Pollutants. 2007. Vol. 150, iss. 2. P. 243-250.

3. Heinlaan M., Ivask A., Blinov I., Dubourguier H.-Ch., Kahru A. Toxicity of nanosized and

bulk ZnO, CuO and Ti02 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and

Thamnocephalus platyurus // Chemosphere. 2008. Vol. 71, iss. 7. P. 1308-1316.

4. Wang B. Acute toxicity of nano- and micro-scale zinc powder in healthy adult mice // Toxi-

cology Letters. 2006. Vol. 161, iss. 2. P. 115-123.

5. Ostiguy C., Lapointe G., Trottier M. et al. Health effects of nanoparticles // Studies and re-

search projects. IRSST. 2006. 52 p.

6. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС,

1999. 715 с.

7. Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математические модели биологических продукционных

процессов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1993. 300 с.

8. Микроорганизмы как компонент биогеоценоза. Алма-Ата: Наука, 1982. 230 с.

9. Славнина Т.П., Инишева Л.И. Биологическая активность почв Томской области. Томск:

Изд-во ТГУ, 1987. 216 с.

10. Williams D.N., Ehrman S.H., Holoman T.R.P. Evaluation of the microbial growth response to inorganic nanoparticles // Journal of Nanobiotechnology. 2006. Vol. 4, № 3. P. 771-779.

Поступила в редакцию 15.08.2009

Inna V. Luschaeva, Yuri N. Morgalev

Research Institute of Biology and Biophysics of Tomsk State University, Tomsk, Russia

Е-mail: [email protected]

STUDYING OF THE INFLUENCE OF NANOPARTICLES TIO2 AND AL2O3 ON BACTERIA PSEUDOMONAS FLUORESCENS AND BACILLUS MUCILAGINOSUS

Summary. The using of nanomaterials and nanotechnologies is one of the most perspective directions of the XXI century. Taking into account the fact that nanomaterials will be widely used in different spheres (including medicine) in the future, it is very important to reveal their possible risks already today. Methods of biotesting are ones of the methods of studying the influence of different factors and substances on living organisms. It was studied the influence of nanoparticles TiO2 (5, 50 and 350 nm) and Al2P3 (7, 70 nm and 4 microns) on bacteria Pseudomonas fluorescens AP-33 and Bacillus mucilaginosus В-1574. The experiments showed that bacterial test cultures are the most sensitive to disperse system of nanoparticles TiO2 with the size of 5 nm and disperse system of nanoparticles Al2O3 with the size of 70 nm and 4 microns.

Key words: nanoparticles; methods of biotesting; test cultures; Pseudomonas fluorescens; Bacillus mucilaginosus.

Received August 15, 2009