CC BY
65
2015, том 17 [4]
ВЛИЯНИЯ УЛЬТРАЗВУКА НИЗКОЧАСТОТНОГО ДИАПАЗОНА НА СТАБИЛЬНОСТЬ ПЕПТИДНОГО РЕГУЛЯТОРА ИММУНИТЕТА (ГЕСКАПЕПТИДА ИМУНОФАНА) В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
1 2 2 3
И.Н. Кононова , Е.В. Хряпова , И.Ю. Торопыгин , Д.А. Тихонов ,
Т.А. Обоскалова1, К. С. Назаров4, С.Л. Локшин5
1 Кафедра акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО УГМУ ул. Репина, 3, Екатеринбург, Россия; e-mail: [email protected]
2
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича»
3Кафедра фармакология лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова; Кафедра молекулярной фармакологии им. академика П.В. Сергеева РНИМУ им. Н.И. Пирогова
4
Цех синтеза ООО НПП «Бионокс»
Директор ООО «Фотек»
Целью нашего исследования стало изучение стабильности гексапепдида имунофана в водном растворе при разных режимах воздействия ультразвуковыми волнами в низкочастотном диапазоне (25 кГц).
Анализ влияния ультразвука на соединение проводили с помощью метода масс-спектрометрии МЛЬБ1-ТОР. Проведенное экспериментальное исследование стабильности имунофана в водном растворе при различных режимах воздействия ультразвуковых волн на низких частотах (25 кГц) доказало, что гексапептид аргинин-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (Имунофан) не разрушается под воздействием ультразвука. Этот результат продемонстрировал, что активность Имунофана под действием ультразвука обусловлена именно определенной последовательностью аминокислот, а не отдельных компонентов.
Ключевые слова: ультразвук, кавитация, Имунофан, гексапептид, масс-спектрометрия.
Введение. По данным многочисленных исследований персистирующая папилломавирусная инфекция приводит к развитию воспалительного процесса во влагалище и в шейке матки, поскольку экспрессирующийся высокоонкогенными типами ВПЧ-онкобелок Е7, считающийся общепризнанным специфическим опухолевым маркером в тканях шейки матки, вызывает иммуносупрессию на местном уровне при переходе вируса в стадию интег-ративной инфекции [1—4]. При этом нарушения иммунной противовирусной защиты организма сопровождаются усилением повреждающего дейст-
вия свободнорадикальных и перекисных соединений, увеличением активности воспалительной реакции [5]. Изменения местного иммунитета, сопровождающие развитие дисбиотических процессов в шейке матки, способствующие реализации генитальных вирусных инфекций, вызывают трудности лечения хронически протекающих инфекционных процессов в шейке матки, способствующих рецидивированию и прогрессированию цер-викальных неоплазий [6;7].
В этой связи патогенетическая комплексная терапия должна быть основана на применении пре-
—--—
~ 13 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [4]
паратов, направленных на восстановление противовирусного иммунитета, усиление системы антиокислительной защиты с целью инактивации сво-боднорадикальных повреждающих агентов и уменьшение проявлений воспалительной реакции [8; 9].
При выборе иммуномодулирующего препарата для комплексного лечения патологии шейки матки кавитированными растворами наибольшего внимания заслуживают пептидные регуляторы иммунитета, поскольку анализ гексапептида (аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина) в тесте первичной иммуно-фармакологической оценки показал увеличение его активности в 1000 раз по сравнению с ранее полученным комплексом пептидных гормонов тимуса Тактивином. На основе оригинального синтетического гекса-пептида создана лекарственная форма в виде 0,005% раствора Имунофана по 1,0 мл в ампулах для подкожных и внутримышечных инъекций. Результаты клинического изучения Имунофана демонстрируют достижение важнейших эффектов: коррекцию иммунной и окислительно-антиокислительной систем защиты организма, а также торможение репликации вирусов [10; 11].
Большое значение имеет и способ доставки лекарственного средства к патологическому очагу. Ультразвуковая кавитация лечебного раствора не только обеспечивает мелкодисперсное распыление препарата, способствующее проникновению в межклеточные пространства вагинального и цер-викального эпителия, фонофорез препарата на глубину 8 мм, но и обладает прямым бактерицидным действием, разрушая мембрану микробных агентов. Одновременно с этим обеспечивается высокоамплитудный массаж тканей влагалища гидродинамическими потоками, инициируемыми акустическими течениями в промежуточном лекарственном растворе, а также усиление массообмена в прилежащих к влагалищу кровеносной и лимфатической системах органов и систем малого таза. Благодаря комплексному влиянию на организм
ультразвука и вводимого с его помощью лекарственного вещества удается не только достичь лечебного эффекта при значительно меньшей дозировке, но и избежать тех побочных реакций, которые наблюдаются при других видах введения медикаментозных веществ [12].
Кавитированная («озвученная») жидкость характеризуется наличием кавитационных пузырьков и активных химических веществ — перекиси водорода, ионов водорода и кислорода. При ультразвуковом воздействии на ткани кавитированной жидкости имеется сочетанное механическое воздействие струи жидкости и измененных физико-химических свойств кавитированного раствора [13].
Для обоснования применения кавитированных растворов пептидных регуляторов иммунитета при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки необходимо исследование стабильности изучаемого гексапептида при воздействии ультразвуковыми волнами в низкочастотном диапазоне.
Цель исследования: изучение стабильности имунофана в водном растворе при разных режимах воздействия ультразвуковыми волнами в низкочастотном диапазоне (25 кГц).
Материалы и методы. Экспериментальное исследование включало в себя обработку низкочастотным ультразвуком раствора гексапептида Иму-нофана. Для озвучивания гексапептида применялся кавитационный аппарат «ФОТЕК АК 101», разработанный и изготовленный компанией ФОТЕК (г. Екатеринбург) в комплекте с ультразвуковым акустическим узлом АА208.
Воздействие на раствор производилось ультразвуковыми колебаниями различного уровня с частотой 25 кГц. Для озвучивания применялся раствор гексапептида 5 мкг/мл — 1 мл раствора Имуно-фана (1 ампула), разведенный в 50 мл физиологического раствора.
—--—
~ 14 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [4]
После «озвучивания» раствор гексапептида был подвергнут изучению на сохранение целостности структуры пептидного регулятора иммунитета с помощью масс-спектрометрии.
Способ ультразвукового воздействия: кавита-ционное барботирование 10 мл раствора имуно-фана ультразвуковым инструментом в пластиковой пробирке в течение 3 минут и уровне колебаний 80.
Для выявления изменений имунофана под действием ультразвука была выбрана масс-спектро-метрия MALDI-TOF, (matrix-assisted laserdesorp-tion-ionization — timeofflight). Этот метод позволяет определять молекулярные массы пептидов, в том числе фрагментов исходного пептида, если таковые могут образовываться при воздействии ультразвуком на исходный препарат.
Масс-спектры были зарегистрированы на MALDI-TOF масс-спектрометре BrukerUltraflex TOF/TOF (BrukerDaltonics, ФРГ), оснащенном лазером с активной средой из алюмо-иттриевый гранат («YAG», Y3Al5O12) легированный ионами неодима (Nd). Использовалась излучение с длиной волны 355 нм (X = 355 нм). Масс-спектрометр оборудован системой задержки экстракции ионов BrukerPAN и аппаратурой для регистрации тандем-ных масс-спектров LIFT.
В качестве MALDI матрицы, вмещающего вещества, обеспечивающего уменьшение энергии десорбции и обеспечивающего ионизацию использована 3,5-дигидроксибензойная кислота.
Исследуемые образцы непосредственно на стальной масс-спектрометрической подложке (мишени) смешивали с раствором 3.5 дигидроксибензойной кислоты (Bruker, 10 мг/мл в 50% ацетонитриле в воде с 0,5% ТФУ) в равных объемах (по 0,5 мкл). Полученную смесь высушивали на воздухе.
Спектры, зарегистрированные в рамках представленной работы получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона.
Результаты и обсуждение. Для анализа были взяты два образца раствора: первый — исходный раствор имунофана, второй — при воздействии на имунофан барботированием и воздействием ультразвука в течение 120 секунд и уровне колебаний 80.
При кавитировании раствора, проходящего через волновод акустического узла раствор в акустический узел подавался с помощью инфузионной системы. При капельной подаче раствора скорость инфузиибыла равна 15 мл/мин. При капельной подаче раствора в акустический узел и уровне колебаний 80 единиц происходил нагрев подаваемого раствора до температуры 32—38 °С.
При проведении кавитационного барботирова-ния (схема исследования № 2) после УЗ воздействия в течении 60 сек. раствор в пробирке нагревался до 26—28 °С, после УЗ воздействия в течении 120 сек. раствор в пробирке нагревался до 40 °С, волновод (концентратор ультразвуковых колебаний) нагревался до 60 °С.
Результаты масс-спектрометрии представлены на масс-спектре.
Как следует из зарегистрированных масс-спектров, пептид аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин, являющийся действующим веществом препарата Имунофан, присутствует в образце до воздействия ультразвуком, и после воздействия УЗ с максимальной мощностью и максимальной продолжительностью.
—--—
~ 15 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2G1S, том 17 [4]
¿6GG-
500
400'
Э00
Рис. Масс-спектр. Выявление возможных продуктов распада имунофана при максимальном воздействии ультразвука
2GG
1GG
200
800
1800
Таким образом, можно сделать вывод, что гек-сапептидаргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-ти-розил-аргинин (Имунофан) не разрушается при воздействии ультразвука использованной частоты и мощности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кондриков Н. И. Современная терминология гистофизиологических процессов и некоторых доброкачественных изменений шейки матки // Прилепская В.Н. (ред.) Патология шейки матки и генитальные инфекции. М.: МЕДпресс-информ, 2008. C. 36—41.
2. Прилепская В. Н. Патология шейки матки и гени-тальные инфекции. М.: МЕДпресс-информ, 2008.
3. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. Clin.Pathol. 2002; 55:244—265.
4. Роговская С.И. Папилломавирусная инфекция нижних отделов гениталий: клиника, диагностика, лечение: Диссертация. М., 2003. С. 1—235.
5. Долгушина В.Ф., Ахматова А.Н., Телешева Л.Ф., Абрамовских О. С. Персистенция папилломавирусной инфекции у женщин с хроническим цервицитом // Уральский медицинский журнал. 2010. 3-68. С. 91—94.
6. Киселев В.И, Аполихина И.А, Муйжнек Е.Л, Денисова Е.Д. Патогенетические подходы к лечению ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки // Прилепская В.Н. (ред.) Патология шейки матки и генитальные инфекции. М.: МЕДпресс-информ, 2008. С. 87—93.
7. Кунцевич Л.Д., Шибаева Е.В., Комарова В.Д., Копытова Т.В., Пышкина Е.И., Щелчкова Н.А. Значение местного применения индукторов интерферона в комплексном лечении женщин с папилломавирусной инфекцией // Акушерство и гинекология. 2010. 6. С. 49—53.
—--—
~ 16 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [4]
8. Молочков А.В. Комплексный подход к терапии генитальной папилломавирусной инфекции: Материалы Всероссийского научного форума «Мать и дитя». М., 2010.
9. Перламутров Ю.Н., Чернова Н.И. Современные подходы в терапии пациентов с папилломавирусной инфекцией гениталий // Эффективная фармакотерапия в акушерстве и гинекологии. 2010. 1. C. 25.
10. Алонова С. В. Нарушения иммунного и интер-феронового статуса у больных хроническим пиелонефритом и их коррекция иммуномодулятором имунофа-ном: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Уфа, 2004. 22 с.
11. Лебедева М.И. Применение регуляторного олиго-пептида в комплексном лечении воспалительных забо-
леваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2008. № 5. С. 34—37.
12. Vestn Khir lm Grek. Ultrasonic cavitation and ozoni-zation in treatment of patients with pyo-necrotic compica-tions of diabetic foot syndrome. Orthopaedic Research. 2011; 170 (1): 48-53.
13. Обоскалова Т. А., Глухов Е.Ю., Лаврентьева И.В. и др. Лечение заболеваний женских половых органов с использованием лекарственных растворов, кавитиро-ванных низкочастотным ультразвуком. Екатеринбург, 2012.
STUDY OF THE EFFECT OF LOW-FREQUENCY ULTRASOUND ON THE STABILITY OF THE PEPTIDE REGULATOR OF IMMUNITY IN THE EXPERIMENT
I.N. Kononova, E. V. Hrjapova, Toropygin I. Yu., D.A. Tihonov, T.A. Oboskalova, K.S. Nazarov, S.L. Lokshin
The purpose of the our research is the study of stability of hexapeptide Imunofan in water solution by the ultrasonic waves at low frequencies (25 kHz).
Analysis of the effect of ultrasound waves on the chemical compound was carried out using the method mass-spectrometry MALDI-TOF. Carried out the experimental study of the stability of Imunofan in water solution at different modes of action of ultrasonic waves at low frequencies (25 kHz) proved that the hexapeptide arginine-alpha-aspartyl-lysyl-valyl-tyrosyl-arginine (Imunofan) is not destroyed by affecting of ultrasonic. This result demonstrated that the activity of Imunofan under sonication conditioned just defined sequence of amino acids rather than individual amino acids.
Key words: ultrasound, cavitation, Imunofan, hexapeptide, Mass Spectrometry.
REFERENCES
1. Kondrikov N.I. Sovremennaya terminologiya gisto-fiziologicheskikh protsessov i nekotorykh dobrokachest-vennykh izmenenii sheiki matki. Ed. V.N. Prilepskaya. Patologiya sheiki matki i genital'nye infektsii. Moscow, MEDpress-inform, 2008, pp. 36—41.
2. Prilepskaya V.N. Patologiya sheiki matki i genital'nye infektsii. Moscow, MEDpress-inform, 2008.
3. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. Clin.Pathol. 2002; 55:244—265.
4. Rogovskaya S.I. Papillomavirusnaya infektsiya nizh-nikh otdelov genitalii: klinika, diagnostika, lechenie: Diss. Moscow, 2003, pp. 1—235.
5. Dolgushina V.F., Akhmatova A.N., Telesheva L.F., Abramovskikh O.S. Persistentsiya papillomavirusnoi infektsii u zhenshchin s khronicheskim tservitsitom. Ural'skii meditsinskii zhurnal, 2010, 3-68, pp. 91—94.
6. Kiselev V.I, Apolikhina I.A, Muizhnek E.L, De-nisova E.D. Patogeneticheskie podkhody k lecheniyu VPCh-assotsiirovannykh zabolevanii sheiki matki. Ed. Prilep-skaya V.N. Patologiya sheiki matki i genital'nye infektsii. Moscow, MEDpress-inform, 2008, pp. 87—93.
—--—
~ 17 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
7. Kuntsevich L.D., Shibaeva E.V., Komarova V.D., Kopytova T.V., Pyshkina E.I., Shchelchkova N.A. Znache-nie mestnogo primeneniya induktorov interferona v komp-leksnom lechenii zhenshchin s papillomavirusnoi infek-tsiei. Akusherstvo i ginekologiya, 2010, no. 6, pp. 49—53.
8. Molochkov A.V. Kompleksnyi podkhod k terapii ge-nital'noi papillomavirusnoi infektsii: Materialy Vserossii-skogo nauchnogo foruma «Mat' i ditya». Moscow, 2010.
9. Perlamutrov Yu.N., Chernova N.I. Sovremennye podkhody v terapii patsientov s papillomavirusnoi infek-tsiei genitalii. Effektivnaya farmakoterapiya v akusherstve i ginekologii, 2010, no. 1, pp. 25.
10. Alonova S.V. Narusheniya immunnogo i interfero-novogo statusa u bol'nykh khronicheskim pielonefritom
i ikh korrektsiya immunomodulyatorom imunofanom: Avtoref. diss. kand. med. nauk. Ufa, 2004. 22 p.
11. Lebedeva M.I. Primenenie regulyatornogo oligo-peptida v kompleksnom lechenii vospalitel'nykh zabo-levanii sheiki matki, assotsiirovannykh s virusom papillo-my cheloveka. Vestnik Rossiiskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta, 2008, no. 5, pp. 34—37.
12. VestnKhir lm Grek. Ultrasonic cavitation and ozoni-zation in treatment of patients with pyonecrotic compications of diabetic foot syndrome. Orthopaedic Research. 2011; 170 (1): 48-53.
13. Oboskalova T.A., Glukhov E.Yu., Lavrent'eva I.V. i dr. Lechenie zabolevanii zhenskikh polovykh organov s ispol'zovaniem lekarstvennykh rastvorov, kavitirovan-nykh nizkochastotnym ul'trazvukom. Ekaterinburg, 2012.
