CC BY
48
УДК 581.143.6 582.931.4
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И ТИДИАЗУРОНА НА РЕАЛИЗАЦИЮ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ СИРЕНИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
1 2 О.А. Чурикова , А.А. Криницына
Четыре сорта сирени российской и зарубежной селекции («Великая Победа», «П.П. Кончаловский», «Сенсация» и «Виолетта») размножены в стерильных условиях с использованием среды с нормальным и увеличенным в 1,5 раза содержанием макросолей, а также с добавлением в качестве растительных гормонов N6-(A2-изопентил) аденина и тидиазурона в концентрации 1,5 и 0,1 мг/л соответственно. Показано, что восприимчивость к разным типам цитокининов сортоспецифична. Использование тидиазурона при размножении сирени сорта «Сенсация» приводит к снижению коэффициента размножения, у трех других сортов - к его повышению. Сроки нахождения в стерильной культуре и число пассажей практически не влияют на регенерационные способности сирени сорта «Виолетта».
Ключевые слова: Syringa vulgaris L., культура in vitro, морфогенез, тидиазурон, микроклональное размножение.
С конца XVIII в., когда сирень была завезена в Россию, и по сей день невозможно представить старинные усадьбы, дачи, городские парки и бульвары без этого замечательного декоративного кустарника. Сирень отличается обильным цветением, приятным ароматом, довольно неприхотлива к почвенно-климатическим условиям и отзывчива на уход. Неглубокий и короткий период зимнего покоя позволяет использовать сирень как выгоночную культуру.
В настоящее время насчитывают более 2000 сортов сирени (Балмышева, Полякова, 2007), часть из которых (как отечественной, так и зарубежной селекции) входит в золотой фонд мировой коллекции сирени. Некоторые сорта, выведенные отечественными селекционерами, сегодня можно найти только в коллекциях ботанических садов или частных лиц. Сохранить наиболее ценные сорта этой культуры можно, создавая живые коллекции разного уровня и объединяя их в одно информационное пространство (КашешЫ е1 а1., 2016).
В течение ряда лет в лаборатории биологии развития растений кафедры высших растений МГУ проводятся исследования по изучению разнообразия морфогенетических процессов и за-
кономерностей морфогенеза in vitro представителей разных таксономических групп растений (Churikova, 2008; Криницына и др., 2008; Чурикова , Мурашев, 2010). Проведение таких исследований и разработка современных биотехнологических методов размножения растений - необходимые условия и предпосылка для создания живых коллекций и сохранения биологического разнообразия.
В целях получения высококачественного посадочного материала корнесобственной сирени уникальных сортов, наряду с традиционными способами (черенкование и прививки) все шире используют метод микроклонального размножения in vitro. Полученные растения-регенеранты, сохраняющие все сортовые признаки, отличаются быстрым ростом, сокращением сроков перехода к цветению, свободны от фитопатогенов (Чурикова, Мурашев, 2010).
При размножении сирени в стерильных условиях довольно часто используют метод микрочеренкования: размножения с помощью одно-узловых черенков (Einset, Alexander, 1985). Для инициации развития пазушных почек и дальнейшего вытягивания побегов сирени применяют по отдельности и в разных сочетаниях такие
1 Чурикова Ольга Альбертовна - ст. науч. сотр. кафедры высших растений биологического факультета МГУ, канд. биол. наук
([email protected]); 2 Криницына Анастасия Александровна - ст. науч. сотр. кафедры высших растений биологического факультета МГУ, канд. биол. наук ([email protected]).
регуляторы роста, как ауксины, цитокинины и гиберелловая кислота. Например, 6-бензил-аминопурин (БАП) и №-(Д2-изопентил) аде-нин (2-iP) часто используют в сочетании с ин-долил-уксусной кислотой (ИУК) (Pierik et al., 1988; Gabryszewska et al., 1991; Молканова и др., 2002; Molkanova et al., 2011; Tomsone et al., 2007; Nesterowicz et al., 2006; Oprea et al., 2010; Набиева, 2011). Существует еще ряд веществ, обладающих эффектом стимуляции ростовых процессов. К таким веществам относится ти-диазурон (ТДЗ) - синтетический стимулятор роста растений цитокининового действия, ко -торый впервые был зарегистрирован как дефолиант хлопчатника (Arndt et al., 1976).
Воздействие ТДЗ на морфогенез разных видов растений в стерильной культуре зависит не только от концентрации вещества в питательной среде, но и от вида культивируемого растения. Во многих работах было показано, что небольшие концентрации тидиазурона приводят к стимуляции развития пазушных и адвентивных почек у травянистых (Chang, Chang, 2000; Fasai, Anis, 2006; Alvarenga et al., 2015) и древесных (Bates et al., 1992) растений. Увеличение кон -центрации тидиазурона в питательной среде может приводить к противоположным результатам: у некоторых видов древесных (Bukhari et al., 2016) и травянистых (Fatima, Anis, 2011; Basu, Jha, 2014) растений наблюдается увеличение числа образующихся побегов и их длины, у других, наоборот, элонгация побегов подавляется и формируются розеточные формы. Последнее было отмечено у культивируемых in vitro Malus domestica Borkh. (Van Nieuwkerk et al., 1986), гибридных форм рододендронов (Preece, Imel, 1993), сливы и шелковицы (Borkowska, Litwinczuk, 1993). В более высоких концентрациях ТДЗ у некоторых видов индуцирует формирование каллуса (Huetteman, Preece, 1993). При этом диапазон концентраций, которые могут вызвать те или иные ростовые процессы, зависит от вида растения, состояния и типа экспланта (Huetteman, Preece, 1993; Guo et al., 2011). К сожалению, в литературных источниках практически отсутствуют данные о воздействии тидиазурона на разные сорта сирени в стерильной культуре.
Цель нашей работы состояла в оценке влияния тидиазурона при разном солевом составе питательной среды на морфогенез in vitro четырех высокодекоративных сортов сирени из коллекции Ботанического сада МГУ имени М.В. Ломоносова.
Материалы и методы
Сирень сортов «Великая Победа», «П.П. Кон -чаловский», «Сенсация» и «Виолетта» из кол -лекции Ботанического сада МГУ вводили в стерильные условия. В качестве исходного материала использовали вегетативные почки и зеленые черенки со взрослых (около 30 лет) растений. Почки брали через месяц после начала физиологического покоя, зеленые черенки - в период с начала активного роста до стадии бутонизации. Стерилизацию и препарирование растительного материала проводили согласно методике, описанной ранее (Чурикова, Мурашев, 2010). Подготовленные экспланты помещали на питательную среду МС по прописи (Murasige, Skoog, 1962) с добавлением 30 г/л сахарозы и 0,5 мг/л БАП. Каждые 3-4 дня проводили визуальный осмотр на наличие грибной и бактериальной инфекции. Пересадку осуществляли на свежую среду того же состава.
Через 30 дней экспланты, у которых почки тронулись в рост и сформировали микропобеги, пересаживали на среду МС с добавлением 20 г/л сахарозы и 1,5 мг/л 2-iP. Каждые 6 недель микропобеги указанных сортов делили на узлы, которые высаживали на среду того же состава. После того, как из пазушных почек формировались микропобеги, состоящие из двух хорошо выраженных узлов, их отделяли и помещали на свежую среду того же состава.
Перед пассированием на экспериментальные среды сорта «П.П. Кончаловский» и «Великая Победа» прошли в культуре in vitro 22 пассажа, сорт «Сенсация» - 11 пассажей. Растения сорта «Виолетта» были введены в стерильную культуру дважды, в результате чего, в нашем распоряжении одновременно оказались растения, которые прошли 11 и 22 пассажа.
Для оценки влияния ТДЗ на размножение сортов «Великая Победа», «П.П. Кончаловский», «Сенсация» и «Виолетта» использовали среду МС с нормальным и увеличенным в 1,5 раза содержанием макросолей с добавлением 0,1 мг/л ТДЗ. В качестве контроля использовали среды с таким же содержанием солей, но с добавлением 1,5 мг/л 2-iP. Экспланты каждого сорта, представляющие собой второй и третий узел от верхушки побега, высаживали по 5 штук на указанные среды в культуральный сосуд (не менее 30 эксплантов на вариант) с двукратной повторностью. Инкубацию проводили на холодном белом свету при стандартном фотопериоде (16 ч (день) / 8 ч (ночь)) и освещении
3500 люкс. Длительность пассажа составляла 6 недель. Для сорта «Виолетта» дополнительно определяли регенерационную способность эксплантов, полученных с растений, находившихся в стерильных условиях в течение разных промежутков времени и прошедших разное число пассажей.
Для каждого сорта определяли коэффициент размножения (Кр), исходя из числа развившихся пазушных побегов на один эксплант за один пассаж, отмечали формирование раневого каллуса на месте контакта среза с питательной средой и спонтанное укоренение эксплантов. Учитывали также число эксплантов, у которых происходила индукция пазушных почек с последующим развитием одного или обоих пазушных побегов, и тех, у которых начинал развиваться раневой каллус, а индукция развития пазушных почек не происходила. Отдельно отмечали процентное содержание погибших эксплантов. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ 81ай8йса 10. Для попарного сравнения использовали критерий хи-квадрат.
Результаты
При размножении сирени сорта «Виолетта» на среде МС с добавлением 1,5 мг/л 2-1Р у эксплантов, полученных с растений, прошедших 22 пассажа, формирование побега из одной пазушной почки происходило в 2,5 раза чаще, чем у эксплантов с растений, прошедших 11 пассажей - 42,5 и 17% соответственно. Индукция с последующим развитием побегов из обеих пазушных почек наблюдалась у 80% эксплантов с растений, прошедших 11 пассажей, тогда как у прошедших большее число пассажей доля таких эксплантов составляла 57,5%. Но в целом, у этого сорта преобладали экспланты с двумя развивающимися пазушными побегами (рис. 1).
У трех других сортов («Великая Победа», «П.П. Кончаловский» и «Сенсация») на среде того же состава более чем у 60% (62; 62,5 и 66% соответственно) начинала развиваться только 1 пазушная почка, из которой формировался нормально развитый побег с двумя-тремя хорошо развитыми междоузлиями (рис. 2, А). Сортовые различия на этом типе среды проявлялись у тех эксплантов, где начинали развиваться обе пазушные почки. Если у сортов «П.П. Кончаловский» и «Великая Победа» такого типа эксплантов было около 1/3 (33,8 и 34% соответственно), то у сорта «Сенсация» развитие обеих пазушных почек происходило менее, чем у 10% эксплантов (рис. 1).
Воздействие ТДЗ на обе группы эксплантов сорта «Виолетта» оказалось практически одинаковым. При стандартной концентрации макросолей в среде наличие ТДЗ приводило к развитию обеих пазушных почек более чем у половины эксплантов (57,69 и 57,14% у эксплантов с растений, прошедших в культуре in vitro 22 и 11 пассажей соответственно). Однако у единичных эксплантов с растений, дольше находившихся в культуре, наблюдались замершие в развитии пазушные побеги. У сортов «Сенсация» и «П.П. Кончаловский» замена 2-iP на ТДЗ привела к незначительному снижению доли эксплантов, у которых из пазушной почки нормально развивался только один пазушный побег. У сорта «Великая Победа», наоборот, доля эксплантов с одним развившимся пазушным побегом достоверно увеличилась. При этом для всех трех сортов происходило снижение числа эксплантов, у которых формировались нормально развитые побеги из обеих пазушных почек (рис. 2, Б), и увеличивалась доля эксплантов, у которых рост пазушных побегов останавливался на формировании двух-трех узлов, при этом дальнейшего вытягивания междоузлий не происходило (рис. 2, В).
Замена в питательной среде 2-iP на ТДЗ у экс-плантов разных сортов по-разному влияла на формирование раневого каллуса на месте среза. У сорта «П.П. Кончаловский» наличие ТДЗ в питательной среде приводило к увеличению числа эксплантов с хорошо развитым раневым каллусом, а у сортов «Сенсация» и «Великая Победа» -к снижению. Для сорта «Виолетта» каллусообра-зования отмечено не было (таблица). Для сорта «Сенсация» более чем в два раза увеличивалось число эксплантов, у которых наряду с формированием раневого каллуса отсутствовала индукция развития пазушных побегов.
Увеличение концентрации макросолей в 1,5 раза при наличии в питательной среде 2-iP у сорта «Виолетта» приводило к увеличению доли экс-плантов, у которых развитие пазушных побегов происходит из обеих почек. Причем различия оказались значимыми для культуры, прошедшей большее число пассажей. Увеличение доли экс-плантов с двумя равнозначными пазушными побегами привело к увеличению Кр на питательной среде с полуторным содержанием макросолей (1,86) по сравнению с обычным (1,52). При этом у 16% эксплантов, полученных с микрорастений, прошедших меньшее количество пассажей в культуре, развитие пазушных побегов останавливалось на формировании двух-трех узлов без дальнейшего вытягивания междоузлий. По этой
(Л
оо
л
Ч <а Он о
эх о я л ч и н св н к с
в
СО
ь и о о
к
н о.
о
и
ЕИ 1
О 2
ПТ1 3
т 4
ш 5
40 50 60
Доля эксплантов , %
Рис. 1. Особенности развития эксплантов различных сортов сирени в зависимости от состава питательной среды: 1 - развивается один побег, 2 - развиваются два побега, 3 -наблюдается только индукция к развитию пазушных почек без дальнейшего роста побега, 4 - формируется только раневой каллус, пазушные почки не развиваются, 5 - наблюдается гибель экспланта
Рис. 2. Экспланты сорта «Великая Победа» после шести недель культивирования на среде МС+1,5 мг/л 2-1Р: А - сформировавшийся один пазушный побег, вторая почка не развилась; Б - сформированы два равнозначных побега; В - при нормально развитом одном пазушном побеге развитие второго заторможено
причине Кр снизился до 1,4 по сравнению с Кр на среде с обычной концентрацией макросолей (1,76) (таблица).
Эти же условия практически не оказывали влияния на число эксплантов с нормально развившимся одним побегом у сортов «П. П. Конча-ловский» и «Великая Победа». У сорта «Сенсация» доля таких эксплантов незначительно снижалась, но увеличивалось число эксплантов, у которых развивались два побега (с 9,43 до 24%). У сортов «П.П. Кончаловский» и «Великая Победа», наоборот, доля эксплантов с двумя хорошо развивающимися побегами из пазушных почек снижалась. Причем, если у сорта «Великая Победа» уменьшение было незначительным, то у сорта «П.П. Кончаловский» их число снижалось в два раза. Увеличение концентрации макросолей в среде оказывало схожее воздействие на интенсивность формирования раневого каллуса: у сорта «Сенсация» он формировался лишь у 31% эксплантов, тогда как при нормальной концентрации солей - у 90%. У сортов «П.П. Кончаловский» и «Великая Победа» происходило незначительное уменьшение числа эксплантов с раневым каллусом. Кроме того, увеличение концентрации макросолей в питательной среде снижало долю погибших эксплантов сорта «Сенсация» в два раза.
Таким образом, изменение соотношения доли эксплантов с одним и двумя развившимися пазушными побегами привело к изменению величины Кр. У сорта «Сенсация» этот показатель увеличился в 1,3 раза, а у остальных сортов суммарное число нормально сформировавшихся
побегов уменьшилось. Сильнее всего Кр снизился у сорта «П.П. Кончаловский» (в 1,34 раза), у сортов «Виолетта» и «Великая Победа» - в 1,12 и 1,05 раз соответственно (таблица).
Замена 2-1Р на ТДЗ в питательной среде с увеличенной в 1,5 раза концентрацией макросолей привела к снижению числа эксплантов с одной развившейся пазушной почкой у трех сортов -«Сенсация», «П.П. Кончаловский» и «Великая Победа». Причем у последнего сорта это снижение было незначительным, а у сортов «Сенсация» и «П. П. Кончаловский» число таких эксплантов уменьшилось в два раза. Развития обеих пазушных почек у эксплантов сорта «Сенсация» также не происходило, а 25% эксплантов погибали (таблица). Однако для сорта «П.П. Кончаловский» доля эксплантов, у которых формировались два хорошо развитых пазушных побега, значительно увеличивалась (рис. 1). Снижение числа эксплан-тов с раневым каллусом при увеличении концентрации макросолей наблюдали у сортов «Сенсация» и «П.П. Кончаловский», причем у первого сорта их число уменьшилось в два раза. У сорта «Великая Победа», наоборот, у всех эксплантов на этой питательной среде формировался раневой каллус.
Таким образом, увеличение содержания макросолей при наличии в среде ТДЗ приводило к уменьшению Кр у сорта «Сенсация» в два раза (с 0,6 до 0,29), тогда как у сортов «П.П. Кончаловский» и сорта «Великая Победа» результат оказался обратным: Кр увеличился в 1,5 и 1,8 раза соответственно. У сорта «Виолетта» Кр в тех же условиях изменился незначительно (таблица).
Влияние состава питательной среды и экзогенных цитокининов на особенности морфогенеза in vitro четырех
сортов Syringa vulgaris L.
Сорт Морфогенез Состав питательной среды
1,5 МС МС
0,1 мг/л ТДЗ 1,5 мг/л 2-iP 0,1 мг/л ТДЗ 1,5 мг/л 2-iP
«П.П. Кончаловский» кр 1,37 0,99 0,94 1,3
побег из 1 почки 22 44 30 50
побег из 2 почек 41 12 8 27
индукция развития 4 1 11 1
только с каллусом 12 3 11 1
погибло 1 0 2 2
всего с раневым каллусом 60 51 47 65
укоренившихся 0 0 0 0
«Сенсация» кр 0,29 1,07 0,6 0,85
побег из 1 почки 43 51 17 35
побег из 2 почек 1 21 0 5
индукция развития 14 8 3 5
только с каллусом 59 10 6 7
погибло 39 5 5 6
всего с раневым каллусом 61 27 23 48
укоренившихся 2 2 0 2
«Великая Победа» К р 1,33 1,23 0,73 1,3
побег из 1 почки 12 48 30 31
побег из 2 почек 6 25 1 17
индукция развития 0 6 6 2
только с каллусом 0 6 6 2
погибло 0 1 7 0
всего с раневым каллусом 18 69 38 50
укоренившихся 0 4 0 2
«Виолетта» (11 пассажей) К р 1,63 1,4 1,46 1,76
побег из 1 почки 0 4 6 11
побег из 2 почек 13 25 27 20
индукция развития 2 0 0 0
только с каллусом 3 0 1 4
погибло 0 0 0 0
всего с раневым каллусом 16 1 0 20
укоренившихся 0 0 0 0
Окончание таблицы
кр 1,66 1,86 1,52 1,57
побег из 1 почки 20 13 19 37
побег из 2 почек 64 28 30 50
«Виолетта» (22 пассажа) индукция развития 5 15 3 0
только с каллусом 4 20 3 0
погибло 1 1 0 0
всего с раневым каллусом 38 0 0 87
укоренившихся 1 0 0 0
Спонтанное укоренение на всех описанных питательных средах наблюдали у регенерантов всех сортов, за исключением сорта «П.П. Кончаловский» (таблица). Но для сорта «Виолетта» развитие придаточных корней происходило у растений, прошедших больше пассажей. Общее число таких регенерантов было небольшим (0,9%). Сходные результаты были отмечены и для сорта «Великая Победа». У сорта «Сенсация» формирование придаточных корней наблюдалось в основном на среде с добавлением 2-iP, причем при увеличении концентрации макросолей их доля падала с 3,77 до 2,3%.
Для изученных сортов прослеживается четкая взаимосвязь генотипа и регенерационных способностей эксплантов под действием внешних факторов. Так, для сорта « Виолетта» чаще наблюдается развитие обеих пазушных почек экспланта вне зависимости от длительности культивирования сорта в стерильных условиях, типа гормона (2-iP или ТДЗ ) и концентрации макросолей в питательной среде. У сортов «Великая Победа» и «Сенсация» в тех же условиях чаще происходит развитие только одного побега, тогда как второй либо формирует два узла без удлинения междоузлий (рис. 2, В), либо не развивается совсем (рис. 2, А). У сорта «П.П. Кончаловский» резкое увеличение доли эксплантов с двумя хорошо развитыми побегами наблюдается только на среде, где сочетаются увеличенная в 1,5 раза концентрация макросолей и ТДЗ. Увеличение концентрации макросолей в присутствии 2-iP приводит к увеличению числа эксплантов с развившимся раневым каллусом без индукции прямого органогенеза.
Обсуждение
При многочисленном пассировании (длительном культивировании) растений в стерильных условиях под действием экзогенных регулято-
ров роста могут возникать и накапливаться генетические изменения, оказывающие влияние на ростовые процессы. Сомаклональная или эпигенетическая изменчивость может возникать не только при высоком содержании в питательной среде регуляторов роста, но и при использовании оптимальной для вида и/или сорта методики размножения. Длительность культивирования, при которой в ростовых процессах никаких изменений не наблюдается, зависит также от культуры. Так, у многих представителей сем. Rosaceae, таких как Chaenomeles japonica (Thunb.) Spach, Crataegus brachyacantha Sarg. and Engelm., Potentilla fruticosa L. сорта «Coronation», «Triumph» и «Sutter's Gold», Prunus cerasifera Ehrh. сорт «Thundercloud», P. tomentosa Thunb. (Norton, Norton, 1986), Rosa damascene Mill. (Jabbarzadeh, Khosh-Khui, 2005) снижение Кр вне зависимости от используемых регуляторов роста наблюдалось уже после пятого-шестого пассажа. С другой стороны, у Betula pendula Roth. наличие внутрикло-новой изменчивости не отмечали даже после 10 лет культивирования в стерильных условиях как на среде без растительных гормонов (Mashkina et al., 1999), так и при наличии в питательной среде БАП (Ryynanen, Aronen, 2005), а у тополя регенерационная способность микропобегов в культуре in vitro сохранялась в течение 20 лет (Машкина и др., 2016).
По полученным нами данным, сирень сохраняет регенерационную способность на протяжении как минимум 22 пассажей. При этом изменение Кр в большей мере связано с составом питательной среды и сортовой спецификой культуры, чем с длительностью ее культивирования в стерильных условиях. Так, у сорта «Паулинка» и «Нестерка» в присутствии 3 мг/л БАП наблюдали незначительное увеличение Кр с увеличением числа пассажей, тогда как при тех же условиях у
сорта «Лунный свет» он снижался (Spirydovich, 2015). У сорта «Виолетта» с увеличением сроков культивирования Кр может как увеличиваться, так и уменьшаться (таблица) в зависимости от концентрации макросолей и типа цитокинина в питательной среде.
Минеральный состав питательных сред играет немаловажную роль при размножении растений в культуре in vitro. Изменение кон -центрации отдельных солей или их комбинации может приводить к изменениям ростовых процессов. У сирени сорта «Сенсация» при увеличении концентрации макросолей в 1,5 раза (при наличии в среде 2-iP) наблюдается увеличение Кр в 1,3 раза за счет увеличения доли эксплан-тов с двумя хорошо развитыми пазушными побегами. У остальных сортов число развившихся побегов уменьшалось: сильнее всего Кр снизился у сорта «П.П. Кончаловский» (в 1,34 раза), у сортов «Виолетта» и «Великая Победа» - в 1,12 и 1,05 раз соответственно (таблица). Увеличение Кр в ответ на повышение концентраций всех макросолей в питательной среде было отмечено также у сирени сортов «Liega» и «Dobeles sapnotajs» (Tomsone et al., 2007). Возможно, что увеличение или уменьшение Кр у разных сортов может быть связано с индивидуальной реакцией генотипа на изменение концентраций MgSO4, KH2PO4 и CaCl2. Для исходного вида характерно увеличение Кр в ответ на увеличение концентрации MgSO4 и KH2PO4 и его снижение при увеличенной концентрации CaCl2 (Nesterowicz et al., 2006). Вероятно, сорта «П.П. Кончаловский», «Великая Победа» и «Виолетта» более чувствительны к содержанию CaCl2, увеличение концентрации которого в среде приводит к снижению Кр. Сортоспецифичная реакция на кон -центрацию солей кальция наблюдалась также у фундука (Corylus avellana L.) (Hand et al., 2014). Изменение концентрации солей азота (нитрата аммония и нитрата калия) при стандартной кон -центрации сахарозы практически не влияет на развитие аксиллярных почек сирени в стерильной культуре (Gabryszewska, 2011).
Ответ на гормональный состав среды также оказался сортоспецифичным. Развитие побегов из пазушных почек у сирени сорта «Сенсация» на среде с добавлением ТДЗ шло хуже, чем на среде, содержащей 2-iP. Увеличение содержания макросолей при наличии в среде ТДЗ приводило к падению Кр в два раза (с 0,6 до 0,29), тогда как у остальных сортов результат оказался обратным: Кр для сорта «П.П. Кончаловский» и сорта «Великая Победа» увеличился в 1,5 и 1,8 раза соответ-
ственно. У сорта «Виолетта» Кр в тех же условиях изменился незначительно (таблица). Негативную реакцию на наличие в питательной среде ТДЗ (0,2 мг/л) ранее наблюдали также у сирени сорта «Красавица Москвы»: у 100% эксплантов формировался только каллус, а развития пазушных почек не происходило (Набиева, 2011). Надо отметить, что для сирени всех изученных нами сортов при наличии в среде 0,1 мг/л ТДЗ у некоторой доли эксплантов все-таки наблюдалась индукция развития пазушных почек, однако рост побега останавливался на стадии двух пар листьев, а междоузлия не вытягивались. Формирование подобных укороченных побегов при воздействии ТДЗ отмечали у многих древесных растений. Например, у сливы и шелковицы при наличии в среде 0,2 мг/л ТДЗ наблюдали формирование укороченных побегов с нормально развитыми листьями (Borkowska, Litwinczuk, 1993). Формирование каллуса при наличии в питательной среде небольшой концентрации ТДЗ также было отмечено у многих древесных растений (Huetteman, Preece, 1993).
Спонтанное укоренение регенерантов на питательных средах без добавления ауксинов наблюдалось и у других растений - представителей различных семейств (Favre, Juncker, 1987; Sharma, Thorpe, 1990; Jimnez, 2006). Так, у Quercus robur L. происходило спонтанное укоренение первичных эксплантов, взятых со взрослых растений, на среде M С с активированным углем (Favre, Juncker, 1987). Однако при этом не было выявлено четкой зависимости между укоренением и числом образующихся de novo побегов. Сформировавшиеся in vitro побеги Morus alba L. укоренялись на среде для пролиферации побегов при культивировании более четырех недель (Sharma, Thorpe, 1990). Добавление активированного угля к этой среде ускоряло развитие адвентивных корней и ингиби-ровало развитие каллуса на базальном части побега. У Guadua angustifolia Kunht (Сем. Poaceae) спонтанное укоренение наблюдалось спустя два месяца после индукции культуры (Jimnez, 2006) у 100% эксплантов, которые образовывали боковые побеги. Вид Dendrocalamus giganteus Munro из этого же семейства для индукции корнеобра-зования требует ИМК или НУК (Ramanayake, Yakandawala, 1997).
Таким образом, анализ морфогенетических процессов в ходе микроклонального размножения четырех сортов Syringa vulgaris показал четкую зависимость восприимчивости этой культуры к минеральному составу питательной среды и гормональным регуляторам роста
цитокининового ряда от генотипа растения. повышенной в 1,5 раза концентрацией макросо-Использование ТДЗ способствовало повыше- лей приводило к увеличению доли эксплантов с нию Кр всех проанализированных сортов, за двумя хорошо развитыми побегами. Для сорта исключением сорта «Сенсация», у которого от- «Сенсация» развитие обеих пазушных почек у мечалось снижение этого показателя. Для сорта большей части эксплантов на питательной сре-«П.П. Кончаловский» сочетание тидиазурона с де того же состава подавлялось.
Работа выполнена в рамках НИР «Изучение закономерностей морфогенеза и формирования элементов продуктивности под влиянием факторов внешней среды; разработка принципов мор-фофизиологической классификации растений» (АААА-А16-116021660105-3), а также при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-50-00029 (направление «Растения»)).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ [REFERENCES]
Балмышева Н., Полякова Т. Время сирени. М., 2007. 232 с. [Balmysheva N., Polyakova T. Vremya sireni. M.,
2007. 232 s.].
Криницына А .А., Мурашев В.В., Раппопорт А.В., Сперанская А.С., Успенская М.С., Чурикова О.А. Микроклональное размножение декоративных культур: Пион древовидный (Paeonia suffruticosa). M., 2008. 40 с. [KrinitsynaA.A., Murashev V.V., Rappo-portA.V., Speranskaya A.S., Uspenskaya M.S., Churiko-va O.A. Mikroklonal'noe razmnozhenie dekorativnykh kul'tur: Pion drevovidnyi (Paeonia suffruticosa). M.,
2008. 40 s.].
Машкина О. С., Табацкая Т.М., Морковина С. С., Панявина Е.А. Выращивание посадочного материала тополя белого (Populus alba L.) на основе коллекции in vitro и оценка его себестоимости // Лесотехнический журнал. 2016. Т. 6. № 1. С. 28-44 [Mashkina O.S., Tabatskaya T.M., Morkovina S.S., Panyavina E.A. Vyrashchivanie posadochnogo materiala topolya belogo (Populus alba L.) na osnove kollektsii in vitro i otsenka ego sebestoimosti // Lesotekhnicheskii zhurnal. 2016. T. 6. № 1. S. 28-44]. Молканова О.И., Чурикова О.А., Коновалова Л.Н., Окунева И.Б. Клональное микроразмножение интродуцированных сортов Syringa vulgaris L. // Вестн. Моск. ун-та. (Сер. биол.). 2002. Т. 4. C. 8-14 [Molkanova O.I., Churikova O.A., Konovalova L.N., Oku-nevaI.B. Klonal'noe mikrorazmnozhenie introdutsirovan-nykh sortov Syringa vulgaris L. // Vestn. Mosk. un-ta. (Ser. Biol.). 2002. T. 4. C. 8-14. Набиева А.Ю. Биотехнологические приемы клонального микроразмножения перспективных сортов Syringa vul-garis L. для Западной Сибири // Вестн. ИрГСХА. 2011. Т. 5. № 44. С. 69-76 [NabievaA.Yu. Biotekhnologicheskie priemy klonal'nogo mikrorazmnozheniya perspektivnykh sortov Syringa vulgaris L. dlya Zapadnoi Sibiri // Vestn. IrGSKhA. 2011. T. 5. № 44. S. 69-76]. Спиридович Е. В. Ботанические коллекции: документирование и биотехнологические аспекты использования. Минск., 2015. 226 с. [Spiridovich E.V. Botanicheskie kollektsii: dokumentirovanie i biotekhno-logicheskie aspekty ispol'zovaniya. Minsk, 2015. 226 s.]. Чурикова О .А., Мурашев В. В. Микроклональное размножение декоративных культур: Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris L.). М., 2010. 32 с. [Churikova O.A., Murashev V.V. Mikroklonal'noe razmnozhenie dekorativnykh kul'tur: Siren' obyknovennaya (Syringa vulgaris L.). M., 2010. 32 s.].
Arndt F.R., Rusch R., Stillfried H.V., Hanisch B., Martin W.C. A new cotton defoliant // Plant Physiol. 1976. Vol. 57. P. 99.
Basu S., Jha T.B. Direct organogenesis, phytochemical screening and assessment of genetic stability in clonally raised Chlorophytum borivilianum // Environmental and Experimental Biology. 2014. Vol. 12. P. 167-178.
Bates S., Preece J.E., Navarrete N.E., Vansambeek J.W., Gaffney G.R. Thidiazuron stimulates shoot organogenesis and somatic embryogenesis in white ash (Fraxinus аmericana L.) // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1992. Vol. 31. N 1. P. 21-29.
Borkowska B., Litwinczuk W. Activity of thidiazuron in in vitro shoot cultures of Prunus sp. and Morus alba // Biologia plantarum. 1993. Vol. 35. N 1. P. 63-67.
Bukhari N.A.W., Siddique I., Perveen K. Preculturing effect of thidiazuron on in vitro shoot multiplication and micropropagation round in Capparis decidua (Forsk.) an important multipurpose plant // Acta Biologica Hungarica. 2016. Vol. 67. N 3. P. 297-304.
Churikova O.A. Microclonal propagation and some regularities of morphogenesis of daylily and hosta in vitro // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2008. Vol. 63, N 2. P. 89-94.
EinsetJ.W.,AlexanderJ.H. Multiplication of Syringa species and cultivars in tissue culture // Comb. Proc. Intern. Plant Propagators Soc. 1985. Vol. 34. P. 628-636.
FaisalM., AnisM. Thidiazuron induced high frequency axillary shoot multiplication in Psoralea corylifolia // Biologia Plantarum. 2006. Vol. 50. N 3. P. 437-440.
Favre J.M., Juncker B. In vitro growth of buds taken from seedlings and adult plant material in Quercus robur L. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987. Vol. 8. P. 49-60.
Gabryszewska E. Effect of various levels of sucrose, nitrogen salts and temperature on the growth and development of Syringa vulgaris L. shoots in vitro // Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 2011. Vol. 19. N 2. P. 113-148.
Guo B., Abbasi B.H., Zeb A., Xu L.L., Wei Y.H. Thidiazuron: A multi-dimensional plant growth regulator // African Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 10. N 45. P. 8984-9000.
Hand C., Maki S., Reed B.M. Modeling optimal mineral nutrition for hazelnut micropropagation // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2014. Vol. 119. P. 411-425.
Huetteman C.A., Preece J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. Vol. 33. P. 105-119.
Jabbarzadeh Z., Khosh-Khui M. Factors affecting tissue culture of Damask rose (Rosa damascena Mill.) // Scientia Horticulturae. 2005. Vol. 105. P. 475-482.
Jimenez V., Castillo J., Tavare E., Guevara E., Montie M. In vitro propagation of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot proliferation // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2006. Vol. 86. P. 389-395.
Kamenski P.A., Sazonov A.E., Fedyanin A.A., Sadovnichy V.A. Biological collections: Chasing the ideal // Acta Naturae. 2016. Vol. 8. P. 6-9.
Mashkina O.S., Tabatskaya T.M., Starodubtseva L.M. Mass clonal propagation of karelian birch and poplar through long-term shoot multiplication // Russian Journal of Plant Physiology. 1999. Vol. 46, N 6. P. 835-837.
Molkanova O.I., Spirydovich E.V, Konovalova L.N., Brel N.G., Zinina U.M., Reshetnikov V.N. Complex observation of introduction species and varieties of Syringa L. in Main Botanical Garden of the RAS and in the Central Botanical Garden of the NAS of Belarus // Bulletin of Udmurt University. Biology and Earth Sciences. 2011. Vol. 2. P. 66-73.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.
Nesterowicz S., Kulpa D., Moder K., Kurek J. Micropropagation of an old specimen of common lilac (Syringa vulgaris L.) from the dendrological garden at Przelewice // Horto-rum Cultus. 2006. Vol. 5. N 1. P. 27-35.
Norton M.E., Norton C.R. Change in shoot proliferation with repeated in vitro subculture of shoots of woody species of Rosaceae // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1986. Vol. 5. P. 187-197.
Pierik R.L.M., Steegmans H.H.M., Elias A.A., Stieke-ma O.T.J., van der Velde A.J. Vegetative propagation of Syringa vulgaris L. in vitro // Acta Horticulturae. 1988. Vol. 226. P. 195-204.
Ramanayake S.M.S.D., Yakandawala K. Micropropagation of the giant bamboo (Dendrocalamus giganteus Munro) from nodal explants of field grown culms // Plant Sci. 1997. Vol. 129. P. 213-223.
Sharma K.K., Thorpe T.A. In vitro propagation of mulberry (Morus alba L.) through nodal segments // Scientia Horticulturae. 1990. Vol. 42. N 4. P. 307-320.
Tomsone S., Galeniece A., Akere A., Friede G., Zïra L. In vitro propagation of Syringa vulgaris L. cultivars // Bi-ologija. 2007. Vol. 53. Vol. 2. P. 28-31.
Van Nieuwkerk J.F., Zimmerman R.H., Fordham I. Thidi-azuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro // Hort. Sci. 1986. Vol. 21. P. 516-518.
Поступила в редакцию / Received 18.04.2019 Принята к публикации / Accepted 19.06.2019
THE INFLUENCE OF NUTRITIVE MEDIUM COMPOSITION AND THIDIAZURON ON REALIZATION OF MORPHOGENETIC POTENTIAL IN VITRO OF DIFFERENT LILAC CULTIVARS
1 2 O.A. Churikova , A.A. Krinitsina
Four cultivars of Syringa vulgaris L. of Russian and foreign selection: "Velikaya Pobeda", "P.P. Konchalovsky", "Sensation", "Violetta" were propagated in sterile conditions on Murashige and Skoog nutritive medium with normal and with increased in one and a half macrosalts content and with the addition of hormonal growth regulators N6-(A2-Isopentenyl) adenine and thidiazuron (1,5 and 0,1 mg/l correspondingly). It was shown that susceptibility to different types of cytokinins is variety-specific. Application of thidiazuron during "Sensation" propagation leads to decreasing of coefficient of propagation, and for three other cultivars - to it's increasing. Time of maintaining in sterile culture and the number of passages practically don't have influence over regenerative abilities of lilac cv. "Violetta".
Key words: Syringa vulgaris L., thidiazuron, N6-( A2-Isopentenyl) adenine, micropropagation.
Acknowledgement. The study was supported by scientific program "The study of regularities of morphogenesis and formation of productivity elements under the influence of environment factors; elaboration of principles of morphophysiological classification of plants" (AAAA-A16-116021660105-3) and was carried out with financial support of RSF (project № 14-50-00029 ("Plants")).
1 Churikova Olga Albertovna - PhD, senior research assistant of the Department Higher Plants, Biological Faculty, Moscow State University([email protected]); 2 Krinitsina Anastasiya Alexandrovna - PhD, senior research assistant of the Department Higher Plants, Biological Faculty, Moscow State University ([email protected]).
