CC BY
68
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион
УДК 577
Я. П. Ястремская, О. Д. Любченко
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОДКОЖНОЙ ИМПЛАНТАЦИИ ИННОВАЦИОННЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ИЗМЕНЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА В ГОЛОВНОМ МОЗГУ ЖИВОТНЫХ
Аннотация.
Актуальность и цели. Исследовались инновационные углеродные нанокомпозиты для медицины, проходящие предварительные доклинические испытания, с целью дополнительного подтверждения биосовместимости и отсутствия отсроченных токсических эффектов.
Материалы и методы. Проведена подкожная имплантация инновационных углеродных нанокомпозитов: углеродсодержащего материала с двойными карбидами, углеродного нанокомпозита повышенной прочности с применением фуллеренов и нанотрубок. Исследованы показатели антиоксидантной системы спустя 2 недели, 4 недели, 3 месяца и 6 месяцев после имплантации.
Результаты. Показано, что отсроченных токсических эффектов после имплантации инновационных углеродных нанокомпозитов не выявлено.
Выводы. Полученные нами результаты в целом хорошо коррелируют с результатами исследований клинических показателей в сыворотке животных после имплантации.
Ключевые слова: углеродные нанокомпозиты, имплантация, антиоксидантная система, головной мозг, биосовместимость.
Y. P. Yastremskaya, O. D. Lyubchenko
THE STUDY OF THE EFFECT OF SUBCUTANEOUS IMPLANTATION OF INNOVATIVE CARBON NANOCOMPOSITES ON ANTIOXIDANT STATUS CHANGE IN THE RATS' BRAIN
Abstract.
Background. The authors investigated innovative carbon nanocomposites for medicine, undergoing preliminary pre-clinical testing, in order to additionaly confirm biocompatibility and absence of delayed toxic effects.
Materials and methods. The researchers subcutaneously implanted innovative carbon nanocomposites: a carbonaceous material with double carbide, a carbon nanocomposite of enhanced strength using fullerenes and nanotubes. The authors researched indices of the antioxidant system after 2 weeks, 4 weeks, 3 months and 6 months since implantation.
Results. It is shown that there has been revealed no delayed toxic effects after implantation of innovative carbon nanocomposites.
Conclusions. The results obtained are in general well-correlated with the results of researching clinical indices in animal serum after implantation.
Key words: carbon nanocomposites, implantation, antioxidant system, brain, biocompatibility.
В настоящее время актуальным является вопрос разработки новых материалов для восстановительной и пластической хирургии в связи с ограни-
42
University proceedings. Volga region
№ 1 (9), 2015
Естественные науки. Биология
ченностью применения аллогенных материалов и ксенобиотиков. Существует ряд возможных негативных реакций со стороны организма на имплантат, одним из которых является окислительный стресс.
На данный момент достаточно известно о природе и механизмах развития стресса. В ответ на стрессорное воздействие в организме человека или животного развивается стресс-реакция, или срочная адаптация. Это дает возможность организму мобилизоваться и выжить в новых экстремальных условиях, но, по сути, этот процесс чрезвычайно неэкономичен и несовершенен, так как сопровождается серьезными нарушениями гемостаза [1]. Стресс неотделим от самого явления жизни, поэтому в процессе эволюции сформировались мощные механизмы защиты от его возможных повреждающих последствий. Одним из таких способов защиты является работа антиоксидантных систем организма, основу которых составляют ферментативные и неферментативные компоненты [2]. В то же время состояние антиоксидантной системы можно рассматривать как своеобразный маркер адекватности процессов, протекающих в организме: насколько комфортны условия существования, нет ли очагов воспаления. Это позволяет включить изменения антиоксидантного статуса в список параметров, используемых при оценке биосовместимости материалов после имплантации.
Биосовместимость того или иного материала или имплантируемого элемента определяется не только его химической и надмолекулярной структурой, но и формой, топографией поверхности, спецификой взаимодействия с окружающими тканями. Это означает, что требования, предъявляемые к биоматериалам, разнообразны и многогранны, поэтому в каждом отдельном случае необходимо рассматривать конкретное содержание, вкладываемое в понятие биосовместимости применительно к целевому назначению каждого отдельного материала.
В наибольшей степени указанным требованиям отвечают материалы на основе углерода, так как реализуются биосовместимые, тромборезистентные, поверхностные, гальвано-электрические и другие характеристики. Исходя из этих положений были разработаны инновационные углеродные нанокомпозиты для медицины. Однако ответом на вопрос о возможности применения каждого конкретного материала должно стать обязательное тестирование готового образца на предмет соответствия требованиям, предъявляемым к материалам для эндопротезирования.
По результам, полученным при проведении испытаний согласно ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий» [3, 4], отсроченного токсического действия данных инновационных углеродных нанокомпозитов на животных не выявлено, однако в связи с повышающимися требованиями к качеству материалов для медицины требуются дополнительные исследования влияния образцов на другие системы, поэтому целью данной работы являлось изучение отсроченного влияния имплантации материалов на показатели антиоксидантного статуса в головном мозгу животных.
1. Материалы исследования
Материалы, представленные для оценки токсичности и биологической безопасности, были разработаны и произведены ООО «МедИнж-Пироугле-род» в рамках государственного контракта 12411.1008799.13.053 от 14 мая
Natural Sciences. Biology
43
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион
2012 г. с Министерством промышленности и торговли Российской Федерации. Для проведения исследования на кафедру «Биохимия» Пензенского государственного университета в соответствии с договором 03/13 НИР поступили следующие образцы: углеродсодержащий материал с двойными карбидами (УНДК), углеродный нанокомпозит повышенной прочности с применением фуллеренов и нанотрубок (УНПП).
Исследуемые материалы разработаны для изготовления следующих имплантатов и эндопротезов: тотальный коленный сустав, однополюсный коленный сустав, ревизионный коленный сустав, тотальный тазобедренный сустав, тотальный тазобедренный сустав с опорной пластиной, биполярный тазобедренный сустав, ревизионный тазобедренный сустав, плечевой сустав, локтевой сустав, лучезапястный сустав, суставы пальцев рук, суставы пальцев ног, голеностопный сустав, челюстно-лицевой сустав, имплантат межпозвонковый подвижный, имплантат межпозвонковый неподвижный.
Все этапы работы проходили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий». Стандарты серии ИСО 10993 - руководящие документы для прогнозирования и исследования биологического действия медицинских изделий на стадии выбора материалов, предназначенных для их изготовления, а также для исследований готовых изделий. Системная токсичность является потенциальным неблагоприятным эффектом использования медицинских изделий. Эффекты обобщенного характера, а также конкретных органов и систем могут появляться в результате абсорбции, распределения и метаболизма веществ, вымываемых из изделия или его материалов, в участках организма, с которыми они не находятся в прямом (непосредственном) контакте. Настоящий стандарт рассматривает оценку обобщенной системной токсичности, но не токсичности конкретного органа-мишени или системы органов, несмотря на то, что таковая может развиться в результате систематической абсорбции и распределения токсических веществ.
Эксперимент проводился на здоровых половозрелых беспородных самцах крыс, разделенных на четыре группы, которые в дальнейшем делились на 16 подгрупп: опытные (8), контрольные (4) и интактные (4). В работе были использованы 96 10-недельных животных массой 200-250 г. Образцы были имплантированы в подкожно-жировую клетчатку крыс. Для исследования острого, подострого, субхронического и хронического воздействия нами были определены этапы изучения отсроченного действия образцов: 2 недели, 4 недели, 3 месяца и 6 месяцев после имплантации соответственно.
Лабораторные животные для испытания образцов были приобретены в филиале «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН. На протяжении всего эксперимента они содержались в стандартных условиях вивария (ГОСТ Р 50258-92).
2. Методы исследования
Имплантация проводилась по методу Fishbein M. et al. [5]. Перед операцией животные в течение 10 дней содержались в виварии для акклиматизации. Исходя из массы тела животных и их размера на момент операции, были выбраны количество и размер имплантатов: брусочки размером 5 * 2 * 2 мм, по 4 шт. в одно животное, конечная общая масса материала - УНДК (0,167 г),
44
University proceedings. Volga region
№ 1 (9), 2015
Естественные науки. Биология
УНПП (0,153 г). Перед операцией образцы были стерилизованы окисью этилена.
Ежедневное наблюдение за общим состоянием животных (ГОСТ Р ИСО 10993) после операции, а также за состоянием послеоперационного шва не показало реакций воспаления, гнойных осложнений или других ответов организма на имплантированные материалы. Животные были активны, жажда и аппетит сохранялись. Неврологических расстройств не наблюдалось.
В установленные сроки после имплантации образцов - 2 недели, 4 недели, 3 месяца и 6 месяцев - опытных, контрольных и интактных животных декапитировали под эфирным наркозом, извлекали головной мозг, помещали в охлажденный (0-4 °С) раствор 0,25 М сахарозы, очищали от оболочек, замораживали и хранили при -40 °С для последующего анализа [6].
2.1. Определение общей перекись разрушающей активности в головном мозгу животных
Для определения общей перекись разрушающей активности был выбран модифицированный колориметрический метод М. А. Королюка [2]. Метод основан на способности перекиси образовывать с молибдатом аммония окрашенный комплекс. Ферментативную активность выражали в миллимолях субстрата (перекись водорода), расщепленного за 1 мин инкубации, на 1 мг белка.
Концентрацию белка в пробах определяли по модифицированному методу Лоури [7].
При оценке полученных экспериментальных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез. Результаты выражали как среднее арифметическое Х, статистическую девиацию SD или ошибку среднего значения т.
Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (%-критерий). При соответствии нормальному распределению признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием 1-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при уровне достоверности р < 0,05 [8].
3. Результаты и обсуждение
3.1. Лабораторные показатели отсроченного действия спустя 2 недели после имплантации
Результаты исследования показали выраженное повышение активности перекись разрушающих ферментов в головном мозгу животных через 2 недели после имплантации УНПП, что указывает на активный ответ антиоксидантных систем организма на имплантацию материалов и развитие окислительного стресса. Данные результаты характерны для воспалительных реакций и процессов регенерации в первые недели после операции (рис. 1).
При этом следует отметить, что у контрольной группы не наблюдается повышения активности исследуемых ферментов антиоксидантной системы по сравнению с интактной группой, что указывает на отсутствие развития стресс-реакции у ложнооперированных животных через 2 недели после операции.
Natural Sciences. Biology
45
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион
2 недели после имплантации
ИНТ КОН УНДК УНПП
Рис. 1. Уровень перекись разрушающей активности в головном мозгу животных после декапитации по истечении 2-недельного срока
Примечание. Здесь и на рис. 2-4: по оси ОУ - значения активности ферментов, по оси ОХ - подгруппы исследуемых животных: ИНТ - интактная, КОН - контрольная (ложнооперированная), УНДК - подгруппа с углеродсодержащим материалом с двойными карбидами, УНПП - подгруппа с углеродным нанокомпозитом повышенной прочности с применением фуллеренов и нанотрубок; * - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой.
3.2. Лабораторные показатели отсроченного действия спустя 4 недели после имплантации
Результаты исследования через 4 недели после имплантации материалов показали повышение активности перекись разрушающих ферментов в головном мозгу животных только у группы УНПП, а также у контрольной группы по сравнению с интактной. Ответная реакция антиоксидантных систем у животных, для которых в качестве материалов был использован УНДК, не выражена, и ее можно сравнивать с показателями интактной группы, что может говорить о положительной динамике (рис. 2).
4 недели после имплантации
ИНТ КОН УНДК УНПП
Рис. 2. Уровень перекись разрушающей активности в головном мозгу животных после декапитации по истечении 4-недельного срока
46
University proceedings. Volga region
№ 1 (9), 2015
Естественные науки. Биология
3.3. Лабораторные показатели отсроченного действия спустя 3 месяца после имплантации
Результаты исследования спустя 3 месяца после имплантации материалов показали значительное повышение активности перекись разрушающих ферментов в группах УНПП и УНДК. Более поздний ответ антиоксидантной системы головного мозга на УНДК можно объяснить хорошей защищенностью головного мозга гематоэнцефалическим барьером, благодаря чему ответ нервной системы предсказуемо может быть позднее, чем ответ других систем организма (рис. 3).
3 месяца после имплантации
ИНТ КОН УНДК УНПП
Рис. 3. Уровень перекись разрушающей активности в головном мозгу животных после декапитации по истечении 3-месячного срока
3.4. Лабораторные показатели отсроченного действия спустя 6 месяцев после имплантации
Результаты исследования через 6 месяцев после имплантации показали выраженное повышение активности перекись разрушающих ферментов в головном мозгу животных с УНПП, что может свидетельствовать о длительном развитии окислительного стресса, связанного с выбранным местом имплантации, поскольку данный материал достаточно прочный и не предназначен для подкожной имплантации (рис. 4).
6 месяцев после имплантации
ИНТ КОН УНДК УНПП
Рис. 4. Уровень перекись разрушающей активности в головном мозгу животных после декапитации по истечении 6-месячного срока
Natural Sciences. Biology
47
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион
Полученные нами результаты в целом хорошо коррелируют с результатами исследований клинических показателей в сыворотке животных после имплантации [9, 10]. Это свидетельствует об умеренном протекании реакций воспаления и регенерации практически всех материалов, за исключением УНПП и ткани, в ответ на имплантацию которых окислительный стресс продолжается на протяжении 6 месяцев после операции. Однако это связано, по-видимому, с местом имплантации и размером имплантата, которые могут вызывать локальное раздражение и умеренный стресс. В целом мы наблюдаем картину, типичную для постоперационной регенерации тканей: умеренно протекающее воспаление сменяется процессами заживления.
Можно заключить, что материалы, представленные для испытаний, не оказывают токсического влияния на организм и не вызывают реакций воспаления, отторжения. Они удовлетворяют требованиям к материалам для имплантатов и эндопротезов в части биологической безопасности.
Кроме того, оценка активности перекись разрушающих ферментов в головном мозгу животных после имплантации материалов может служить методом, который не только характеризует процессы биосовместимости, но и позволяет оценить методическую сторону эксперимента, такую как размер и место размещения имплантата.
Список литературы
1. Соловьев, В. Б. Роль пептидергической системы в адаптационных процессах и регуляции метаболизма при физической работе : автореф. дис. ... д-ра биолог. наук / Соловьев В. Б. ; Российский университет дружбы народов (РУДН). - М., 2011. - 46 с.
2. Величко, А. К. Методы лабораторного определения общей перекись разрушающей активности ферментов растений / А. К. Величко, В. Б. Соловьев,
M. Т. Генгин // Известия Пензенского государственного педагогического университета им. В. Г. Белинского. Естественные науки. - 2009. - № 14 (18). - С. 44-48.
3. Любченко, О. Д. Испытание образцов изделий из углеродосодержащего нанокомпозита с двойными карбидами для медицины на биологическую безопасность и токсичность / О. Д. Любченко, В. Б. Соловьев, В. Ф. Татаринов // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2014. - № 6. - С. 82-86.
4. Любченко, О. Д. Испытание опытных образцов из углеродных нанокомпозитов на биологическую безопасность и токсичность / О. Д. Любченко, В. Б. Соловьев, В. Ф. Татаринов, Я. П. Ястремская // Биология - наука XXI века : 18-я Меж-дунар. Пущинская школа-конференция молодых ученых : сб. тез. конф. - Пущино, 2014. - С. 30-31.
5. Fishbein, M. Calcification of cardiacvalve bioprostheses: Histologic, ultrastructural, and biochemical studies in a subcutaneous implantation model system / M. Fishbein, R. J. Levy [and etc.] // The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. - 1982. - 320 p.
6. Генгин, М. Т. Влияние атропина на активность карбоксипептидазы H и фе-нилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга и надпочечниках крыс / М. Т. Генгин, В. Б. Соловьев // Нейрохимия. - 2007. -Т. 24, № 2. - С. 138-142.
7. Lowry, O. H. Protein measurement with Folin phenol reagent / O. H. Lowry,
N. J. Rosebrought, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, № 1. -P. 265-275.
8. .Лакни, Г. Ф. Биометрия : учеб. пособие для вузов / Г. Ф. Лакин. - М. : Высш. шк., 1990. - 280 с.
9. Соловьев, В. Б. Морфологические изменения в зоне имплантации углеродсодержащих материалов / В. Б. Соловьев, М. Г. Федорова, О. Д. Любченко,
48
University proceedings. Volga region
№ 1 (9), 2015
Естественные науки. Биология
В. Ф. Татаринов, А. С. Купрюшин // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2014. - № 1 (29). - С. 27-36.
10. Соловьев, В. Б. Морфологические изменения в зоне имплантации углеродсодержащих материалов в отдаленные сроки после операции / В. Б. Соловьев, М. Г. Федорова, О. Д. Любченко, В. Ф. Татаринов // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2014. - № 3 (31). - С. 39-48.
References
1. Solov'ev V. B. Rol’ peptidergicheskoy sistemy v adaptatsionnykh protsessakh i regu-lyatsii metabolizma pri fizicheskoy rabote: avtoref. dis. d-ra biolog. nauk [Role of peptidergic system in adaptation and regulation of metabolism at physical work: author’s abstract of dissertation to apply for the degree of the doctor of biological sciences]. Peoples’ Fiendship University of Russia. Moscow, 2011, 46 p.
2. Velichko A. K., Solov'ev V. B., Gengin M. T. Izvestiya Penzenskogo gosudarstvennogo pedagogicheskogo universiteta im. V. G. Belinskogo. Estestvennye nauki [Proceedings of Penza State Pedagogical University named after V. G. Belinsky. Natural sciences]. 2009, no. 14 (18), pp. 44-48.
3. Lyubchenko O. D., Solov'ev V. B., Tatarinov V. F.Aktual’nyeproblemygumanitarnykh i estestvennykh nauk [Topical problems of humanities and natural sciences]. 2014, no. 6,
pp. 82-86.
4. Lyubchenko O. D., Solov'ev V. B., Tatarinov V. F., Yastremskaya Ya. P. Biologiya -nauka XXI veka: 18-ya Mezhdunar. Pushchinskaya shkola-konferentsiya molodykh uchenykh: sb. tez. konf [Biology - science of XXI century: 18th International Pushkin’s school-conference of young scientists: conference theses collection]. Pushchino, 2014, pp. 30-31.
5. Fishbein M., Levy R. J. and etc. The Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 1982, 320 p.
6. Gengin M. T., Solov'ev V. B. Neyrokhimiya [Neurochemistry]. 2007, vol. 24, no. 2, pp. 138-142.
7. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. L., Randall R. J. J. Biol. Chem. 1951, vol. 193, no. 1, pp. 265-275.
8. Lakin G. F. Biometriya: ucheb. posobie dlya vuzov [Biometrics: tutorial for universities]. Moscow: Vyssh. shk., 1990, 280 p.
9. Solov'ev V. B., Fedorova M. G., Lyubchenko O. D., Tatarinov V. F., Kupryushin A. S.
Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Meditsinskie nauki [University proceedings. Volga region. Medical sciences]. 2014, no. 1 (29), pp. 27-36.
10. Solov'ev V. B., Fedorova M. G., Lyubchenko O. D., Tatarinov V. F. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Meditsinskie nauki [University proceedings. Volga region. Medical sciences]. 2014, no. 3 (31), pp. 39-48.
Ястремская Яна Павловна
магистрант, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: yana1991bio@mail.ru
Любченко Олеся Дмитриевна аспирант, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: filology@inbox.ru
Yastremskaya Yana Pavlovna
Undergraduate student, Penza State University
(40 Krasnaya street, Penza, Russia)
Lyubchenko Olesya Dmitrievna
Postgraduate student, Penza State University
(40 Krasnaya street, Penza, Russia)
Natural Sciences. Biology
49
Известия высших учебных заведений. Поволжский регион
УДК 577
Ястремская, Я. П.
Изучение влияния подкожной имплантации инновационных углеродных нанокомпозитов на изменение антиоксидантного статуса в головном мозгу животных / Я. П. Ястремская, О. Д. Любченко // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. -2015. - № 1 (9). - С. 42-50.
50
University proceedings. Volga region
