Научная статья на тему 'Влияние подкожной имплантации говяжьего ксеноперикарда на активность ферроксидазы и перекись разрушающих ферментов сыворотки крови крыс'

Влияние подкожной имплантации говяжьего ксеноперикарда на активность ферроксидазы и перекись разрушающих ферментов сыворотки крови крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
327
60
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГОВЯЖИЙ ПЕРИКАРД / ГЛУТАРОВЫЙ АЛЬДЕГИД / ПОДКОЖНАЯ ИМПЛАНТАЦИЯ / ФЕРРОКСИДАЗА / ПЕРЕКИСЬ РАЗРУШАЮЩИЕ ФЕРМЕНТЫ / BOVINE PERICARDIUM / GLUTARALDEHYDE / SUBCUTANEOUS IMPLANTATION / FERROXIDASE / PEROXIDE DESTROYING ENZYMES

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Кручинина А. Д., Гамзин С. С., Генгин М. Т.

Говяжья перикардиальная ткань была децеллюляризована и фиксирована глутаровым альдегидом. Образцы подкожно имплантировались 10недельным крысам на 14, 30, 90 суток. Типичная воспалительная реакция наблюдалась для всех имплантатов. Активность ферроксидазы и перекись разрушающих ферментов после подкожной имплантации материала определялась в разные периоды после имплантации.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Кручинина А. Д., Гамзин С. С., Генгин М. Т.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Bovine pericardial tissue was decellularized and fixed with glutaraldehyde. Samples were subcutaneously implanted in 10-week-old rats for 14, 30, 90 days before explantation. Typical inflammatory reactions were observed in all implants. Ferroxidase and peroxide destroying enzymes activities after subcutaneous implantation of biomaterials were measured at various time intervals after implantation.

Текст научной работы на тему «Влияние подкожной имплантации говяжьего ксеноперикарда на активность ферроксидазы и перекись разрушающих ферментов сыворотки крови крыс»

ИЗВЕСТИЯ

ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 29 2012

IZVESTIA

PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 29 2012

УДК 577.15

ВЛИЯНИЕ ПОДКОЖНОЙ ИМПЛАНТАЦИИ ГОВЯЖЬЕГО КСЕНОПЕРИКАРДА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРРОКСИДАЗЫ И ПЕРЕКИСЬ РАЗРУШАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ

СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС

© А. Д. КРУЧИНИНА, С. С. ГАМЗИН, М. Т. ГЕНГИН Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского,

кафедра биохимии e-mail: A.D.Kruchinina@mail.ru

Кручинина А. Д., Гамзин С. С., Генгин М. Т. - Влияние подкожной имплантации говяжьего ксеноперикарда на активность ферроксидазы и перекись разрушающих ферментов сыворотки крови крыс // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2012. № 29. С. 29-32. - Говяжья перикардиальная ткань была децеллюляризована и фиксирована глутаровым альдегидом. Образцы подкожно имплантировались 10-недельным крысам на 14,30, 90 суток. Типичная воспалительная реакция наблюдалась для всех имплантатов. Активность ферроксидазы и перекись разрушающих ферментов после подкожной имплантации материала определялась в разные периоды после импланта-

Ключевые слова: говяжий перикард, глутаровый альдегид, подкожная имплантация, ферроксидаза, перекись разрушающие ферменты.

Kruchinina A. D., Gamzin S. S., Gengin M. T. - Effect of bovine pericardium subcutaneously implantation on ferroxidase and peroxide destroying enzymes activites of serum // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im. V. G. Belinskogo. 2012. № 29. P. 29-32. - Bovine pericardial tissue was decellularized and fixed with glutaraldehyde. Samples were subcutaneously implanted in 10-week-old rats for 14,30, 90 days before explantation. Typical inflammatory reactions were observed in all implants. Ferroxidase and peroxide destroying enzymes activities after subcutaneous implantation of biomaterials were measured at various time intervals after implantation.

Keywords: bovine pericardium, glutaraldehyde, subcutaneous implantation, ferroxidase, peroxide destroying enzymes.

ВВЕДЕНИЕ

Хирургическое лечение ряда заболеваний связано с необходимостью использования материалов для заместительной пластики органов или тканей. Примером такого материала может служить модифицированный говяжий ксеноперикард [1, 7, 12, 14, 15, 19, 20].

Имплантация биоматериалов, сопровождающаяся хирургическим вмешательством, вызывает ответную реакцию организма на повреждение и инородное тело [21, 27, 28]. Такую реакцию называют воспалением [23, 25].

Воспаление (лат. шАаттайо) - это комплексный, местный и общий патологический процесс, возникающий в ответ на повреждение клеточных структур организма или действие патогенного раздражителя (альтерация) и проявляющийся в реакциях, направленных на устранение продуктов повреждения, а если возможно, то и агентов (экссудация), а также приводящий к максимальному для данных условий восстановлению в зоне повреждения (пролиферация) [5,6]. Воспаление, возникающее в ответ на им-

плантацию биоматериала, называют асептическим в отличие от септического, при котором в очаг воспаления попадают микробы и считают вполне допустимым [17, 18].

Однако даже асептическое воспаление может вызывать изменения в функционировании защитных систем организма, в том числе и интенсификацию процессов свободно-радикального окисления [28].

В основе биологической целесообразности усиления свободно-радикальных процессов биомолекул и развития оксидативного стресса лежит увеличение в возникающих экстремальных условиях синтеза эй-козаноидов, обновления мембран, детоксикационных процессов [4].

Усиление генерации свободных радикалов вызывает компенсаторную активацию антиоксидантной системы [9, 11]. Поскольку ферроксидаза и перекись разрушающие ферменты (ПРФ) вносят значительный вклад в функционирование антиоксидантной системы, изучение их активности позволит оценить степень выраженности оксидативного стресса [2, 16].

Целью исследования является изучение состояния антиоксидантной системы после подкожной имплантации говяжьего ксеноперикарда.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовался модифицированный говяжий ксеноперикард. Модификация заключалась в обработке гипертоническими растворами солей, ферментативной децеллюляризации и фиксации ткани раствором глутарового альдегида [13, 22].

Образцы ксеноперикарда были имплантированы в подкожно-жировую клетчатку крыс. В работе использовалось 24 десятинедельных животных линии Wistar массой 200-250 г. Имплантация проводилась по методу Fishbein M. etal., 1982. Перед операцией животные в течение 7 дней содержались в виварии для акклиматизации. Содержание животных и условия проведения экспериментов invivo соответствовали ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009 «Требования к обращению с животными». Перед процедурой имплантации удаляли шерсть с операционного поля. Операцию проводили в стерильных условиях, под действием эфирного наркоза. Перед имплантацией образца ксеноперикарда, участок кожи в месте разреза обеззараживали 0,05 % раствором хлоргексидина, излишки антисептика удаляли стерильными салфетками. Для имплантации делали 3 разреза длиной 1 см каждый на спине животного. Подкожные карманы формировали с помощью заостренного шпателя, отделяя подкожные ткани от мышечного слоя. Образцы помещали в образовавшуюся полость с помощью стерильного пинцета. Разрез закрывали рассасывающейся нитью кетгута, накладывая простые узелковые хирургические швы. Рану обрабатывали антисептиком и закрывали клеем медицинским БФ-6. После пробуждения животные были активны и не проявляли признаков дискомфорта.

Через 2, 4, 12 недель после операции животных декапитировали под эфирным наркозом. Кровь собирали, центрифугировали при 30С, 3000 об/мин. В полученной сыворотке определяли активность феррок-сидазы и перекись разрушающих ферментов.

Активность ферроксидазы определяли модифицированным методом Ревина [8]. Принцип метода основан на окислении р-фенилендиамина при участии ферроксидазы. Ферментативную реакцию останавливали добавлением фторида натрия. По оптической плотности образовавшихся продуктов судили об активности ферроксидазы.

Ход определения: В пробирки вносили по 2 мл 0,4 М ацетатного буфера (рН=5,5) и 0,025 мл сыворотки крови. В контрольные пробирки добавляли по 0,25 мл 3% фторида натрия, затем во все пробирки вносили 0,25 мл р-фенилендиамина, используемого в качестве субстрата. Пробирки встряхивали и инкубировали в течение часа при температуре 37°С. После инкубации в опытные пробирки для остановки реакции добавляли по 0,25 мл 3% фторида натрия. Содержимое пробирок перемешивали, выдерживали 30 мин. при +40С. Пробы колориметрировали (^=530 нм) в кюветах с длиной оптического пути 10 мм.

Активность ферроксидазы выражали в мкмоль превращенного субстрата, отнесенную к единице времени и концентрации белка.

Активность перекись разрушающих ферментов определяли по способности не разрушенной в ходе инкубации перекиси водорода образовывать с солями молибдата аммония стойко окрашенное комплексное соединение, фотометрически детектируемое на длине волны 410 нм [3].

Ход определения: в опытную пробу к 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода добавляли 0,05 мл сыворотки крови. После 10 мин. инкубации добавляли 0,5 мл 4% молибдата аммония. В контрольную пробу к 0,05 мл сыворотки крови приливали 0,5 мл 4% молиб-дата аммония, 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо сыворотки крови добавляли

0,05 мл дистиллированной воды. Измеряли интенсивность окраски проб против фоновой пробы: 1,05 мл воды, 0,5 мл 4% молибдата аммония.

Пробы колориметрировали (^=410 нм) в кюветах с длиной оптического пути 10 мм.

Активность ПРФ выражалив мкмоль разрушенной перекиси, отнесенной к единице времени и концентрации белка.

Количественное содержание белка в сыворотке крови определяли методом Lowry [26].

Результаты обрабатывали статистически, с привлечением 3S критерия и t критерия Стьюдента [10]. Анализ отсроченного влияния говяжьего ксенопери-карда на активность ферментов антиоксидантной системы проводили с использованием дисперсионного анализа. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью метода Шеффе. Сравнение значений каждой из подгрупп дисперсионного комплекса проводили по методике Ньюмена-Кейлса [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате исследования установлено, что активность ферроксидазы остается повышенной (достоверно, p<0,01) на второй неделе после имплантации по сравнению с контрольной группой (рис. 1).

По истечении четырех недель активность фер-роксидазы снижается до уровня контрольной группы и в дальнейшем не изменяется (рис. 1).

Наблюдаемая динамика активности фермента может быть обусловлена интенсификацией процессов свободно-радикального окисления, индуцированного оперативным вмешательством, что согласуется с литературными данными [24].

Динамика активности перекись разрушающих ферментов несколько иная (рис. 2).

Суммарная активность ПРФ сыворотки крови по прошествии двух недель после имплантации не обнаруживает достоверных отличий по отношению к контрольной группе. Возможно, активность перекись разрушающих ферментов на данном этапе достаточна для обезвреживания образующихся количеств перекиси водорода.

БИОХИМИЯ ►»»

Рис. 1. Активность ферроксидазы в сыворотке крови крыс на разных этапах после имплантации ксеноперикарда

(мкмоль превращенного субстрата за 1 мин инкубации на 1 мг белка; здесь и на рис.2: М±а, п=6; ** - р<0,01по отношению к контрольной группе).

Рис. 2. Суммарная активность перекись разрушающих ферментов в сыворотке крови крыс на разных этапах после имплантации ксеноперикарда (мкмоль разрушенной H2O2 за 1 мин инкубации на 1 мг белка).

К четвертой неделе (достоверно, р<0,01) после проведения имплантации активность ПPФ достигает своего максимального значения (рис. 2).

Данный факт можно объяснить накоплением перекисей в результате повышенной активности фер-роксидазы к окончанию второй недели имплантации (рис. 1).

По истечении двенадцати недель активность перекись разрушающих ферментов возвращается к уровню значений контрольной группы. По-видимому, это связано со снижением активности генерации перекиси и ликвидацией её накопленных количеств. Подобная динамика описана в литературе [29].

Анализируя полученные данные об активности ферментов, можно говорить о том, что имплантированный ксеноперикард не индуцирует интенсификации процессов свободно-радикального окисления, а изменения в состоянии антиоксидантной системы, вероятно, обусловлены оперативным вмешательством.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баулин А. В., Середин С. А., Квасов А. Е., Митрошин А. Н., Баулин В. А., Венедиктов А. А., Лембас А. Н., Никишин Д. В. Ксеноперикардиальная герниопла-стика: возможности и перспективы // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2011. Т. 1. № 5. С. 11-15.

2. Белова С. В., Карякина Е. В. Церулоплазмин - структура, физико-химические и функциональные свойства // Успехи современной биологии. 2010. Т. 130. №2. С.180-189.

3. Величко А. К., Соловьев В. Б., Генгин М. Т. - Методы лабораторного определения общей перекись разрушающей активности ферментов растений // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2009. № 14 (18). С. 44-48.

4. Казимирко В. К., Мальцев В. И. Антиоксидантная система и ее функционирование в организме человека // Здоровая Украина. 2004. №98.С.11-18.

5. Калмин О. В., Никольский В. И., Федорова М. Г., Янгуразова Е. В., Никольский А. В. Морфологические изменения ксеноперикарда в условиях гнойновоспалительного процесса // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2011. № 4. С. 12-20.

6. Каминский Ю. В. Учебно-методическое пособие по патологической анатомии и биопсийно-секционному курсу. Медицина ДВ, 2005. С. 58-60.

7. Карцева Е. В. Применение ксеноперикарда в комплексном лечении новорожденных с гастрошизисом. Автореф. дис. ... канд. мед.наук. М., 2001. 23 с.

8. Колб В. Г., Камышников В. С. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь, 1982. 366 с.

9. Кулакова К. В., Давыденко Д. В., Щербатюк Т. Г., Чернов В. В., Макушева М. А. Исследование свободнорадикальных процессов в организме крыс на фоне изменения состояния внешней среды // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 4. С. 100-108.

10. Лакин Г. Ф. Биометрия: Учеб. Пособие для биол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

11. Меньшикова Е. Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 553 с.

12. Митрошин А. Н., Сиваконь С. В., Мозеров С. А., Абдуллаев А. К., Митрошин А. И. Исследование биоинтеграции ксеноперикарда при пластике дефектов сухожильно-связочных структур// Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2010. № 3. С. 35-43.

13. Пат. 2197818 Pоссийская Федерация, A01N1/00. Способ подготовки биоткани для ксенопротезирования / Бурцев П. Ю., Бурцева Е. В.; заявитель и патентообладатель: Закрытое акционерное общество «Медикон ЛТД». № 2001115659/14; заявл. 09.06.01; опубл. 10.02.03.

14. Подолужный В. И., Гордеев М. С., Павленко В. В., Кармадонов А. В.Использование модифицированного ксеноперикарда при хирургическом лечении// Политравма. 2011. № 4. С. 51-54.

15. Подолужный В. И., Гордеев М. С., Зайков И. Н., Кармадонов А. В. Клинико-экспериментальная оценка результатов использования модифицированного ксе-ноперикарда в герниологии// Медицина в Кузбассе.

2010. №3. С. 26-29.

зі

16. Рязанцева Л. Т. Ферменты антиоксиданты: структурно-функциональные свойства и роль в регулировании метаболических процессов// Вестник Воронежского государственного технического университета. 2011. Т. 7. № 2. С. 126-129.

17. Севастьянов В. И., Кирпичникова М. Т. Биосовмести-мые материалы. М.: «МИА», 2011. 544 с.

18. Серов В. В., Шехтер А. Б. Соединительная ткань. Функциональная морфология и общая патология. М.: Медицина, 1981. 312 с.

19. Тагабилев Д. Г. Изучение возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве основы тканевых эквивалентов слизистых оболочек. Автореф. дис. ... канд. мед.наук. М.,

2011. 25 с.

20. Фокин А. А., Куватов А. В., Роднянский Д. В., Дегтярев М. С.Сравнительные непосредственные результаты использования расширяющей заплаты из различных материалов при каротидной эндартерэктомии// Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2011. Т. 4. № 1. С. 140-142.

21. Higgins D. M., Basaraba R. J., Hohnbaum A. C., Lee E. J., Grainger D. W., Gonzalez-Juarrero M. Localized immunosuppressive environment in the foreign body response to implanted biomaterials// Am J Pathol. 2009. Vol. 175. № 1. Р. 161-70.

22. Jang W., Choi S., Kim S. H., Yoon E., Lim H. G., Kim Y. J. A comparative study on mechanical and biochemical properties of bovine pericardium after single or double crosslinking treatment// Korean Circ J. 2012.Vol. 42. № 3. Р. 154-63.

23. Junge K., Binnebösel M., von Trotha K. T., Rosch R., Klinge U., Neumann U. P., Lynen Jansen P. Mesh biocompatibility: effects of cellular inflammation and tissue remodeling// Langenbecks Arch Surg. 2012. Vol. 397. № 2. P. 255-70.

24. Karlidag R., Unal S., Sezer O. H., Bay Karabulut A., Battaloglu B., But A., Ozcan C. The role of oxidative stress in postoperative delirium// Gen Hosp Psychiatry. 2006. Vol. 28. № 5. P. 418-23.

25. Koch H., Graneist C., Emmrich F., Till H., Metzger R., Aupperle H., Schierle K., Sack U., Boldt A. Xenogenic esophagus scaffolds fixed with several agents: comparative in vivo study of rejection and inflammation// Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012. Vol. 20. №12. P. 1-11.

26. Lowry O. , Rosebrough N. , Farr A. , Randall R. Protein measurment with the folin phenol reagent. // J.Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-270.

27. Luttikhuizen D. T., Harmsen M. C., Van Luyn M. J. Cellular and molecular dynamics in the foreign body reaction// Tissue Eng. 2006. Vol. 12.№7. P.1955-70.

28. Luttikhuizen D. T., van Amerongen M. J., de Feijter P. C., Petersen A. H., Harmsen M. C., van Luyn M. J. The correlation between difference in foreign body reaction between implant locations and cytokine and MMP expression// Biomaterials. 2006. Vol. 27. №34. P. 576370.

29. Ten Raa S., van den Tol M. P., Sluiter W., Hofland L. J., van Eijck C. H., Jeekel H. The role of neutrophils and oxygen free radicals in post-operative adhesions// J Surg Res. 2006. Vol. 136. № 1. P. 45 52.

з2

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.