CC BY
41
Иванов Павел Александрович, старший преподаватель кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-53-21
Кальной Валентин Степанович, кандидат медицинских наук, руководитель Наркологического учебно-научно-лечебного центра ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, г. Астрахань, Началовское шоссе, 9, тел. (8512) 38-50-72.
УДК 616-006.6-031.81
© А.И. Глухов, С .А. Апрятин, С.Е. Северин, 2011
А.И. Глухов1, С.А. Апрятин2, С.Е. Северин1
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, ИНГИБИРУЮЩИХ ТЕЛОМЕРАЗУ, НА РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЫШИНОЙ
МЕЛАНОМЫ IN VIVO
:ГОУ ВПО «Первый Московский медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России 2ГУЗ Московский НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения Москвы
Экспериментальные результаты показали тормозящее действие TelP5 (в дополнение к РНК матрица компонент сайта) и олигонуклеотидов TMO24C фосфоротиоат на рост опухолей в естественных условиях, путем трехкратной подкожной инъекции, по сравнению с контрольной группой. Количество метастазов в легких во всех группах лечения с тремя последовательностями олигонуклеотидов была также значительно ниже. Выживаемость мышей была значительно выше в TelP5, TMO24G и ТМ024С групп после однократного введения олигонуклеотидов по сравнению с контрольной группой.
Ключевые слова: теломераза, онкогенез, олигонуклеотиды.
A.I. Gluhov, S.A. Apryatin, S.E. Severin
THE INFLUENCE OF INHIBITING TELOMERASE MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES ON THE GROWTH OF TUMOR CELLS IN MOUSE MELANOMA IN VIVO
Experimental results showed the inhibitory effect of TelP5 (complementary to RNA matrix site component) and TM024C phosphorothioate oligonucleotides on tumor growth in vivo by subcutaneous three times injection in comparison with the control group. Number of lung metastases in all treatment groups with three consecutive oligonucleotides was also significantly lower. Survival of mice was significantly higher in the TelP5, TM024G and TM024G groups after single injection of oligonucleotides in comparison with the control group.
Key words: telomerase, tumorigenesis, oligonucleotides.
В современной медицине большое внимание уделяется созданию высокоэффективных и специфически действующих препаратов для лечения злокачественных новообразований. По мнению многих исследователей, приобретение свойства иммортальности клетками опухолей связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер. Основываясь на данных, полученных при изучении свойств теломеразы, в настоящее время ведется активный поиск ее ингибиторов. Особую группу соединений, исследуемых в настоящее время в качестве потенциальных ингибиторов теломеразы, представляют антисмысловые олигонуклеоти-ды. В отличие от обычной стратегии, где антисмысловые олигонуклеотиды подавляют экспрессию определенного гена, ингибирование теломеразы основано на непосредственном блокировании функции фермента олиго-нуклеотидами, комплементарными его РНК-компоненту [1]. К этой же группе соединений можно отнести и олигонуклеотиды, состоящие из теломерных повторов (ТМО - telomere mimic oligonucleotide), поскольку повторы, синтезируемые теломеразой на собственной РНК-матрице, по сути, являются комплементарными ей олигонуклеотидными последовательностями, а также ДНК- и РНК- фосфоротиоатные и фосфорамидатные оли-гонуклеотиды. Известно, что G-богатый олигонуклеотид ТМО2^ способен формировать квадруплексную структуру, наличие которой облегчает его взаимодействие с белками теломеразного комплекса.
Ранее в экспериментах in vitro нами было показано, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды TelP5 и ТМО2^ю снижают выживаемость опухолевой линии человека Mel-10 (меланома), способствуя их накоплению в S-фазе клеточного цикла и стимулируя апоптоз [2, 3, 4]. Таким образом, данные олигонкулеотиды оказывали ингибирующее действие на теломеразу и рост опухолевых клеток линии Mel-10.
В качестве продолжения этих исследований нами изучено действие на ингибирование теломеразной активности четырех последовательностей модифицированных олигонуклеотидов: TelP5, комплементарная область, которая служит матрицей для синтеза теломерных повторов; TM024G, состоящий из четырех гексамер-ных звеньев 5'-TTAGGG-3'; TM0i2G, состоящий из двух гексамерных звеньев 5'-AATCCC-3'; TM024C, состоящий из четырех гексамерных звеньев 5'-AATCCC-3'. В работе была использована клеточная линия B-16 (мела-
нома мыши). Все модифицированные олигонуклеотиды были представлены в виде фосфоротиоатных последовательностей и синтезированы компанией «ДНК-Синтез» (Москва). Исследования проводились на самках лабораторных мышей линии C57Black/6 массой 20-22 г (n=62). Всем животным (включая контрольные группы) подкожно вводилось 0,1 млн клеток линии B-16. Лабораторные животные были разделены на 10 групп (по 6-7 мышей в группе): четырем группам изучаемые олигонуклеотиды вводились подкожно трехкратно в дозе 18 мкг/мышь на 4-й, 5-й и 6-й день после подкожного клеток линии B-16. Другим четырем группам олигонуклео-тиды вводились подкожно однократно в дозе 55 мкг/мышь. Две контрольные группы получали трех- и однократные подкожные инъекции PBS в объеме 150 мкл/мышь, соответственно.
В исследовании in vivo при трехкратном подкожном введении олигонуклеотидов на 21-й день после инъекции клеточной линии B-16, медианы объема опухоли были ниже в группах TelP5 и TMO24C, чем в контрольной группе - 1,81; 2,73 и 3,91, соответственно (рис.). В случае однократного введения этих олигонуклеотидов этот эффект не наблюдался. Важно отметить, что количество метастазов в легких во всех исследуемых группах с трехкратным введением олигонуклеотидов было ниже, чем в контрольной группе. Тем не менее, выживаемость мышей в сравнении с контрольной группой была выше в группах TelP5, TM024G и ТМ024С в случае однократного введения олигонуклеотидов.
-K
- TM0-24G
- TM0-24C -TM0-12G
- TelP5
21-й
день
4
Рис. Динамика медиан объема опухоли при трехкратном введении фосфоротиоатных олигонуклеотидов
в дозе 18 мкг/мышь
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Глухов А.И., Свинарева Л.В., Северин С.Е. [и др.] Ингибиторы теломеразы - противоопухолевые лекарственные препараты нового поколения // Биотехнология. - 2010. - № 4. - С. 8-16.
2. Свинарева Л.В., Глухов А.И., Швец В.И. Ингибирование активности теломеразы модифицированными олигонуклеотидами // Тезисы докладов V Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2009. - С. 210.
3. Глухов А.И., Москалева Е.Ю., Литвин Я.А. [и др.] Динамика накопления олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, их внутриклеточное распределение и влияние на выживаемость опухолевых клеток // Тезисы докладов VII Конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасность». - М., 2010. - С. 59-60.
4. Глухов А.И., Москалева Е.Ю., Литвин Я.А. [и др.] Исследование влияния олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на распределение опухолевых клеток по фазам клеточного цикла // Тезисы докладов VII Конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасность». - М., 2010. - С. 57-58.
Глухов Александр Иванович, доктор химических наук, профессор кафедры биологической химии ГОУ ВПО «Первый Московский медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России, Россия, г. Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 1, тел. (499) 246-70-26
Апрятин Сергей Александрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ГУЗ «Московский НИИ медицинской экологии» Департамента здравоохранения Москвы, Россия, 117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, 8, тел. (499) 616-23-20, e-mail: mniime@mosgorzdrav.ru
Северин Сергей Евгеньевич, доктор химических наук, член-корр. РАМН, профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГОУ ВПО «Первый Московский медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России, Россия, г. Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 1, тел. (499) 246-70-26
УДК 616.12-009.72-036.11-092
© А.В. Дедов, А.А. Панов, 2011
А.В. Дедов, А.А. Панов
АНТИТЕЛА К E.COLI И К ЭНДОТОКСИНУ ГРАМ-НЕГАТИВНОЙ МИКРОФЛОРЫ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ КОРОНАРНЫМ СИНДРОМОМ
ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
У пациентов с ОКС уровни АЭА были ниже, чем в контрольной группе в 3,235±0,152 пг/мл против 4,5±0,1 (р<0,05). Кроме того, концентрация у доноров АКА была значительно выше, чем у пациентов с ОКС, соответственно, 23,5±1,5 и 17,56±0,78 г/мл (р<0,05). У больных ОКС мы обнаружили снижение концентрации AEA и АСА на 30% по сравнению с контролем, что может указывать на повышенное потребление их в реакции связывания с кишечным эндотоксином в стресс-реакции, что может иметь адаптивный характер при ОКС.
Ключевые слова: кишечная палочка, острый коронарный синдром.
A.V. Dedov, А.А. Panov
ANTIBODIES TO E.COLI AND ENDOTOXIN OF GRAM-NEGATIVE MICROFLORA IN PATIENTS WITH ACUTE
CORONARY SYNDROME
In patients with ACS the levels of АЕА were lower than in controls: 3,235±0,152 pg / ml vs. 4,5±0,1 (p<0,05). Similarly, normal level of АСА was significantly higher than in patients with ACS, respectively, 23,5±1,5 and 17,56±0,78 g / ml (p<0,05). In patients with ACS we discovered the reduction of AEA and АСА levels by 30% compared with controls, which may indicate an increased intake of these antibodies in the binding reaction with intestinal endotoxin under stress reaction, which could have an adaptive nature in ACS.
Key words: Escherichia coli, acute coronary syndrome.
В патогенезе многих заболеваний важную роль играет эндотоксин (ЭТ) грам- негативной микрофлоры человека, а также антиэндотоксиновые антитела (АЭА) и сывороточные противомикробные антитела (СПА) [1]. Имеются сообщения о важной патогенетической роли ЭТ, АЭА и СПА при физических перегрузках и стрессах [2]. Острый коронарный синдром (ОКС) можно рассматривать как модель заболевания, сопровождающегося острым стрессом. При этом возможно развитие срыва адаптивных, или приспособительных механизмов на разных уровнях, включая иммунную систему.
Цель: оценка возможной клиникопатогенетической значимости определения АЭА и СПА при ОКС.
Материалы и методы. У 20 больных ОКС 39-67 лет (в среднем 56,98±0,76), находившихся на стационарном лечении, исследовали уровни АЭА к гликолипиду S. Minnesota RE-595 (Sigma, USA) и антител к липо-полисахаридному антигенному комплексу Е. coli O14 (АКА) в сыворотках крови на 3-5 день заболевания. Использовали тест-системы Казанского НИИ Эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора. Контролем служили сыворотки 500 здоровых доноров («пул»).
Результаты. У больных ОКС имели место более низкие уровни АЭА, составившие 3,235±0,152 мкг/мл против 4,5±0,1 в контроле (p<0,05). Аналогично у доноров концентрация АКА была значительно выше, чем у лиц с ОКС, составляя соответственно 23,5±1,5 и 17,56±0,78 мкг/мл (p<0,05).
При ОКС выявлено снижение титров АЭА и АКА до 30% по сравнению со здоровыми лицами, что может указывать на повышенное потребление их в реакции связывания с ЭТ, поступающим из кишечника на фоне стресса. Эти данные можно использовать при прогнозировании состояния антиэндотоксинового иммунитета в реакциях адаптивного характера, например при ОКС.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю., Мосежный А.И. Антиэндотоксиновый иммунитет в физиологии и патологии // Медицина экстремальных ситуаций.. - 1999 - № 1. - С. 22-26.
2. Опарина О.Н. Антиэндотоксиновый иммунитет в реакции срочной адаптации к физическим нагрузкам. Теория и практика физической культуры. Научно-теоретический журнал № 6. URL: http://lib.sportedu.ru/press /tpfk/2003n6/ p26,39-40.htm (дата обращения 08.02.2011).
Дедов Алексей Владимирович, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры факультетской терапии и профессиональных болезней с курсом последипломного образования ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. 89061788885.
Панов Анатолий Анатольевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой пропедевтики внутренних болезней с курсом ревматологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцраз-вития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 35-81-30.
