CC BY
16
БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 615.273.53:547.789.1].032.076.9 DOI 10.178l6/pmj35188-94
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ В КРОВИ 4-ХЛОРФЕНИЛ-2-ГИДРОКСИ-4-ОКСО-2-БУТЕНОАТА ТИАЗОЛИНАММОНИЯ НА АНТИКОАГУЛЯНТНЫЙ ЭФФЕКТ ПРИ ПОДКОЖНОМ ВВЕДЕНИИ
А.В. Старкова*, Ю.Н. Карпенко, Б.Я. Сыропятов, Ф.В. Собин, Н.А. Пулина
Пермская государственная фармацевтическая академия, Россия
STUDY OF INFLUENCE OF BLOOD THIAZOLINE AMMONIUM 4-CHLOROPHENYL-2-HYDROXY-4-OXO-2-BUTENOATE CONCENTRATION ON ANTICOAGULANT EFFECT UPON SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION
A.V. Starkova*, Yu.N. Karpenko, B.Ya. Syropyatov, F.V. Sobin, N.A. Pulina
Perm State Pharmaceutical Academy, Russian Federation
Цель. Изучение влияния содержания в крови 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноата тиазоли-наммония на проявление антикоагулянтого эффекта при подкожном введении кроликам. Материалы и методы. Исследования проведены на беспородных кроликах, которым подкожно вводили вещество в дозе 35 мг/кг. Время свертывания крови определяли с помощью коагулометра «Мини-лаб 701», а концентрацию соединения в крови - с помощью жидкостного микроколоночного хроматографа «Милихром А-02».
Результаты. Максимальная концентрация соединения в крови и максимальный антикоагулянтный эффект достигаются через 30 мин после подкожного введения. Вещество оказывает антикоагулянтный эффект в течение 120 мин после введения. На данный момент концентрация соединения в крови соответствует 519,8 ± 145,41 нг/мл.
© Старкова А.В., Карпенко Ю.Н., Сыропятов Б.Я., Собин Ф.В., Пулина Н.А., 2018 тел. +7 902 631 20 04 e-mail: allaperm@list.ru
[Старкова АВ. ("контактное лицо) - кандидат медицинских наук, доцент кафедры физиологии; Карпенко ЮН. -кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры токсикологической химии; Сыропятов Б.Я. - доктор медицинских наук, профессор кафедры физиологии; Собин Ф.В. - кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель кафедры фармацевтической технологии; Пулина Н.А. - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая кафедрой фармацевтической технологии].
Выводы. Исследуемое соединение при подкожном введении быстро всасывается и начинает оказывать антикоагулянтный эффект. Эффективность его действия зависит от концентрации в крови. Ключевые слова. Прямые антикоагулянты, 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноат тиазоли-наммония.
Aim. To study the effect of blood thiazoline ammonium 4-chlorophenyl-2-hydroxy-4-oxo-2-butenoate content on the manifestation of anticoagulant effect upon subcutaneous administration to rabbits. Materials and methods. The studies were fulfilled on outbred rabbits. The substance was administered subcuta-neously in the dose of 35 mg/kg. The time of blood coagulation was determined using coagulometer "Minilab 701", and blood concentration - by means of liquid micro-column chromatograph "Milichrom A-02". Results. The obtained results prove that maximum concentration of the compound in blood and maximum anticoagulant effect is reached in 30 minutes after subcutaneous administration. The substance anticoagulant effect lasted for 120 minutes after its administration. At present, the compound concentration in blood is equal to 519.8 ± 145.41 ng/ml.
Conclusions. The studied compound, when administered subcutaneously, is quickly absorbed and begins to render an anticoagulant effect. Efficacy of action of this compound depends on its blood concentration. Key words. Direct anticoagulants, thiazoline ammonium 4-chlorophenyl-2-hydroxy-4-oxo-2-butenoate.
Введение
В развитых странах тромбозы и тром-боэмболические осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности населения. Риск возникновения этих осложнений высок у пациентов как терапевтического, так и хирургического профилей [3-6, 12, 19]. Для профилактики и лечения тромбозов и тромбоэмболий широко используются прямые антикоагулянты.
В настоящее время в качестве антикоагулянтов применяются непрямые и прямые ингибиторы тромбина, а также прямые ингибиторы фактора Ха.
К непрямым ингибиторам тромбина относят: нефракционированный гепарин, низкомолекулярные гепарины и синтетические пентасахариды (фондапаринукс). Прямым ингибитором тромбина является даби-гатрана этексилат, фактора Ха - риварокса-бан и апиксабан [8, 12, 17, 25].
Все они обладают побочными эффектами, которые ограничивают их применение.
Основными осложнениями при использовании нефракционированного гепарина
являются кровотечения, тромбоцитопения и остеопороз. Опасность кровотечения коррелирует с дозой гепарина, с применением дезагрегантной терапии и с тяжелым состоянием пациента [8, 25]. При введении препарата более 3 дней возможно развитие иммунной тромбоцитопении вследствие образования антител к комплексу гепарин + фактор 4 тромбоцитов [8, 25].
Побочные действия низкомолекулярных гепаринов такие же, как и у нефракциониро-ванного гепарина, но выражены они в меньшей степени. В несколько раз реже возникают тромбоцитопения, остеопороз, меньше риск появления кровотечений. Так же, как и нефракционированный гепарин, низкомолекулярные гепарины выводятся почками и могут накапливаться в крови у больных с почечной недостаточностью. Но поскольку низкомолекулярные гепарины в меньшей степени связываются плазменными белками, эндотелием и тромбоцитами и единственный способ их выведения - это почки, то у больных с тяжелой почечной недостаточностью их применение даже более опасно, чем нефрак-ционированного гепарина [1, 7, 8, 20].
При использовании фондапаринукса сообщалось о возникновении гематом, сыпи или зуда в местах подкожных инъекций, обратимом бессимптомном увеличении уровня аминотрансфераз в сыворотке крови, тром-боцитопении, возникновении головной боли, озноба, гипертермии, тошноты, запора, бессонницы, аллергических реакций [8, 18, 25].
При применении дабигатрана возможны кровотечения любой локализации, анемия, тромбоцитопения, нарушения функций печени. Противопоказаниями к его применению являются: почечная недостаточность тяжелой степени; нарушения функций печени [10, 13-15, 22].
При лечении ривароксабаном были выявлены следующие побочные действия: кровотечения различной локализации, анемия, тромбоцитоз, тахикардия, гипотензия, тошнота, нарушения стула, боль в животе, сухость во рту, рвота, повышение активности ряда ферментов, нарушения функций печени, головокружение, головная боль, обмороки, почечная недостаточность, зуд, сыпь, боль в конечностях, лихорадка, отеки, ухудшение общего самочувствия. Противопоказаниями к его назначению являются: кровотечения, заболевания печени, беременность, период лактации, детский и подростковый возраст, почечная недостаточность тяжелой степени, непереносимость лактозы или галактозы [9, 11, 16, 23].
Противопоказаниями к применению апиксабана являются: кровотечения, заболевание печени, нарушение функций почек, возраст до 18 лет, беременность, грудное вскармливание. Применение апиксабана может вызвать: анемию, тромбоцитопению, артериальную гипотензию, кровотечения различной локализации, тошноту, нарушения функций печени [2, 8, 16].
Актуальность проблемы поиска новых прямых антикоагулянтов для практического здравоохранения определила необходимость углубленных исследований веществ, обладающих антикоагулянтной активностью для дальнейшего их внедрения.
В результате скрининговых исследований веществ, синтезируемых в Пермской государственной фармацевтической академии, было выявлено соединение, которое по результатам предыдущих исследований in vitro и in vivo замедляет процесс свертывания крови - 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноат тиазолинаммония [26, 27].
Данное вещество, полученное в лабораторных условиях, представляет собой белый мелкокристаллический порошок без запаха, растворимый в воде, спирте этиловом, диок-сане, труднорастворимый в хлороформе.
Цель работы - изучение влияния содержания в крови 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноата тиазолинаммония на выраженность антикоагулянтного эффекта при подкожном введении кроликам.
Материалы и методы
исследования
Исследования in vivo проведены на беспородных кроликах массой 2-5 кг. Животные содержались при стандартном пищевом режиме в условиях вивария в соответствии с СанПиН № 1045-73 и требованиями Фарм-комитета РФ к проведению доклинических испытаний, изложенных в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [21], а также с со-
блюдением международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.).
Для изучения антикоагулянтного эффекта вещество вводили подкожно в дозе 35 мг/кг (1/40 ЛД50), которое составило при подкожном введении 1290 (1100-1500) мг/кг. Доза была выбрана с учетом объема циркулирующей крови кролика. Данная доза вещества соответствует концентрации соединения 1 мг/мл крови кролика [28].
Забор крови производили 5 раз -до введения соединения и через 30, 60, 90 и 120 мин после него. Из краевой вены уха отбирали 2 мл крови, стабилизировали 0,2 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия.
Изучение времени свертывания крови проводилось с помощью коагулометра «Ми-нилаб 701». В кювету помещали 100 мкл крови и добавляли 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия. Пробы инкубировали в течение 60 с, затем добавляли 100 мкл 1%-ного раствора хлорида кальция и приступали к измерению времени свертывания крови.
Для определения концентрации исследуемого соединения в крови вещество вводилось подкожно в дозе 35 мг/кг. Забор крови производился из краевой вены уха. Отбирали 2 мл крови, стабилизировали 0,2 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия. Забор крови производился 9 раз - до введения и через 30, 60, 90, 120, 180, 360 мин, 24 и 48 ч после введения соединения.
Определение концентрации 4-хлор-фенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноата тиазо-линаммония в плазме крови производили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконо-ва») в течение 30-60 мин после забора крови.
Хроматографическое исследование осуществляли на колонке Pronto SIL 120-3-C18 AQ в режиме градиентного элюирования с использованием подвижной фазы на основе ацетонитрила и перхлоратного буфера. Длина волны детектирования исследуемого вещества - 320 нм.
Пробоподготовка биологической жидкости проводилась следующим образом: цельную кровь (2 мл) центрифугировали в пробирках Эппендорфа при 3000 об/мин в течение 5 мин. Плазму отбирали в количестве 0,5 мл и переносили в пробирку Эппендорфа, добавляли 100 мкл кислоты хлористоводородной и 1,5 мл эфира диэтилового. Содержимое пробирки встряхивали на пробирочном вортексе в течение 10 мин и центрифугировали при 5000 об/мин 5 мин; 1 мл экстракта помещали в виалу хроматографи-ческую и испаряли органический растворитель в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяли в 200 мкл метанола и исследовали методом ВЭЖХ.
Результаты исследования обработаны с помощью вариационной статистики методом Фишера - Стьюдента [24].
Результаты и их обсуждение
Как видно из табл. 1, при подкожном введении вещество быстро всасывается, так как максимальное снижение свертываемости отмечается уже через 30 мин после введения. Замедление свертывания крови на 30-й мин составило 102,9 % от исходного времени свертывания. Активность сохранялась около 2 ч.
При исследовании концентрации соединения в крови после подкожного введения видно (табл. 2), что вещество достаточно быстро всасывается. Максимальной концентрация стала через 30 мин после
введения и составила 1610,2 ± 194,48 нг/мл. Затем она начала постепенно снижаться. Через 60 мин после введения она составила 1189,8 ± 278,03 нг/мл, через 90 мин -721,4 ± 220,73 нг/мл, через 120 мин -519,8 ± 145,41 нг/мл. К 180 мин исследова-
ния концентрация значительно снизилась до 273,2 ± 74,52 нг/мл. Через сутки после введения в крови обнаруживается остаточное содержание вещества - 51,0 ± 22,49 нг/мл. Через 48 ч после введения вещество в крови не обнаруживается.
Таблица 1
Влияние 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноата тиазолинаммония на свертывание крови при подкожном введении в дозе 35 мг/кг
Интервал Время свертывания, с Изменение свертываемости, % Количество исследований Р
Исходная свертываемость 128,4 ± 3,92 8
30 мин 260,6 ± 17,76 -102,9 8 < 0,001
60 мин 241,7 ± 9,81 -88,2 8 < 0,001
90 мин 228,1 ± 14,00 -77,6 8 < 0,001
120 мин 158,9 ± 10,22 -23,7 8 < 0,05
Примечание:р - в сравнении с исходной свертываемостью.
Таблица 2
Исследование концентрации 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноат тиазолинаммония в крови при подкожном введении в дозе 35 мг/кг
Интервал Концентрация, нг/мл Количество исследований
Исходная концентрация 0 5
30 мин 1610,2 ± 194,48 5
60 мин 1189,8 ± 278,03 5
90 мин 721,4 ± 220,73 5
120 мин 519,8 ± 145,41 5
180 мин 273,2 ± 74,52 5
360 мин 115,0 ± 72,07 5
24 ч 51,0 ± 22,49 5
48 ч 0 5
Полученные результаты свидетельствуют о том, что 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноат тиазолинаммония быстро всасывается при подкожном введении. Максимальная концентрация соединения в крови (1610,2 ± 194,48 нг/мл) достигается через 30 мин после подкожного введения. Максимальный антикоагулянтный эффект также соответствует 30 мин исследования - свертываемость крови замедляется на 102,9 %. Затем антикоагулянтная активность начинает сни-
жаться, через 60 мин замедление свертывания составило -88,2 %. Снижается и концентрация соединения в крови, через 60 мин после введения равна 1189,8 ± 278,03 нг/мл. Через 90 мин замедление свертывания крови составило -77,6% от исходного, при этом концентрация соединения в крови снизилась до 721,4 ± 220,73 нг/мл. Вещество оказывает антикоагулянтный эффект в течение 120 мин после введения, замедление свертывания крови при этом составило 23,7 % от исход-
ного уровня. На данный момент концентрация соединения в крови соответствует 519,8 ± 145,41 нг/мл. Снижение концентрации соединения до более низкого значения приводит к прекращению действия вещества.
Выводы
1. Исследуемое соединение при подкожном введении быстро всасывается и начинает оказывать антикоагулянтный эффект.
2. Максимальная концентрация вещества в крови и максимальный антикоагу-лянтный эффект отмечены на 30-й минуте после введения.
3. Эффективность действия соединения зависит от его концентрации в крови.
4. Снижение концентрации 4-хлорфе-нил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноата тиазолин-аммония в крови ниже 519,8 ± 145,41 нг/мл приводит к прекращению оказываемого действия.
Библиографический список
1. Аверков О.В. Низкомолекулярные ге-парины в новых рекомендациях по ведению больных острым коронарным синдромом без стойких подъемов сегмента ST на ЭКГ. Клиническая фармакология и терапия 2008; 17 (1): 36-40.
2. Апиксабан: инструкция, применение и формула, available at: http://www.rlsnet.ru/ mnn_index_id 6095.htm
3. Баркаган З.С. Очерки антитромбо-тической фармакопрофилактики и терапии. М.: Ньюдиамед 2000; 148.
4. Баркаган З.С. Современная анти-тромботическая профилактика и терапия. Фармакотерапия заболеваний сердечнососудистой системы: лекции для практиче-
ских врачей. VIII национальный конгресс «Человек и лекарство». М. 2002; 142-153.
5. Баркаган З.С., Сердюк Г.В. Невынашивание беременности и мертворождае-мость при нарушениях в системе гемостаза. Гематология и трансфузиология 1991; 4: 3-5.
6. Бокарев И.Н., Попова Л.В. Венозный тромбоэмболизм и тромбоэмболия легочной артерии. Медицинское информационное агентство 2005; 208.
7. Бокарев И.Н., Попова Л.В. Опыт применения низкомолекулярных гепаринов при лечении тромбозов глубоких вен. Трудный пациент 2008; 10, available at: http://www/t-pacient.ru/archive/tp10-08/tp10-08 495.html.
8. Васильева Е.Ю., Воробьева И.И. Прямые антикоагулянты в кардиологии. Российский медицинский журнал 2010; 18 (22): 1379-1383.
9. Верткин А.А. Применение риварок-сабана в качестве антитромбической терапии у пациентов с неклапанной фибрилляцией предсердий. Кардиология 2013; 4: 3-4.
10. Гиляров М.Ю. Дабигатран: как выбрать оптимальную дозу в реальной клинической практике? Вестник аритмологии 2012; 69: 77-80.
11. Гиляров М.Ю. Ривароксабан в профилактике тромбоэмболических осложнений у пациентов с фибрилляцией предсердий. Рациональная фармакотерапия в кардиологии 2012; 8 (3): 453-456.
12. Головачева Т.В., Скворцов В.В., Скворцов К.Ю. Применение антикоагулянтов при сердечно-сосудистых заболеваниях. Атеротромбоз 2009; 2: 2-19.
13. Дабигатран - новый подход к профилактике тромбоэмболических осложнений. Травматология и ортопедия России 2011; 3 (61): 80-83.
14. Дабигатрана этексилат: инструкция, применение, формула, available at: http:// www.rlsnet.ru/mnn_index_id_5498.htm.
15. Затейщиков Д.А., Зотова И.В. Да-бигатран: переспективы клинического применения. Фарматека 2011; 15: 30-34.
16. Канорский С.Г. Предупреждение тромбоэмболий у больных с фибрилляцией предсердий: проблема выбора орального антикоагулянта. Международный медицинский журнал 2012; 3: 24-29.
17. Куликов А.Н. Фармакотерапия острых коронарных синдромов. ФАР Миндекс-Практик 2005; 9: 1-16.
18. Латфулин И.А., Подольская А. А. Применение антикоагулянтов при остром коронарном синдроме. Актуальные вопросы клинической фармакологии 2009; 3: 71-75.
19. Макацария А.Д., Бицадзе В.О. Тром-бофилические состояния в акушерской практике. М.: Russo 2001; 480.
20. Мелкумян А.Л., Берковский А.Л., Ки-шинец Р.С., Козлов А.А. Мониторинг эффективности применения прямых антикоагулянтов. Гематология и трансфузиология 2013; 58 (1): 32-38.
21. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К 2012; 944.
22. Моисеев С.В. Когда и как применять дабигатран при фибрилляции предсердий? Рациональная фармакотерапия в кардиологии 2012; 8 (6): 819-825.
23. Никонов В.В., Курсов С.В. Механизм действия антикоагулянтов и перспективы клинического применения ривароксабана -первого эффективного ингибитора фактора Ха с возможностью энтерального введения. Медицина неотложных состояний 2011; 34 (3): 52-57.
24. Прозоровский В.В. Статистическая обработка результатов фармакологических исследований. Психофармакология и биологическая наркология 2007; 7 (3-4): 2090-2120.
25. Пэрадайн Н.А., Шувалова Н.В. Новые пероральные антикоагулянты. Здравоохранение Чувашии 2013; 4, available at: http://giduv.eom/2013/4/novyeperoralnye.
26. Старкова А.В., Собин В.Ф, Сыропя-тов Б.Я., Пулина Н.А. Исследование влияния 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноат тиазолинаммония на свертывание крови при внутрижелудочном и подкожном введении. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2014; 7: 53-55.
27. Старкова А.В., Собин В.Ф, Сыропя-тов Б.Я., Пулина Н.А. Сравнительная оценка влияния 4-хлорфенил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноат тиазолинаммония и гепарина на свертывание крови. Экспериментальная и клиническая фармакология 2013; 76 (10): 25-26.
28. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шеф-тель В.О., Оникиенко Ф.А. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте. М.: Медицина 1978;
Материал поступил в редакцию 15.11.2017
