УДК 577.212.3:575.167
А. Н. Заинчковская1, Е. А. Фомина1, А. В. Ярошевич2, А. А. Зубкович2, О. Ю. Урбанович1
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ HvCBF14 И HvCOR14b У СОРТООБРАЗЦОВ ОЗИМОГО ЯЧМЕНЯ В МОДЕЛИРУЕМЫХ УСЛОВИЯХ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220141, г. Минск, ул. Ф. Скорины, 34 e-mail: [email protected] Республиканское унитарное предприятие «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию» Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Тимирязева, 1
Исследовано изменение уровня экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b методом РТ-ПЦР в условиях холо-дового стресса у устойчивых к холоду сорта Буслик, сортообразцов 990829, 990668, 989159, а также чувствительного к холоду сортообразца 9201077. Наибольшее увеличение уровня экспрессии гена HvCBF14 в 69 раз было выявлено для сортообразца 990829 через 2 ч при наступлении условий -4 °С. Наименьшее увеличение уровня экспрессии указанного гена в 4 раза установлено для сортообразца 990668 через 2 ч при наступлении условий +4 °С. Для гена HvCOR14b наибольшее увеличение уровня его экспрессии выявлено для сортообразца 9201077 через 2 ч при наступлении условий -2 °С — в 1 236 раз, а наименьшее — для сорта Буслик — через 2 ч при наступлении условий +4 °С — в 7 раз. Показано влияние генотипа ячменя на уровень экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b при воздействии холодового стресса. Увеличение экспрессии данных генов отмечено после наступления условий -4 °С у устойчивых к холоду образцов. Уровень экспрессии гена HvCBF14 в целом ниже, чем гена HvCOR14b.
Ключевые слова: абиотический стресс, транскрипционные факторы, озимый ячмень, ген HvCBF14, ген HvCOR14b, холодовой стресс.
Для цитирования: Изучение влияния холодового стресса на уровень экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b у сортообразцов озимого ячменя в моделируемых условиях / А. Н. Заинчковская, Е. А. Фомина, А. В. Ярошевич [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2024. - Т. 37. - С. 26-35.
Введение
Ячмень (Hordeum vulgare) является модельным объектом для изучения реакций растений на изменение климатических условий [1]. Данная культура часто классифицируется на основе типа ее развития на озимый, яровой и факультативный. Озимый ячмень требует яровизации и поэтому высевается осенью [2]. Хорошая приспособляемость к различным агроклиматическим условиям способствовала распространению выращивания ячменя в климатических зонах с большими вариациями температурного режима в течение вегетационного периода. Сегодня по объемам производства он входит в четверку ведущих зерновых
культур в мире [3]. Ячмень используется для производства пищевых продуктов, в пивоварении и в качестве корма для животных [4].
Посевные площади ячменя в Республике Беларусь, по данным на июль 2024 г., составляют 438,6 тыс. га — 18,7% от посевных площадей, занятых под зерновые и зернобобовые, и 7,6% от всех посевных площадей в стране. Следует отметить, что в последние годы на территории Республики Беларусь происходит постоянное увеличение посевных площадей озимого ячменя (в 2019 г. — 12 тыс. га, в 2020 г. — 18 тыс. га, в 2021 г. — 28 тыс. га, в 2022 г. — 60 тыс. га, в 2023 г. — 150 тыс. га) [5].
Новые методы орошения, массовое использование удобрений и средств защиты растений, механизация, селекция сельскохозяйственных культур и внедрение улучшенных сортов стали определяющими факторами в наблюдаемом повышении производительности данной культуры в мире. Однако экстремальные погодные условия, сокращение пахотных земель и растущие потребности в удобрениях и поливе подвергают выращивание культур на полях стрессовым условиям, что существенно влияет на сельскохозяйственное производство. Создание новых сортов сельскохозяйственных культур с более высокой адаптацией к колебаниям погодных условий будет способствовать обеспечению глобальной продовольственной безопасности [6]. Низкая температура является одним из основных экологических стрессов при возделывании ячменя, который может приводить к обезвоживанию клеток растений, лизису хлоропластов и увеличению жесткости клеточной мембраны, тем самым ограничивая фотосинтез и метаболизм углеводов [7].
Холодовой стресс ограничивает географическое распространение растений и влияет на их рост, развитие и урожайность. Растения как сидячие организмы выработали сложные биохимические и физиологические механизмы для адаптации к холодовому стрессу. Холодовая акклиматизация является сложно наследуемым признаком у злаков, контролируемым несколькими генетическими регулятор-ными сетями. Молекулярные и генетические исследования выявили ряд факторов транскрипции, выступающих в качестве ключевых регуляторов транскриптомной перестройки, которая приводит к холодовой акклиматизации [8]. Наиболее изученным семейством факторов транскрипции (TF), ответственным за холодовую закалку и морозостойкость, является мультигенное семейство CBF/DREB1. Эти TF принадлежат к суперсемейству AP2/ ERF (фактор, реагирующий на APETALA2/ этилен) и способны связываться с CRT/DRE (элементы, реагирующие на C-повтор/деги-дратацию) в промоторной области нескольких генов, индуцируемых холодом. Они быстро реагируют на холод, демонстрируя временную экспрессию в течение нескольких часов. CBF гены ячменя были классифицированы на три филогенетические группы: HvCBFI, HvCBFIII
и HvCBFIV. Семь CBF генов группы HvCBFI широко распространены по всему геному, в то время как 13 CBF генов групп HvCBFIII и HvCBFIV входят в состав локуса FR-H2 и организованны в один кластер [9], который, в свою очередь, разделен на проксимальную (HvCBF 2, 4 и 9), центральную (HvCBF 3, 12, 13, 14, 15, 16) и дистальную (HvCBF 6 и 10) части. CBF гены локуса FR-H2 фланкированы некодирующими последовательностями, обогащенными множественными повторяющимися элементами [6]. Согласно последним исследованиям, среди 13 CBF генов локуса FR-H2 основной вклад в ответ на холодовой стресс вносят гены HvCBF14, HvCBF2a и HvCBF4b [10]. У ячменя экспрессия CBF генов является очень важным фактором для индукции генов холодочувствительности (COR), таких как COR14b и DHN5. Этот каскад является инициирующим событием холодовой акклиматизации растений, при котором происходит перестройка метаболизма растений и повышение их морозостойкости. Индукция CBF генов, в свою очередь, опосредована конститутивно экспрессируемыми белками ICE, которые активируются холодом и способны индуцировать экспрессию CBF [11].
Поскольку CBF14 является основным геном, который активируется при холодовом воздействии и может регулировать другие гены CBF, а также активировать экспрессию одного из генов холодочувствительности COR14b, целью нашего исследования было изучение влияния холодового стресса на изменение уровня экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b озимого ячменя белорусской селекции в моделируемых условиях.
Материалы и методы
Растительный материал и условия выращивания растений. Для исследования были взяты устойчивые к холоду по результатам полевых испытаний сорт Буслик, сортообраз-цы Олимп х Синдирелла (селекционный номер — 990829), Тереза х Титус (селекционный номер — 990668), Наоми х Титус (селекционный номер — 989159), а также чувствительный к холоду сортообразец (Karakan х Laverda) х (Тимофей х Laverda) (селекционный номер — 9201077). Данные образцы были переданы отделом ячменя РУП
«Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию».
Условия выращивания. Растения были выращены при определенном режиме в климатической камере Ро1-Еко-АрагаШга KK1200Fit. 1 стадия — 25 дней при +16/+10 °С (12 ч день/12 ч ночь), 2 стадия — 5 дней при + 10/+4 °С (12 ч день/12 ч ночь), 3 стадия — +4 °С (48 ч ночь), 4 стадия — +2 °С (60 ч ночь), 5 стадия--2 °С (24 ч ночь), 6 стадия — 5 дней при +2 °С (12 ч ночь)/-2 °С (12 ч
ночь), 7 стадия--4 °С (24 ч ночь) — данный
режим подобран в соответствии с условиями, максимально приближенными к тем, которым подвергаются растения в осенне-зимний пери-
Результаты и обсуждение
В связи с важностью генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ъ в ответной реакции на воздействие низких температур в нашем исследовании было изучено изменение показателей уровня их экспрессии методом ПЦР в режиме реального времени в моделируемых условиях холодового стресса у устойчивого к холоду по результатам полевых испытаний сорта Буслик, сортообразцов 990829, 990668, 989159, а также чувствительного к холоду сортообразца 9201077. Уровень экспрессии указанных генов измеряли на стадиях 3, 5, 6, 7, указанных в разделе «Материалы и методы», через 2 и 24 ч после наступления каждой из них.
При изучении показателей уровня экспрессии генов ИуСБЕ14 и ИуСОШ4Ъ нами были обнаружены значительные различия в значениях для каждого из исследуемых образцов. Так, для сорта Буслик (рис. 1) были показаны статистически значимые положительные значения уровня экспрессии исследуемых генов
од в Республике Беларусь.
Уровень экспрессии указанных генов измеряли на стадиях 3 (+4 °С), 5 (-2 °С), 6 (+2/-2 °С), 7 (-4 °С) через 2 и 24 ч после наступления каждой из них.
Получение препаратов РНК, синтез кДНК, проведение ПЦР в режиме реального времени, а также статистическая обработка данных проводилась по методикам, представленным в исследованиях А. Н. Заинчковской с соавторами [12, 13].
Последовательности праймеров для генов ИуСБЕ14, ИуСОШ4Ъ и референсного гена, кодирующего первичную последовательность актина, приведены в таблице 1.
и их постепенное увеличение по мере изменения температурных режимов согласно этапам моделируемых условий холодового стресса. Наибольшие увеличения уровня экспрессии гена ИуСОЯМЪ были показаны через 2 и 24 ч после наступления стадии моделируемых условий -4 °С и составили 134 и 187 раз соответственно. На протяжении всего эксперимента наблюдалось увеличение уровня экспрессии как гена ИуСБЕ14, так и ИуСОЯ14Ъ, однако после 24 ч при наступлении этапа +2 °С/-2 °С было показано небольшое снижение уровня экспрессии с 34 до 11 раз для гена ИуСБЕ14 и с 116 раз до 89 для гена ИуСОШ4Ъ, после чего следовало дальнейшее увеличение на последующих этапах моделируемых условий холодового стресса.
Анализ уровня экспрессии указанных генов у сортообразца 990829 продемонстрировал незначительные колебания в изменении исследуемых показателей по сравнению с сортом Буслик как для гена ИуСБЕ14, так
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для анализа экспрессии
генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ъ
Название маркера Последовательность праймеров 5'-3' Т III Ожидаемый размер, п. н.
г_Ш_Сог14Ь Б TTGAGGATGTGAGCAAATGAG R TACATCGTCAATGACGAGACC 60 103
г_Ш_СВР14 Б GCTCCACTCTCCAGCATCCA R GTGCCCATCACACGGGGA 64 145
Ш_АСТ Б GGCGCAGTCCAAGAGAGGTATC R CAACACAGGGTGCTCCTCGGG 142 56-64
250,00
+4°С<2ч) 44°С(24ч) -2гС(2ч) -2°С(24ч) +2°С/-2*С +2°СМ°С -4°С(2ч) -44; (24ч)
(2ч) (24ч)
Рис. 1. Относительный уровень экспрессии генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ь у сорта озимого ячменя Буслик в моделируемых условиях холодового стресса. На диаграмме представлены средние значения и стандартные отклонения. Уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ь у растений, не подвергающихся холодовому стрессу,
равен 1. Р <0,01 (**) по сравнению с контролем
и для гена ИуСОЯ14Ь (рис. 2). Исследование уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 у данного сортообразца показало, что на протяжении всех этапов моделируемых условий холодового стресса показатели уровня его экспрессии были положительными и статистически значимыми. Наименьшие значения уровня экспрессии для данного гена были показаны на первом измеряемом этапе моделируемого эксперимента, т. е. через 2 ч при +4 °С, где было показано увеличение в 5 раз по сравнению с контролем. Для ИуСОЯ14Ь на первых этапах моделируемых условий наблюдалось отсутствие экспрессии. В целом у сортообразца 990829 было выявлено два этапа моделиру-мых условий, при которых показатели уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 были наивысшими, а именно через 2 ч при -2 и -4 °С, и при наступлении данных условий экспрессия увеличилась в 59 и 69 раз соответственно. При этом наблюдалось снижение уровня экспрес-
сии от 23 раз при -2 °С через 24 ч до 13 и 15 раз при +2/-2 °С через 2 и 24 ч соответственно. Как указывалось выше, на первых измеряемых этапах эксперимента экспрессия гена ИуСОШ4Ь не наблюдалась, однако через 24 ч после наступления этапа -2 °С она увеличилась в 24 раза. На дальнейшем этапе моделируемых условий холодового стресса через 2 ч при +2/-2 °С снова было показано отсутствие экспрессии и последующее увеличение уровня экспрессии в 14 раз при +2/-2 °С через 24 ч. Наибольшее увеличение уровня экспрессии гена ИуСОШ4Ь у данного сортообразца (в 58 и 430 раз) было зарегистрировано после наступления этапа моделируемого эксперимента -4 °С через 2 и 24 ч соответственно.
Результаты изменения уровня экспрессии генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ь у сортообразца 990668 приведены на рисунке 3. Показатели изменения уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 у данного сортообразца были статистически
Рис. 2. Относительный уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ь у сортообразца озимого ячменя 990829 в моделируемых условиях холодового стресса. На диаграмме представлены средние значения и стандартные отклонения. Уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ь у растений, не подвергающихся холодовому стрессу,
равен 1. Р <0,01 (**) по сравнению с контролем
800,00
■»4"С(2ч) -ь40ССМч) -З^С^ч) -2°С (24ч) +2°СМ°С *ГСИ*С -4°С(2ч) -4°С (24ч)
(1ч) (24ч)
Рис. 3. Относительный уровень экспрессии генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ь у сортообразца озимого ячменя 990668 в моделируемых условиях холодового стресса. На диаграмме представлены средние значения и стандартные отклонения. Уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ь у растений, не подвергающихся холодовому стрессу,
равен 1. Р <0,01 (**) по сравнению с контролем
значимы и имели положительные значения на протяжении всех этапов моделирования условий холодового стресса. Самые низкие значения уровня экспрессии наблюдались через 2 и 24 ч после наступления этапа +4 °С, где было показано увеличение экспрессии в 4 и 5 раз соответственно. Близкие по значению показатели также были выявлены через 2 и 24 ч после наступления этапа +2/-2 °С, где уровень экспрессии указанного гена увеличивался в 6 и 5 раз соответственно. Самый высокий уровень экспрессии гена ИуСБЕ14 был обнаружен через 2 ч при переходе на этапы с температурными режимами -2 и -4 °С, где его показатели достигали значений в 31 и 56 раз соответственно. При исследовании уровня экспрессии гена ИуСОЯ14Ь у сортообразца 990668 наблюдались высокие значения, начиная с первых этапов эксперимента, и уже при +4 °С через 2 и 24 ч увеличение экспрессии составило 142 и 212 раз соответ-
ственно. На следующем этапе при -2 °С через 2 ч для указанного сортообразца было показано снижение значений уровня экспрессии гена ИуСОШ4Ь до 76 раз. В дальнейшем, уже через 24 ч на данном этапе уровень экспрессии имел значение в 213 раз. Максимальное значение уровня экспрессии указанного гена в 580 раз было установлено через 24 ч после наступления этапа моделируемых условий холодового стресса -4 °С.
Результаты изменения уровня экспрессии генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ь у сортообразца 989159 приведены на рисунке 4. При анализе уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 для указанного сортообразца в основном было показано незначительное колебание уровня экспрессии данного гена на протяжении всех этапов моделируемых условий холодового стресса. Наименьшие значения уровня экспрессии исследуемого гена были выявлены при наступлении этапа +4 °С через 2 и 24 ч, где было
Рис. 4. Относительный уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ь у сортообразца озимого ячменя 989159 в моделируемых условиях холодового стресса. На диаграмме представлены средние значения и стандартные отклонения. Уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ь у растений, не подвергающихся холодовому стрессу,
равен 1. Р <0,01 (**) по сравнению с контролем
показано увеличение экспрессии в 8 и 7 раз соответственно. Наибольшие показатели уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 наблюдались через 2 ч после наступления моделируемых этапов -2 и -4 °С, где их значения возросли до 46 и 32 раз соответственно. Исследование уровня экспрессии гена ИуСОЯ14Ъ у данного сортообразца выявило достаточно высокие статистически значимые показатели данного признака, которые за исключением этапа -2 °С через 2 ч постепенно возрастали на всем протяжении моделируемых условий холодового стресса. Наибольшие значения уровня экспрессии указанного гена наблюдались после наступления этапа моделируемого эксперимента -4 °С через 2 и 24 ч и составили 561 и 821 раз соответственно.
Показатели уровня экспрессии генов ИуСБЕ14 и ИуСОЯ14Ъ у сортообразца 9201077 были статистически значимы, за исключением гена ИуСОЯ14Ъ при -4 °С через 2 ч, и имели большие различия (рис. 5). Так, при изучении уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 нами было выявлено два основных пика увеличения показателей уровня его экспрессии через 2 ч после наступления этапов моделируемых условий холодового стресса -2 и -4 °С и составили 26 и 28 раз соответственно. Наименьшие значения уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 для указанного сортообразца были показаны через 2 и 24 ч после наступления этапа +4 °С, и их значения составили 4 и 6 раз соответственно. Близкие значения наблюдались и через 2 и 24 ч во время этапа +2/-2 °С, где показатели уровня экспрессии данного гена составили 7 и 6 раз соответственно. Анализ уровня экспрессии ге-
на ИуСОЯ14Ъ для указанного сортообразца показал значительные отличия, а также довольно высокие значения уровня его экспрессии на большинстве моделируемых этапов холодо-вого стресса по сравнению с другими исследуемыми сортообразцами. Уже на начальных этапах при +4 °С через 2 и 24 ч уровень экспрессии данного гена достигал 166 и 443 раза соответственно. Самый высокий показатель уровня экспрессии для гена ИуСОЯ14Ъ у сортообразца 9201077 наблюдался после наступления этапа эксперимента -2 °С через 2 ч, где его показатель достиг значения в 1 236 раз. А после перехода на последующий этап при -4 °С через 2 ч уровень экспрессии не наблюдался вовсе. Вероятно, такие различия в уровне экспрессии указанного гена на последних двух этапах моделируемых условий холодового стресса у чувствительного к холоду сортообразца 9201077 и указанных выше устойчивых к холоду по результатам полевых испытаний сортообразцов и сорта Буслик лежат в основе фенотипических отличий исследованных нами образцов по данному признаку.
Таким образом, среди исследованных образцов наибольшее увеличение уровня экспрессии гена ИуСБЕ14 в 69 раз было выявлено для сортообразца 990829 через 2 ч при наступлении условий -4 °С. Наименьшее увеличение уровня экспрессии указанного гена в 4 раза было установлено для сортообразца 990668 через 2 ч при наступлении условий +4 °С. Для гена ИуСОЯ14Ъ наибольшее увеличение уровня его экспрессии было выявлено для сортообразца 9201077 через 2 ч при наступлении условий -2 °С и было равно 1 236 раз,
Рис. 5. Относительный уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ЕуСОЯ14Ъ у сортообразца озимого ячменя 9201077 в моделируемых условиях холодового стресса. На диаграмме представлены средние значения и стандартные отклонения. Уровень экспрессии генов ИуСБ¥14 и ИуСОЯ14Ъ у растений, не подвергающихся холодовому стрессу,
равен 1. Р <0,01 (**) по сравнению с контролем
а наименьшее — для сорта Буслик — через 2 ч при наступлении условий +4 °С в 7 раз. У сортообразца 990829 через 2 и 24 ч после наступления условий +4 °С, через 2 ч после наступления условий -2 и +2/-2 °С, так же как и у сортообразца 9201077 через 2 ч после наступления условий -4 °С, было показано отсутствие экспрессии указанного гена. Из изложенного выше можно сделать вывод о том, что у устойчивых к холоду сортообразцов наблюдается значительное накопление транскрипта гена HvCOR14b после 24 ч воздействия температуры -4 °С, хотя профили экспрессии этого гена могут отличаться в зависимости от генотипа. У исследованных генотипов характерно повышение уровня экспрессии гена HvCBF14 через 2 ч после снижения температуры до -2 °С и после 2 ч воздействия температуры -4 °С, только у сорта Буслик мы можем наблюдать значительное увеличение уровня его экспрессии после 24 ч при -4 °С. Для неустойчивого к холоду генотипа характерны резкие колебания уровня экспрессии гена HvCOR14b. Показано влияние генотипа ячменя на уровень экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b при воздействии холодового стресса.
Следует отметить, что в Республике Беларусь исследования молекулярных основ зимостойкости ячменя ранее не проводились. При этом ранее в зарубежных исследованиях была показана роль генов HvCBF14 и HvCOR14b в ответе данной культуры на воздействие холода. Так, A. Fricano с соавторами было выявлено наличие двух однонуклеотидных замен в гене HvCBF14, приводящих к отличиям по холодоустойчивости в европейских сортах ячменя различного генетического происхождения [14]. Также изучение E. J. Stockinger с соавторами уровня экспрессии различных HvCBF генов и в картирующей популяции ячменя 'Nure' х 'Tremois' выявило большее число транскриптов гена CBF14 в геноме более холодоустойчивого сорта Nure [15]. Увеличение уровня экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b в каллусах и проростках сорта Nure при +4 °С было продемонстрировано в работах I. Vashegyi с соавторами [16]. Z. Jeknic с соавторами было показано увеличение уровня экспрессии гена HvCOR14b у сорта ячменя Golden Promise в ответ на холодовой стресс [17]. В проведенных M. Rapacz с соав-
торами исследованиях было установлено, что у растений, которые характеризовались более низкой морозостойкостью, накопление транскрипта и белка HvCOR14b наблюдалось после 7 и 14 дней холодовой акклиматизации (+2 °С), в то время как индукция экспрессии указанного гена у морозостойких растений наблюдалась в течение первого дня холодовой акклиматизации [18]. Эксперименты, проведенные в указанных исследованиях, проводились на различных генотипах ячменя и в различных условиях, поэтому сравнение представленных в них результатов между собой и с нашими данными в количественном отношении не представляется возможным. C. Campoli с соавторами при изучении экспрессии различных CBF генов у сортов ржи, пшеницы и ячменя при их акклиматизации к различным температурам показали, что экспрессия данных генов зависит от генотипа, времени подвергания растений холодовому стрессу, значения температуры и др. [19].
Заключение
В результате исследования было продемонстрировано влияние холода на значения уровня экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b у устойчивых к холоду по результатам полевых испытаний сорта Буслик, сортообразцов 990829, 990668, 989159, а также чувствительного к холоду сортообразца 9201077. Профили экспрессии гена HvCOR14b были схожи для устойчивых сортообразцов с некоторыми отличиями на определенных этапах моделируемого эксперимента в зависимости от генотипа. Так, основное накопление транскрипта гена HvCOR14b наблюдалось после 24 ч воздействия температурного режима -4 °С. Также для устойчивых сортообразцов мы можем наблюдать значительное увеличение экспрессии данного гена и при наступлении этапа температурного режима +2/-2 °С через 2 ч, за исключением сортообразца 990829. После 24 ч этапа +2/-2 °С наблюдалось снижение уровня экспрессии гена HvCOR14b, однако для сортообразца 989159 было показано увеличение его экспрессии на данном этапе. Уровень экспрессии данного гена у устойчивого сортообразца 990829, в отличие от других исследуемых образцов, был стабильно низким на протяжении практически всего мо-
делируемого эксперимента. Наибольшее увеличение уровня экспрессии гена HvCOR14b у данного сортообразца было показано при наступлении этапа -4 °С после 24 ч. Уровень экспрессии гена HvCOR14b был выше, чем гена HvCBF14. Установлено, что у устойчивых сортообразцов характерно повышение уровня экспрессии гена HvCBF14 на двух этапах моделирования холодового стресса: через 2 ч после снижения температуры до -2 °С и после 2 ч воздействия температуры -4 °С. Только у сорта Буслик мы можем наблюдать значительное увеличение уровня экспрессии гена HvCBF14 после 24 ч при -4 °С. Профиль экспрессии гена HvCOR14b чувствительного к холоду по результатам полевых испытаний сортообразца 9201077 отличался от устойчивых и показал значительные колебания уровня его экспрессии. Уровень экспрессии гена HvCBF14 у данного сортообразца был также стабильно низким на протяжении всех этапов моделируемого эксперимента.
Таким образом, проведенное исследование показывает, что генотип ячменя значительно влияет на уровень экспрессии генов HvCBF14 и HvCOR14b на протяжении всех этапов моделирования холодового стресса.
Список использованных источников
1. Barley: a translational model for adaptation to climate change / I. K. Dawson [et al.] // New Phytol. - 2015. - Vol. 206, № 3. - P. 913-931.
2. Cold conditioned: discovery of novel alleles for low-temperature tolerance in the Vavilov barley collection / A. H. Sallam [et al.] // Front Plant Sci. - 2021. - Vol. 12. - P. 1-16.
3. Genetics of barley tiller and leaf development / S. Shaaf [et al.] // Journal of Integrative Plant Biology. - 2019. - Vol. 61, № 3. - P. 226-256.
4. Genetic resources and precise gene editing for targeted improvement of barley abiotic stress tolerance / S. Karunarathne [et al.] // J Zhejiang Univ Sci B. - 2023. - Vol. 24, № 12. - P. 1 069-1 092.
5. Сельское хозяйство Республики Беларусь: Статистический буклет / Национальный статистический комитет Республики Беларусь, Государственный комитет по имуществу Республики Беларусь; редкол.: И. В. Медведева [и др.]. - Минск: Информационно-вычислительный центр Национального статистического комитета республики Беларусь. - 2024. - 36 с.
6. The Triticeae CBF gene cluster — to frost resistance and beyond / G. Caccialupi [et al.] // Cells. - 2023. - Vol. 12, № 2 606. - P. 1-28.
7. Low temperature tolerance is depressed in wild-type and abscisic acid-deficient mutant barley grown in Cd-contaminated soil / L. Liu [et al.] // Journal of Hazardous Materials. - 2022.
- Vol. 430. - P. 128489.
8. ICE-CBF-COR signaling cascade and its regulation in plants responding to cold stress / D. Hwarari [et al.] // Int J Mol Sci. - 2022. -Vol. 23, № 1 549. - P. 2-20.
9. The barley Frost resistance-H2 locus / M. Pasquariello [et al.] // Funct. Integr. Genom.
- 2014. - Vol. 14, № 1. - P. 85-100.
10. Extensive allele mining discovers novel genetic diversity in the loci controlling frost tolerance in barley / D. Guerra [et al.] // Theor Appl Genet. - 2022. - Vol. 135. - P. 553-569.
11. The cold response of CBF genes in barley is regulated by distinct signaling mechanisms / Z. Marozsan-Toth [et al.] // Journal of Plant Physiology. - 2015. - Vol. 181. - P. 42-49.
12. Экспрессия генов TaDHN9-A, TaDHN13 и TaDHN20 у сортов яровой пшеницы в ответ на засуху / А. Н. Заинчковская [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - 2023. - Т. 35. - С. 27-34.
13. Заинчковская, А. Н. Изучение уровня экспрессии генов HvGT-8, HvGT-10 и HvGT-42 у сортов озимого ячменя в моделируемых условиях холодового стресса / А. Н. Заинчковская, Е. А. Фомина, О. Ю. Урбанович // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - 2024. - Т. 36. - С. 43-51.
14. Genetic variants of HvCbf14 are statistically associated with frost tolerance in a European germplasm collection of Hordeum vulgare / A. Fricano [et al.] // Theor Appl Genet. - 2009.
- Vol. 119. - P. 1 335-1 348.
15. Expression levels of barley Cbf genes at the Frost resistance-H2 locus are dependent upon alleles at Fr-H1 and Fr-H2 / E. J. Stockinger [et al.] // Plant J. - 2007. - Vol. 51. - P. 308-321.
16. Cold response of dedifferentiated barley cells at the gene expression, hormone composition, and freezing tolerance levels: studies on
callus cultures / I. Vashegyi [et al.] // Mol Bio-technol. - 2013. - Vol. 54, № 2. - P. 337-349.
17. Hv-CBF2A overexpression in barley accelerates COR gene transcript accumulation and acquisition of freezing tolerance during cold acclimation / Z. Jeknic' [et al.] // Plant Mol Biol. -2014. - Vol. 84, № 1-2. - P. 67-82.
18. The effects of cold acclimation on photo-synthetic apparatus and the expression of COR14b
in four genotypes of barley (Hordeum vulgare) contrasting in their tolerance to freezing and high-light treatment in cold conditions / M. Ra-pacz [et al.] // Ann Bot. - 2008. - Vol. 101, № 5. - P. 689-699.
19. Comparative expression of Cbf genes in the Triticeae under different acclimation induction temperatures / C. Campoli [et al.] // Mol. Genet. Genom. - 2009. - Vol. 282, № 2. - P. 141-152.
A. N. Zainchkovskaya1, A. A. Famina1, A. V. Yaroshevich2, A. A. Zubkovich2, O. Yu. Urbanovich1
STUDY OF THE EFFECT OF COLD STRESS ON THE EXPRESSION LEVEL OF THE HvCBF14 AND HvCOR14b GENES IN WINTER BARLEY VARIETY SAMPLES UNDER SIMULATED CONDITIONS
1 State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 34 F. Skorina St., 220141 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: [email protected] ^Republican Unitary Enterprise "Research and Practical Center of National Academy of Sciences of the
Republic of Belarus for Arable Farming" 1 Timiriyazev St., 222160 Zhodino, the Republic of Belarus
A change in the expression level of the HvCBF14 and HvCOR14b genes was studied by RT-PCR under cold stress conditions in the cold-resistant variety Buslik; variety samples 990829, 990668 and 989159; and the cold-sensitive variety sample 9201077. The greatest increase in the expression level of the HvCBF14 gene by 69 times was revealed for the variety sample 990829 in 2 hours under conditions reaching -4 °С. The smallest increase in the expression level of this gene by 4 times was established for the variety sample 990668 in 2 hours under conditions reaching +4 °С. For the HvCOR14b gene, the greatest increase in its expression level was found for the 9201077 variety sample in 2 hours under conditions reaching -2 °С (by 1 236 times) and the smallest — for the Buslik variety in 2 hours under conditions reaching +4 °С (by 7 times). The effect of the barley genotype on the expression level of the HvCBF14 and HvCOR14b genes under cold stress was shown. An increase in the expression of these genes was noted after the onset of -4 °С conditions in the cold-resistant samples. The expression level of the HvCBF14 gene is generally lower than that of HvCOR14b.
Keywords: abiotic stress, transcription factors, winter barley, HvCBF14 gene, HvCOR14b gene, cold stress.
Дата поступления в редакцию: 06 сентября 2024 г.