CC BY
107
УДК 581.1
раздел БИОЛОГИЯ
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЛЕГГЕМОГЛОБИНА А СОИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАПСА К КАДМИЮ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ «БОРОДАТЫХ» КОРНЕЙ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
© М. Ю. Дмитрюкова1*, А. Х. Баймиев2, В. В. Федяев1, З. Ф. Рахманкулова3
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкорстостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
E-mail: [email protected] 2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 61 00.
3Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН Россия, 127276 г. Москва, ул. Ботаническая, 35.
Тел.: +7 (499) 977 80 22.
E-mail: [email protected]
Для изучения влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на устойчивость рапса к токсическому воздействию кадмия в качестве модельной системы были созданы композитные растения, состоящие из трансгенныгх «бородатыых» корней и нетрансгенной надземной части. Быгло показано тормозящее действие экспрессии гена леггемоглобина A сои на рост трансгенныгх «бо-родатыгх» корней. Вместе с тем, при наличии в среде солей кадмия в токсических концентрациях экспрессия гена способствовала повыгшению устойчивости растения к тяжелому металлу и препятствовала накоплению кадмия в тканях корня и надземной части. Таким образом, показана возможность использования трансгенныгх «бородатыых» корней в качестве модельной системыг для изучения влияния экспрессии чужеродныгх генов.
Ключевые слова: кадмий, леггемоглобин, «бородатыге» корни.
Введение
Рапс (Brassica napus var. napus L.) является ценной и перспективной сельскохозяйственной культурой. Рапс широко используется в кормовых целях, производстве биодизеля, для предотвращения почвенной эрозии [1].
Для создания трансгенных растений, в том числе рапса, обычно используются бактерии рода Agrobacterium. Чаще всего в этих целях применяются штаммы А. tumefaciens, в природе приводящие к образованию корончатого галла. Штаммы
A. rhizogenes, вызывающие формирование «бородатых» корней используются гораздо реже, поскольку растения, регенирированные из такой ткани, часто морфологически изменены из-за встраивания в геном локуса rol. Однако, благодаря генетической стабильности, высокой скорости роста и простоте получения, культура «бородатых» корней часто рассматривается как перспективный метод получения вторичных метаболитов растений [2, 3]. Кроме того, трансгенные «бородатые» корни могут быть успешно использованы в качестве модели для проведения экспериментов по изучению влияния экспрессии чужеродных генов на отзывчивость корневой системы растений к воздействию биотических и абиотических факторов окружающей среды, таких, как загрязнение ризосферы тяжелыми металлами [4].
Повреждающее действие тяжелых металлов разнообразно и связано с замещением ионов металлов в функциональных группах металлсодержащих ферментов, взаимодействием с SH-группами белков и т.д. [5].
К одним из наиболее опасных поллютантов относится кадмий. Не являясь
элементом, участвующим в нормальном метаболизме растений, он вызывает токсический эффект в небольших концентрациях [6].
В настоящее время известны несколько конститутивных механизмов устойчивости к тяжелым металлам (белки теплового шока, лиганды, фитохе-латины, металлотионеины и др.), позволяющих растениям аккумулировать токсичные элементы в метаболически инертных органах и органеллах или включать их в хелаты и тем самым переводить в физиологически безопасные формы [7].
Особое внимание при создании растений, устойчивых к тяжелым металлам, уделяется фитохела-тинам. Однако из-за недостаточной прочности комплексов фитохелатинов с металлами и специфичности их образования, эти соединения не всегда играют существенной роли в детоксикации тяжелых металлов [7]. Поэтому поиск способов повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к тяжелым металлам является актуальной задачей.
Леггемоглобин (легоглобин, Лг) - миоглобин-подобный кислородпереносящий гемопротеид, синтезирующийся в клубеньках бобовых растений при формировании симбиоза. Он является одним из регуляторов кислородного режима, поддерживая условия, оптимальные для процесса фиксации азота [8]. Лг способен реагировать с активными формами кислорода (АФК) и азота, проявляя анти- или про-оксидантные свойства [9], то есть участвовать в защите от окислительного нитрозативного стресса [10]. Кроме симбиотических, в растениях присутствуют
* автор, ответственный за переписку
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2011. Т. 16. №3
699
так же несимбиотические гемоглобины (Гб), являющиеся в большинстве своем стресс-индуцируемыми белками [11]. Исходя из этого, представляет интерес изучение влияния симбиотического Гб на метаболизм растения в стрессовых условиях.
Цель данной работы - исследование влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на устойчивость рапса к повреждающему действию тяжелых металлов, с использованием растений, несущих трансгенные «бородатые» корни, в качестве модельной системы.
Методика исследования
Объектом исследования в данной работе служили растения рапса (Brassica napus var. napus) сорта Hanna, на которых были получены трансгенные «бородатые» корни.
В экспериментах был использован бинарный вектор pCAMBIA 1301 любезно предоставленный фирмой “Cambia” (Австралия)
(http://www.cambia.org.au). Данный вектор, способный реплицироваться в клетках и E. coli, и Agrobacterium sp., содержит в области Т-ДНК ре-портерный ген gus с каталазным интроном, ответственный за расщепление P-D-глюкуронидов, и селективный ген hptII гигромицинфосфотрансфера-зы, придающей устойчивость к гигромицину.
Ген леггемоглобина А сои (lba), лишенный интронов, был получен из лаборатории А.Ф. Топу-нова (Институт им. Баха, г. Москва) в составе плазмиды pEMBL 18+. Амплификат гена Лг сои был наработан в ходе полимеразной цепной реакции с использованием Pfu-полимеразы и праймеров: прямого for - TATGGTTGCTTTCACTGAGA, и обратного rev - GATACTAATTATGCCTTCTT. Полученная последовательность ДНК имела длину 448 нуклеотидов.
Затем ген Лг был встроен в плазмиду pCambia 1301 под управление 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Правильность ориентации последовательности по отношению к промотору проводили полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием прямого праймера, комплементарного к последовательности 35S кассеты, и обратного праймера rev, которым ампли-фицировали ген Лг А сои. Полученная конструкция была перенесена электропорацией в клетки Agrobacterium rhizogenes штамма 15834, несущие Ri плазмиду дикого типа. Электропорацию компетентных клеток A. rhizogenes проводили при помощи электропоратора модели MicroPulser (BioRad, США).
Для получения «бородатых» корней была использована двухсуточная культура A. rhizogenes 15834, выращенная на среде TY (дрожжевой экстракт - 0.1%, бакто-триптон - 1%, CaCl2 - 0.1%), с добавлением 100 мг/л канамицина и 200 мкМ аце-тосирингона в качестве стимулятора агробактерий, при 28 °С на шейкере (150 об/мин).
Перед инокуляцией культуру агробактерий центрифугировали (3500 об/мин, 10 мин) и ресус-пендировали в жидкой среде TY. Плотность суспензии агробактерий была доведена до 108 КОЭ/мл с использованием спектрофотометра СФ-46.
Поверхность семян рапса сорта Hanna стерилизовали в течение 1 мин в 70% спирте и затем 20 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с добавлением нескольких капель Tween-20. После пятикратной промывки стерильной водой семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге. Затем двухдневные проростки были пересажены на агровермикулит, насыщенный 1% раствором Хог-ланда-Арнона.
Недельные проростки растений инокулирова-ли суспензией A. rhizogenes 15834 с помощью инсулинового шприца, делая укол в зоне гипокотиля. Для повышения эффективности инокуляции растения содержали в условиях высокой влажности.
Гистохимический анализ трансформированных тканей проводили по методу, описанному Jefferson [12] с небольшими модификациями [13]. В течение ночи отрезанные части «бородатых» корней инкубировали при 37 °С в реактиве X-Gluc (1 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-0-глюкоро-нид; 0.5% тритон X-100; 100 мМ №2ЭДТА; 20% метанол; 0.5 мМ K3Fe(CN)6; 0.5 мМ K4Fe(CN)6; 50 мМ натриевый фосфатный буфер (pH 7.0).
Для проведения ПЦР - анализа ДНК из «бородатых» корней была выделена солевой экстракцией по методу Aljanabi [14]. Выделение тотальной РНК и проведение ревертазной реакции осуществляли с использованием наборов TRizol Reagents (“Invitrogen”, США) и GenePak RT Core НПФ («Га-ларт-Диагностикум», Россия).
Затем у проростков, в трансформированных корнях которых была обнаружена экспрессия гена Лг, были удалены настоящие корни, и растения перенесены на водную среду, содержащую 1% раствор Хогланда-Арнона.
В качестве контроля были использованы растения рапса, несущие нетрансгенные «бородатые» корни.
Для проведения исследования влияния ионов тяжелых металлов на рост трансгенного корня, в раствор был добавлен ацетат кадмия до конечной концентрации 0,25 мг/л (1/2 ПДК). Удлинение корня измерялось в течение трех суток. После этого было измерено содержание кадмия в тканях корня на вольтамперометрическом анализаторе Экотест-ВА (Росиия).
Расчет погрешностей производился при помощи описательной статистики из пакета анализа данных Microsoft Office Excel 2003.
Результаты и их обсуждение
Через 2 недели после введения суспензии A. rhizogenes 15834 в гипокотили проростков рапса на месте поранения у 25% растений появлялись «бородатые» корни. Для контроля использовали растения, проколотые инсулиновым шприцом со
стерильной средой ТУ. В этом случае появления «бородатых корней» не наблюдали.
Трансгенная природа корней была подтверждена активностью ОИ8-гена у 30% растений, «бородатые» корни которых были получены с помощью штамма A. rhizogenes 15834, трансформированного рСАМВ1А1301 - ^. ПЦР анализ ДНК из этих корней показал присутствие гена Лг. Кроме того, синтез мРНК с целевого гена был подтвержден проведением ОТ-ПЦР (с использованием обратной транскриптазы) на РНК, выделенной из трансгенных корней. В качестве контроля использовали «бородатые корни», полученные с помощью исходного штамма A. rhizogenes 15834. Гистохимический и ПЦР анализы в этом случае дали отрицательный результат.
Для изучения влияния экспрессии гена Лг А сои на рост «бородатых» корней, измеряли их удлинение в течение трех суток. Рост в длину у трансгенных корней было ниже, чем у нетрансгенных в 1.5 раза (рис. 1). Кроме того, у трансгенных корней наблюдалось подавление формирования боковых корней. Их количество, приходящееся на единицу длины основного корня, составило для нетрансгенных 0. 49 ± 0.05 штук, трансгенных - 0.31 ± 0.01 штук, то есть снизилось в 1.6 раза. При этом формирование корневых волосков на трансгенных «бородатых» корнях не отличалось от контрольных образцов.
Торможение роста трансгенных корней может быть объяснено нарушением передачи сигнала N0 в результате образования нитрозильных комплексов с легоглобином. Лг, как и другие представители семейства гемоглобинов, обладают сродством не только к кислороду, но и другим лигандам, в том числе и оксиду азота (II) [9]. Известно, что N0 вызывает формирование боковых корней через индукцию гена cycd3;l (циклин) и ингибирование гена cdk (циклин - зависимая киназа) на начальных стадиях формирования примордия бокового корешка [15].
При внесении солей кадмия наблюдалось ингибирование удлинения корней у трансгенных и нетрансгенных образцов. Скорость роста нетранс-генных корней при внесении солей кадмия снизилась в 4.6 раз, трансгенных - в 1.6 раза. Таким образом, трансгенные «бородатые» корни проявляли большую устойчивость к стрессу, вызванному внесением солей кадмия.
Известно, что большинство видов растений накапливают тяжелые металлы в основном в корневой системе [5]. Нами было изучено содержание кадмия в надземных и подземных органах модель-
Рис. 1. Скорость роста трансгенных и нетрансгенных «бородатых» корней после внесения ацетата кадмия до концентрации 2.5 мг/л. I - без внесения солей кадмия, II -после внесения солей кадмия.
ных растений. В корнях, несущих ген леггемогло-бина, накапливалось значительно меньшее количество кадмия (в 1,6 раза) (табл.). Содержание кадмия в надземной сфере так же было гораздо ниже у растений, несущих трансгенные «бородатые» корни. Так, в листьях и стеблях у образцов с трансгенными корнями кадмия накапливалось в 18.5 и 10.8 раз меньше, соответственно.
Как указывалось выше, трансгенные по гену леггемоглобина А сои «бородатые» корни имеют измененную морфологию. Можно предположить, что подавление образования боковых корней ведет к уменьшению площади поглощения корня. Такая особенность, в нормальных условиях вызывает снижение выживаемости растения, однако в условиях загрязнения почвы, вероятно, дает преимущество.
Заключение
Нами было показано, что экспрессия гена лег-гемоглобина А сои уменьшает накопление кадмия и повышает устойчивость к тяжелому металлу у растений, несущих трансгенные «бородатые» корни. Вместе с тем, для трансгенных «бородатых» корней характерна измененная морфология.
«Бородатые» корни могут найти широкое применение на первых этапах изучения экспрессии того или иного гена. Поскольку получение полно -ценных трансгенных растений связано с множеством трудностей, и не всегда ведет к положительным результатам, такой быстрый и недорогой способ может позволить отбирать наиболее подходящие продукты экспрессии генов для решения той или иной проблемы.
Таблица
Содержание кадмия в растениях, несущих нетрансгенные и трансгенные «бородатые» корни, мг/кг сухой массы
Органы растения
Нетрансгенные растения
Трансгенные растения
Корень
Лист
Стебель
13.7 ± 1.5 3.9 ± 0.5 2.6 ± 0.3
7.9 ± 0.3 0.21 ± 0.1 0.24 ± 0.1
ЛИТЕРАТУРА
1. Никифоров О. А. Рапс ценная и перспективная культура// Сельскохозяйственный вестник. 2004. №2. С. 15-16.
2. Радчук В. В., Блюм Я. Б. Успехи и проблемы генетической трансформации растений семейства крестоцветных // Цитология и генетика. 2005. №3. С. 13-29.
3. Sevon N., Drager B., Hiltunen R. and Oksman-Caldentey K.-M. Characterization of transgenic plants derived from hairy roots of Hyoscyamus muticus // Plant Cell Rep. 1997. V. 16. P. 605-611.
4. Вершинина З. Р., Баймиев А. Х., Чемерис А. В. Симбиотические реакции корней облепихи, трансгенных по гену лектина гороха посевного // Физиология растений. 2010. Т.57. С. 108-116.
5. Серегин И. В., Иванов В. Б. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения (обзор) // Физиология растений. 2001. Т.48. №3. C. 461-485.
6. Hatata M. M., Abdel-Aal E. A. Oxidative stress and antioxidant defense mechanism in response to cadmium treatments//American-Eurasian J. Agric & Environ. Sci. 2008. V.4. P. 655-669.
7. Серегин И. В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений // Успехи биологической химии. 2001. Т.41. С. 283-300.
8. Топунов А. Ф. Легоглобин и его роль в регуляции кислородного режима в азотфиксирующих клубеньках бобовых // Биохимия. 1995. Т.60. С. 66-74.
9. Космачевская О. В., Топунов А. Ф. Гемоглобины - разнообразие структур и функций // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т.45. C. 627-653.
10. Baudouin E., Pieuchot L., Engler G., Pauly N., Puppo A.
Nitric oxide is formed in Medicago truncatula -
Sinorhizobium meliloti functional nodules // Mol. Microbe-Plant Interact. 2006. V.19. P. 970-975.
11. Dordas C. Nonsymbiotic hemoglobins and stress tolerance in plants//Plant Sci. 2009.V.176. P. 433-460.
12. Jefferson R.A Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene
Fusion System // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. V.5. P. 387-405.
13. Kosugi S., Ohashi Y., Nakajima K., Arai Y. An Improved Assay for p-Glucuronidase in Transformed Cells: Methanol Almost Completely Suppresses a Putative Endogenous p -Glucuronidase Activity // Plant Sci. 1990. V.70. P. 133-140.
14. Aljanabi S. M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nuc. Acids Res. 1997. V. 25. №22. Р. 4692-4693.
15. Pagnussat G. C., Simontacchi M., Puntarulo S. and Lamattina L. Nitric Oxide is required for root organogenesis // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 954-956.
Поступила в редакцию 25.03.2011 г.
