CC BY
35
2
НОМЕР
ISSN 2304-9081
Электронный журнал
On-line версия журнала на сайте
http://www.elmag.uran.ru
БЮЛЛЕТЕНЬ
ОРЕНБУРГСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН
2016
УЧРЕДИТЕЛИ
УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН ОРЕНБУРГСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 © Е.А. Щуплова, С.Б. Фадеев, 2016 УДК 617-022:616-018:576.851 Е.А. Щуплова, С.Б. Фадеев
ИЗУЧЕНИЕ ВИДОВОГО СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ ОЧАГОВ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗНЫХ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
Цель. Изучить видовой состав микрофлоры очагов гнойно-воспалительных процессов с помощью стандартных бактериологических методов исследования и с использованием метагеномного анализа.
Материалы и методы. В исследовании использовали бактериологический метод и метагеномный анализ патологического материала, полученного от больных с гнойными ранами.
Результаты. С использованием бактериологического метода установлено, что чаще из очагов гнойно-воспалительных процессов высевался S. aureus, а при метагеномном анализе патологического материала обнаружено преобладание ДНК представителей семейств Clostridiaceae и Enterobactericeae.
Заключение. Использование стандартного бактериологического подхода и метаге-номного секвенирования позволяет более полно охарактеризовать видовой состав микрофлоры очагов гнойно-воспалительных процессов.
Ключевые слова: бактериологический метод, метагеномный анализ, микрофлора очагов гнойно-воспалительных заболеваний.
E.A. Shchuplova, S.B. Fadeev
THE STUDY OF SPECIES COMPOSITION OF MICROFLORA FOCAL INFLAMMATORY PROCESSES USING DIFFERENT METHODOLOGICAL APPROACHES
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg, Russia
Objective. The study of species composition of microflora focal of inflammatory processes using standard bacteriological methods of research and the use of metagenomic analysis.
Materials and methods. The study used the bacteriological method and metagenomic analysis of pathological material obtained by for patients with purulent wounds.
Results. Using a bacteriological method found that most of the centers of inflammatory processes seeded S.aureus, and in metagenomic analysis of the prevalence of pathological material found DNA representatives Clostridiaceae and Enterobactericeae families.
Conclusion. Using the standard bacteriological and metagenomic sequencing approach allows for a more complete characterization of the species composition of microflora foci of inflammatory processes.
Keywords: bacteriological method, metagenomic analysis, microflora foci of inflammatory diseases.
Введение
Хирургические инфекции занимают одно из значимых мест в структуре инфекционно-воспалительной патологии [1]. Оценивая спектр возбудителей хирургической инфекции, нельзя ни отметить, что последние этиологически нередко являются полимикробными [2]. Доля микробных ассоциаций при гнойно-септических инфекциях составляет от 12 до 96%, а сами ассоциации микроорганизмов в гнойном очаге могут включать до 14 видов бактерий [3]. Симбиотические взаимоотношения в бактериальных ассоциациях могут приводить к усилению патогенного и персистентного потенциалов бактериальных агентов, что может отражаться в изменении клиники заболевания (более тяжелое и осложненное его течение) и снижении эффективности проводимой антибактериальной терапии [4].
Существующие бактериологические методы выделения чистых культур микроорганизмов в сумме позволяют определить лишь небольшую долю от общего состава микробиоты, а выявление всех генов бактерий-ассоциантов, находящихся в очаге гнойно-воспалителительной инфекции, возможно лишь при использовании современных генетических методов исследования.
Цель данной работы - изучить видовой состав микрофлоры очагов гнойно-воспалительных процессов с помощью стандартных бактериологических методов исследования и с использованием метагеномного анализа.
Материалы и методы
Материал для бактериологического и генетического исследований брали у больных с гнойными ранами при поступлении в отделение гнойно -септической хирургии 1 -й муниципальной городской клинической больницы скорой помощи г. Оренбурга. Забор патологического материала (гной, некротические ткани) со дна раны производили в асептических условиях (использовали аспирационный способ или взятие биоптата), после чего высевали на 5% кровяной агар. Посевы инкубировали при 37°С в течение 24-48 ч, затем у выделенных чистых культур микроорганизмов изучали морфологию с помощью окраски мазков по Граму [5], а для определения видовой принадлежности бактерий использовали диагностические биохимические тест-системы М1кгоЬаТев1 ("ЬасЬеша", Чехия).
Генетическое исследование патологического материала проводили на базе Центра коллективного пользования «Персистенция микроорганизмов» в
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 ИКВС УрО РАН. Из исследуемых проб, взятых от больных с гнойными ранами и флегмонозной формы рожи голени выделяли ДНК по следующей методики. К 100 мкл исследуемого образца (гной) добавляли 500 мкл лизирую-щего TES буфера и 10 мкл протеиназы К, затем инкубировали при 60°С в течение 30 мин. После инкубации в исследуемые пробы вносили 100 мкл 10% раствора SDS и вновь инкубировали при 65°С в течение 15 мин. Затем к образцам добавляли 800 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) вручную встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали (14 500 об/мин в течение 5 мин). Далее к надосадочной жидкости добавляли 350 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1) и при таком же режиме центрифугировали. Затем в надосадочную жидкость вносили 30 мкл ацетата аммония и 450 мкл холодного абсолютного спирта. Исследуемые образцы ДНК оставляли в холодильнике при -20°С в течение 10 ч. После этого пробы промывали три раза холодным 70%-ным этанолом при 4°С в течение 10 мин, подсушивали выделенные ДНК и добавляли 30 мкл воды Milli-Q. Для выявления бактериального разнообразия различных сообществ в исследуемых образцах проводили метагеномное секвенирование выделенных ДНК по 16S рибосоме с помощью секвенатора II-поколения MiSeq (Illumina, США).
Полученные результаты при бактериологическом методе исследования статистически обрабатывали с вычислением средней арифметической ошибки в процентном соотношении от общего числа исследуемых штаммов [6]. При метагеномном секвенировании каждая полученная последовательность была идентифицирована путем сравнения с последовательностями баз данных GenBank и Rdp с использованием алгоритмов BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide) поиска и попарного сравнения. Полученные последовательности выравнивали и проводили кластерный анализ с помощью программы USEARCH v8.0.1623_win32,-cluster_otus command. В каждом образце при кластерном анализе было выделено в среднем 110 OTU (Operational taxonomic unit - операционная таксономическая единица), в расчетах учитывали size>5 и статистически обрабатывали в процентном соотношении от общих значений size.
Результаты и обсуждение
Бактериологическим методом было выделено 90 штаммов микроорганизмов. Видовой состав возбудителей очагов гнойно-воспалительных про-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 цессов представлен в таблице.
Таблица. Видовой состав возбудителей очагов гнойно-воспалительных заболеваний, выделенных бактериологическим методом
Вид возбудителя Частота встречаемости (%)
Staphylococcus aureus 50,3
S. intermedius 10,3
S. epidermidis 8,5
S. haemolyticus 3,7
S. hominis 1,8
Streptococcus pyogenes 14,8
S. mutans 2,5
S. agalactiae 0,7
Escherichia coli 3,8
Proteus mirabilis 1,4
Klebsiella pneumoniae 0,5
Pseudomonas aeruginosa 1,65
Acinetobacter baumanii 0,1
Candida albicans 0,25
По этим данным видно, что чаще всего из очагов хирургической инфекции выделялись коагулазопозитивные стафилококки (60,6%), преимущественно Staphylococcus aureus. Коагулазонегативные стафилококки (S. epidermidis, S. haemolyticus и др.) составили 14% от всего спектра возбудителей. Стрептококки по частоте выявления заняли второе место (18%), среди них доминировал Streptococcus pyogenes. Роль представителей семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Providencia spp., Proteus spp. и др.) была менее заметна - всего 5,7%. При изучении исследуемых образцов были обнаружены грибы рода Candida, в основном, вид Candida albicans, что составило 0,25% от всего пула возбудителей.
В результате метагеномного секвенирования по 16S рибосоме произведенного на секвенаторе II-поколения MiSeq (Illumina, США) в исследуемых образцах, полученных от больных с гнойными ранами, обнаружили ДНК 15 видов различных микроорганизмов (рис. 1). Причем в 97,5% случаев были выделены ДНК облигатных анаэробов - представителей семейства
4
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 Clostridiaceae. В большом количестве в 82,1% обнаружили ДНК C. perfringens, ДНК C. sordeШ выявили в 9,35% случая от всех количеств ДНК микроорганизмов, а ДНК С. baratii обнаружена в 5,6% случаев.
Рис. 1. Спектр возбудителей очага гнойной раны.
Необходимо отметить, что высокий процент (1,85) прибор выдал значения ДНК человека. В 0,52% случаев были обнаружены ДНК некультиви-руемых форм микроорганизмов. Остальные ДНК микроорганизмов обнаружены в диапазоне от 0,1% (С sphenoides) до 0,02% caprae).
Выявление клостридиальной микрофлоры в очагах гнойных ран при клинической картине, не характерной для анаэробной хирургической инфекции, по-видимому, может указывать на роль C. perfringens и других анаэробов в инициации гнойно-воспалительного процесса без развития клиники газовой гангрены. Последнее может быть связано с подавлением клостридий другими, прежде всего аэробными патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Ведущая роль анаэробных микроорганизмов, которые не обнаруживались классическими бактериологическими методами, была показана при деструктивном аппендиците и перитоните [7].
При метагеномном анализе пробы, полученной от больного с флегмо-нозной формой рожи голени было выделено ДНК 9 различных микроорганизмов (рис. 2). В данном образце обнаружили преобладание ДНК факультативно-анаэробных микроорганизмов семейства Enterobactericeae, что составило 93,64% от всего спектра возбудителей очага инфекции. Первостепенное
■ C.perfringens
■ С sordellii
С baratii
■ Human DNA
I Некультнвируемые формы
C.sphenoides
место занял вид E. coli, удельный вес которого составил 93,4 %.
■ Escherichia coli
■ Enterococcus Гассаlis
Human DNA
■ Morganella morganii
■ Carnobacterium divergens
Klebsiella pneumoniae
Рис. 2. Спектр возбудителей очага флегмонозной формы рожи голени.
На втором месте оказался вид - Enterococcus faecalis, что составило 5,55% от всего спектра ДНК возбудителей очага инфекции. Также как и в первом образце, но меньше в 3 раза, пришлось на долю ДНК человека (0,64%). Необходимо отметить, что 0,18% пришлось на долю ДНК Morganella morganii. Удельный вес ДНК остальных видов, в том числе и не-культивируемые формы бактерий, был низким: от 0,08% (Carnobacterium divergens) до 0,02% (S.warneri) от всего спектра ДНК возбудителей очага инфекции.
Обнаружение энтеробактерий и энтерококков при обследовании пациентов с осложненными формами рожистого воспаления, вероятно, свидетельствует о вытеснении этими микроорганизмами инициирующей стрептококковой микрофлоры, что было ранее показано при динамическом бактериологическом обследовании больных с этой патологией [4].
Заключение
Используемые лабораторные микробиологические методы исследования пока не позволяют изолировать и изучить все бактерии, находящиеся в очаге хирургической инфекции. Основной причиной ограниченных возможностей стандартных бактериологических методов следует считать широкое распространение пока некультивируемых форм бактерий. Чаще всего такие бактерии дают рост при совместном выращивании в составе смешанных со-
обществ, где бактерии предоставляют друг другу определенные факторы, без которых каждые по отдельности расти неспособны [8].
Полученные результаты исследования показали, что с использованием бактериологического метода из очагов гнойно-воспалительных процессов чаще высевался S. aureus. При метагеномном анализе исследуемых проб было обнаружено разнообразие видов микроорганизмов, способных вызывать гнойно-воспалительные процессы, в том числе и некультивируемые формы бактерий. Но среди выявленных генов микроорганизмов преобладали ДНК представителей семейств Clostridiaceae и Enterobactericeae. С одной стороны, идентификация возбудителей очагов гнойно-воспалительных процессов с использованием генетического метода, по сравнению с бактериологическим, сокращается в длительности обработки результатов, а прибор выдает гораздо большее количество (разнообразие) видов микроорганизмов и их ассоциаций. Но, с другой стороны, 100% идентификацию всех возбудителей очагов гнойно-воспалительных процессов прибор не обеспечивает, так как остается часть неизвестных (некультивируемых) форм бактерий.
Таким образом, полученные результаты указывают на перспективы разработок новых диагностических алгоритмов при идентификации микроорганизмов, а также подходов к изучению межмикробных взаимоотношений бак-терий-ассоциантов, включая некультивируемые формы микроорганизмов, в очагах гнойно-воспалительных процессах, что может быть использовано для совершенствования схем профилактики и лечения хирургических инфекций.
(Благодарность. Авторы выражают благодарность и искреннюю признательность сотрудникам и заведующему Центром коллективного пользования «Персистенция микроорганизмов» в ИКВС УрО РАН к.м.н. Плотникову А.О., а также д.т.н. Хлопко Ю.А. за помощь в проведении метагеномного анализа патологического материала.)
ЛИТЕРАТУРА
1. Хирургические инфекции кожи и мягких тканей. Российские национальные рекомендации / Под ред. В.С. Савельева. - М.: БОРГЕС, 2009. 91 с.
2. Bowler P.G., Duerden B.I., Armstrong D.G. Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin. Microbiol. Rev. 2001. 14(2).: 244-269.
3. Митрофанова Н. Н., Мельников В. Л. Особенности микробных ассоциаций при гнойно-септических инфекциях в отделении раневой инфекции многопрофильного стационара. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2013. 3 (27).: 154-163.
4. Тарасенко В.С., Фадеев С.Б., Бухарин О.В. Хирургическая инфекция мягких тканей (клинико-микробиологический аспект). Екатеринбург: УрО РАН, 2015. 180 с.
5. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. М: Медицина, 1989. 464 с.
6. Ланг Т.А., Сесик М. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов / Пер. с англ. под ред. В.П. Леонова.- М.: Практическая медицина, 2011.
7. Бойко Н.Б., Осипов Г.А., Белобородова Н.В., Курчавов В.А. Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и перитонеальном экссудате брюшной полости при гангренозно-перфоративном аппендиците. Инфекции в хирургии. 2009. 2.: 58-62.
8. Тец Г.В., Тец В.В., Ворошилова Т.М. Оценка микробного состава мокроты при вне-больничной пневмонии. Практическая пульмонология. 2015. 2: 62-64.
Поступила 06.05.2016
(Контактная информация: Щуплова Елена Алексеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11; тел. 8 (3532) 77-54-17, e-mail: Khanina83@yandex.ru)
LITERATURA
1. Hirurgicheskie infekcii kozhi i mjagkih tkanej. Rossijskie nacional'nye rekomendacii / Pod red. V.S. Savel'eva. - M.: BORGES, 2009. 91 s.
2. Bowler P.G., Duerden B.I., Armstrong D.G. Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin. Microbiol. Rev. 2001. 14(2).: 244-269.
3. Mitrofanova N.N., Mel'nikov V.L. Osobennosti microbnyh associacij pri gnojno-septicheskih infekcijah v otdelenii ranevoj infekcii mnogoprofil'nogo stacionara. Izvestija vysshih uchebnyh zavedenij. Povolzhskij region. Medicinskie nauki. 2013.3 (27).: 154-163.
4. Tarasenko V.S., Fadeev S.B., Buharin O.V. Hirurgicheskaja infekcija mjagkih tkanej (kliniko-mikrobiologicheskij aspekt). Ekaterinburg: UrO RAN, 2015. 180 s.
5. Spravochnik po mikrobiologicheskim i virusologicheskim metodam issledovanija / Pod red. M O. Birgera. M: Medicina, 1989. 464 s.
6. Lang T.A., Sesik M. Kak opisyvat' statistiku v medicine. Annotirovannoe rukovodstvo dlja avtorov, redaktorov i recenzentov / Per. s angl. pod red. V.P. Leonova.- M.: Prakticheskaja medicina, 2011.
7. Bojko N.B., Osipov G.A., Beloborodova N.V., Kurchavov V.A. Sravnitel'noe hromato-mass-spektrometricheskoe issledovanie sostava himicheskih markerov mikroorganizmov v krovi i peritoneal'nom ykssudate brushnoj polosti pri gangrenozno-perforativnom appendicite. Infekcii v hirurgii. 2009.2.: 58-62.
8. Tec G.V., Tec V.V., Voroshilova T.M. Ocenka mikrobnogo sostava mokroty pri vne-bol'nichnoj pnevmonii. Prakticheskaja pul'monologija. 2015. 2: 62-64.
Образец ссылки на статью:
Щуплова Е.А., Фадеев С.Б. Изучение видового состава микрофлоры очагов гнойно-
воспалительных процессов с использованием разных методических подходов. Бюллетень
Оренбургского научного центра УрО РАН. 2016. 2: 8с. [Электронный ресурс] (URL:
http://elmag.uran.ru:9673/magazine/ Numbers/2016-2/Articles/EAS-2016-2.pdf).
