Изучение в экспериментальных условиях патогенности тайских изолятов вируса гриппа свиней для поросят-отъемышей Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

12. Kilbourne E.D. Influenza pandemics of the 20th century. Emerg Infect Dis, 2006, 12, 9—14.

13. Matrosovich M., Gambaryan A., Teneberg S. et al. Avian influenza A viruses differ from human viruses by recognition of sialyloigosaccharides and gangliosides and by a higher conservation of the HA receptor-binding site. Virology, 1997, 233, 224—234.

14. Schulman J.L., Kilbourne E.D. Independent variation in nature of the hemagglutinin and neuraminidase antigens of influenza virus: distinctiveness of the hemagglutinin antigen of Hong Kong-68 virus. Proc Natl Acad Sci USA., 1969, 63, 326—333.

15. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiological Reviews. 1992, 56, 152—179.

16. Taubenberger J.K., Morens D.M. 1918 influenza: the mother of all pandemics. Emerg Infect Dis, 2006, 12, 15—22.

17. Castrucci M.R., Donatelli I., Sidoli L. et al. Genetic reassortment between avian and human influenza A viruses in Italian pigs. Virology, 1993, 193, 1, 503—506.

18. Woodruff A.M., Goodpasture E.M. The susceptibility of the chorio-allantoic membrane of chick embryos to infection with the Fowl-Pox virus. Am J Pathol, 7, 209—222.

W.R. Gallaher. Towards a sane and rational approach to management of Influenza H1N1 2009. Virology J, 2009, 6:51 doi: 10.1186/1743-422X-6-51 (BMC OA).

удк 6 9 6 6 98 578 8 321 Изучение в экспериментальных условиях патогенности тайских изолятов вируса гриппа свиней для поросят-отъемышей

Д. Срета Р. Кедковид С. Туамсанг 2, П.Китикун Р.Танавонгнувех1

1 Университет Чулалонгкорн (г. Бангкок, Таиланд)

2 Национальный институт здоровья животных (г. Бангкок, Таиланд)

Ключевые слова: грипп, свинья

Сокращения: БАЖ — бронхо-альвеолярная жидкость; ВГС — вирус гриппа свиней; дпз —дней после заражения; ОТ-ПЦР — обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция; ЦПД— цитопатическое действие

Введение

Грипп свиней — острое высококонтагиозное респираторное заболевание, вызываемое вирусом гриппа типа А. В настоящее время по гемагглютинину различают 16, а по нейра-минидазе — 9 вариантов этого агента. Из них превалируют 3 основных реассортантных подтипа — H1N1, H3N2 и H1N2 [3]. Свинья играет чрезвычайно важную роль в экологии вируса гриппа А [4] — ее можно назвать «флаконом для смешивания» различных вариантов вируса гриппа. Смешанная инфекция вирусов гриппа человека, птиц и свиней служит почвой для появления новых антигенных реассортантов [22].

ВГС поражает у свиней эпителий респираторного тракта, вызывая кашель, лихорадку, сонливость и анорексию. Многочисленные хорошо отграниченные фиолетово-красные очаги делают легкие похожими на шахматную доску. При гистологическом исследовании органов дыхания отмечают разрушение эпителиальных клеток, спадение стенок бронхиол, которые с течением времени подвергаются гиперплазии и закупориваются (при интенсивном воспалении), а также легкую или умеренно тяжелую перибронхиолярную и перивас-кулярную инфильтрацию тканей респираторного тракта. Иммуногистохимическими методами вирусный антиген выявляют в эпителиальных клетках воздухоносных путей [17].

В Таиланде подтип H1N1 ВГС впервые изолировали от свиней с симптомами острого поражения органов дыхания в 1990 г. [10]. Проведенные в последнее время исследования показали, что в популяции тайских свиней широко распространен еще и подтип H3N2 [2]. В 2005 г. в провинции Сарабу-ри также обнаружили подтип IIIN2 ВГС [2].

С. Ванг и соавт. [211 сообщали о том, что гемагглютшшн Н1 более резистентен к спонтанному расщеплению на субъединицы НА1 и НА2, чем антиген НЗ. Возможно, это определяет большую способность инфицировать клетки штаммов ВГС с гемагглютиннном НЗ по сравнению со штаммами, обладающими антигеном HI B реакции ингибиции гемагглю-

тинации установили, что подтип H3N2 индуцирует у людей более интенсивный антительный ответ, чем подтип H1N1 116]. Кроме того, К. ван Рит и соавт. [20] показали, что у свиней, зараженных европейскими штаммами подтипа H3N2 ВГС, титр специфических сывороточных антител выше, чем при инфекции европейских штаммов подтипа H1N1. В Таиланде ранее не изучали патогенность упомянутых подтипов ВГС, что и послужило причиной проведения данной работы.

Материалы и методы

Штаммы вируса. Штаммы ВГС подтипов H1N1 (А/ swine/Thailand/HF/05) и H3N2 (A/swine/ThaiIand/S/05) изолировали от больных острым респираторным заболеванием поросят-отъемышей из одного и того же хозяйства в провинции Чонбури в 2005 г. После трех пассажей в куриных эмбрионах определили титр вирусов, который составил ЮТТЩэд/мл, и в дальнейшем хранили их при - 80 °С.

Схема эксперимента, помесных СПВ-поросят 22-дневного возраста, не имевших антител к вирусам болезни Ауески, репродуктивного и респираторного синдрома свиней, ВГС и М. hyopneumoniae, разделили на 3 группы. Животным двух опытных групп ннтратрахеально инокулировали по 5 мл суспензии штаммов ВГС подтипов H1N1 и H3N2 соответственно. Трем поросятам контрольной группы тем же способом ввели стерильную среду МЕМ. По одному контрольному поросенку и по два животных каждой опытной группы подвергли убою через 2,4 и 12 дн после заражения. Носовые смывы брали у животных до заражения, а затем спустя 1, 2, 3,4, 5,7,10 и 12 дпз. Взятые пробы сразу же помещали в среду МЕМ с 5 % бычьего сывороточного альбумина, 300 ЕД/мл пенициллина 300 мкг/мл стрептомицина и 1...2 мкг/мл трипсина и хранили при - 80 °С. При убое у каждого животного брани образцы крови и БАЖ для вирусологического анализа, а также пробы органов и тканей для гистологического исследования. Кроме того, делали смывы из трахеи для бактериологического исследования.

Клиническое обследование. Находившихся в опыте свиней ежедневно обследовали, регистрируя все случаи появления клинических признаков поражения органов дыхания, в т. ч. кашля, чихания, учащенного дыхания, истечений из носа и конъюнктивита. Тяжесть перечисленных симптомов оценивали в баллах (от 0 до 5) по описанной ранее методике |8|. Также ежедневно определяли ректальную температуру животных, регистрируя случаи лихорадки (> 40 °С).

Патоморфологическое исследование. При вскрытии подвергнутых убою поросят отмечали наличие в них патологоанато-мических поражений органов, в первую очередь легких. Пробы органов после фиксации в 10%-м нейтральном формалине заливали парафином [17]. Приготовленные из заливок тонкие (4...6мкм) срезы подвергали гистологическому и иммуногисто-химическому исследованиям. В последнем случае пользовались моноклональными антителами к нуклеопротеину вируса гриппа типа А (НВ654404, B.V. Europ. VetLab, Нидерланды) [5]. Тяжесть гистологических изменений оценивали в баллах 114]: 0 — отсутствие изменений в бронхиолах, 1 — легкий бронхиолит, 2 — бронхнолнт средней тяжести, 3 — тяжелый б|Юнхиолит.

Вирусологические исследования. Пробы всех долей легкого каждого животного тестировали в реакции иммунофлю-оресценции на наличие ВГС, пользуясь моноклональными антителами НВ654404 B.V. (Europ. VetLab, Нидерланды) к нуклеопротеину вируса гриппа типа Л.

Предпринимали попытки изолировать ВГС из шхювых смывов, БАЖ, сыворотки крови ранее описанным методом. Титр вируса рассчитывали в ТЦД^/мл по Риду и Менчу. С этой целью серийные 10-кратные разведения проб вносили в монослойные культуры клеток MDCK. Эти культуры пассировали 3 раза, регистрируя пояшюние в них ЦПД. Для подтверждения наличия в культуре ВГС клеточный монослой фиксировали 4%-м формалином и промывали 0,5%-м твином-20 (оба реактива готовили на ((юсфатно-буферном растворе). После часовой инкубации клетки обрабатывали моноклональными антителами НВ654404, B.V., разведенными 1:1 ООО промывочным раствором с I % бычьего сывороточного альбумина. После промывания клетки инкубировали 1 ч в ирисутствга! конъюгата (1:400) кроличьей антисыво-|юткн к IgG мыши с пероксидазой хрена (DakoCytomation, США). Для окрашивания препаратов пользовались аминоэтил-карбазоловым субстратом (Sigma, США). Тем же методом тестировали незараженную культуру клеток (отрицательный контроль) и культуру, зараженную референтным штаммом вируса.

ОТ-ГЩР. Сыворотку крови и носовые смывы исследовапи на наличие ВГС в ОТ-ГЩР, предназначенной для выявления М-гена возбудителя [11]. Вирусную РН К экстрагировали с помощью набора QIAampViralRNAMiniKit (Qiagen, Канада) из проб объемом 200 мкл. При постановке ОТ-ПЦР пользовались набором реагентов Promega One step RT-PCR (Promega, США), прямым праймером 5' TGATCTTCTTGAAAATTTGCAG3' и обратным праймером 5' TGTTGACAAAATGACCATCG3' [12]. Предполагаемый размер ампликона соответствовал 276 нукле-отидов. Обратную транскрипцию проводили 3 мин при 94 °С, затем следовали 30 циклов денатурации при 94 "С по 30 с, отжиг 30 с при 55 "С и двухэтапное вытяжение при 72 °С в течение 45 с и 7 мин соответственно. Продукты амплификации анализировали посредством электрофореза в 1,5%-м агарозном геле.

Реакция ишибиции гемагглютинации. В этом тесте определяли титр сывороточных антител к ВГС подтипов H1N1 и H3N2. Реакцию проводили с 0,5%-й взвесыо эритроцитов кур. Предварительно сыворотки крови поросят абсорбировали прогретой смесью периодата и трипсина, чтобы устранить неспецифические ингибиторы гемагглютинации [22]. В качестве антигенов пользовались теми же штаммами ВГС, которыми заражали поросят.

ДНК-секвенирование. Гены гемагглютинина и нейра-минидазы тестируемых штаммов ВГС, относящихся к подтипам H1N1 п H3N2, амплифицировали с применением универсального и специфического ираймеров [6, 23]. Продукты ОТ-ПЦР после электрофореза в 1%-м агарозном геле очищали с помощью Núcleo Spin Extractll (Macherey-Nagel, Германия) и клонировали в плазмиду pGEMTEasy (Promega, США). Плазмиды с вирусными генами очищали с помощью Núcleo Spin Plasmid (Macherey-Nagel, Германия) и секвенировати с использованием синтетических олигонуклео-тидов. Результаты анализировали в компьютерной программе

Bioedit. При построении филогенетического дерева пользовались описанными ранее методиками [ 15, 18].

Результаты

Клинические наблюдения. У всех поросят обеих опытных групп через 1...4 дпз развилось респираторное заболевание, сопровождавшееся истечением из носа, кашлем, чиханием и конъюнктивитом. Его тяжесть варьировала от 1,5 до 2 баллов. Статистически значимых различий в характере и тяжести симптоматики у животных обеих групп не выявили. Случаев лихорадки не .зарегистрировали. Поросята контрольной группы оставались здоровыми в течение всего периода наблюдения.

Патоморфологические изменения. При вскрытии в легких поросят обеих опытных групп обнаружили очаги уплотнения темно-сливового цвета. В наибольшей степени были поражены кранио-вентральные области долей. Патологоанатоми-ческне поражения легких были наиболее тяжелыми через 2 дпз, особенно у животных, инфицированных подтипом H1N1 ВГС.

При гистологическом исследовании в легких поросят опытных групп отметили утончение эпителиальной выстилки бронхиол, некроз и слущивание эпителиальных клеток, лимфоцитарные инфильтраты вокруг бронхиол. Тяжесть гистологических изменений легких у поросят опытных групп на 2, 4 и 12 дпз оценили в 2, 1 и 0 баллов соответственно.

Результаты приведены в таблице 1. В реакции иммуно-флюоресценции обнаружили антиген ВГС в легких поросят опытных групп. Его скопления светились зеленым цветом. Их начинали выявлять в ядрах эпителиальных клеток альвеол, бронхиол и бронхов со 2-го дпз. Позднее свечение вирусного антигена становилось темно-коричневым и исходило преимущественно из ядер клеток легких, а также находящихся в пораженных участках органа макрофагов (рисунок).

В легких поросят контрольной группы патоморфологи-ческих изменений и вирусного антигена не обнаружили.

Изоляция вируса. Интенсивность репродукции обоих подтипов ВГС в респираторном тракте поросят была одинаковой: через 2 дпз в легочной ткани и БАЖ титр агентов составлял Ю2...10!ТГЩ5(|/мл. У поросят опытных групп через 4 и 12 дпз и у животных контрольной группы в течение всего эксперимента ВГС не обнаружили.

ОТ-ПЦР. При проведении теста со специфическими праймерами к гену матриксного протеина ВГС установили присутствие агента в носовых смывах животных, зараженных подтипом H1N1, на 2...4-й дпз, а у животных, инфицированных подтипом H3N2, только на 2-й дпз. При исследовании носовых смывов поросят контрольной группы всегда получали отрицательный результат.

Реакция ингибиции гемагглютинации. При исследовании в данном тесте сыворотки крови поросят контрольной группы всегда получали отрицательный результат (титр антител к подтипам H1N1 и H3N2 ВГС был < 1:10). У свиней, зараженных подтипом H3N2, отсутствовали сывороточные антитела к подтипу Н INI (< 1:10), но титр антител к гомологичному подтипу на 4-й и 12-й дпз составил 1 :40. У поросят, инфицированных подтипом Н INI, отсутствовав! антитела к подтипу H3N2 (< 1:10), а титр антител к гомологичному подтипу на 12-й дпз был равен 1:160.

Бактериологическое исследование. Изолировать патогенных бактерий из трахеи и легких поросят контрольной и опытных групп на 2, 4 и 12-й дни после начала опыта не удалось. Не обнаружили в ПЦР и М. hyopneumoniae в пробах легких всех находившихся в опыте свиней.

ДНК-секвенирование и филогенетический анализ. В ходе работы секвенировали 1700 нуклеотидов (36...1736) гена гемагглютинина подтипа H1N1, 1686 нуклеотидов (37...1723) того же гена подтипа H3N2, а также 1409 нуклеотидов гена нейраминидазы обоих тайских изолятов. Анализ продуктов секвенирования генов ВГС, проведенный с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), показал, что

РВЖ СХЖ №2-2009

11

50 мкм

го

* ¿ш

50 мкм

* I

50 мкм

LJ

> <

. ✓ Г.,

*

9

л-

50 мкм

Иммуногистохимическое выявление антигенов ВГС в легких поросят.

А — препарат легкого поросенка контрольной группы (отсутствие специфического свечения); Б — темно-коричневое свечение антигенов ВГС (положительный контроль); В — специфическое свечение антигенов ВГС в эпителиальных клетках бронхиол; Г — то же в эпителиальных клетках альвеол легких

оба штамма проявляют наибольшую гомологию по генам гемаг-глютинина и нейраминидазы со штаммом А/яичпе/СЬопЬип/ 05СВ2/2005 (113М2)'. Филогенетический анализ дал основания считать, что штаммы вируса гриппа типа А с гемагтлютини-ном Н1 формируют 3 основных кластера (классический ВГС, вирус гриппа птиц и вирус гриппа человека), а штаммы с гемаг-глютинином НЗ относятся к 4 основным группам (европейскому, американскому и азиатскому ВГС, а также вирусу гриппа человека). Штаммы с нейраминидазой N1 распадаются на 3 кластера (американский ВГС, вирус гриппа человека и группу, включающую европейский ВГС и вирус гриппа птиц). Штаммы с нейраминидазой N2 также формируют 3 кластера — американский и азиатский ВГС, европейский ВГС и вирус гриппа человека, вирус гриппа птиц. Обобщая полученные результаты, можно констатировать, что по генам гемагтлютинина [СенВапк:Г [6882661 и нейраминидазы [СепВапк:^688267] штамм Л/ТЬаПапс)/!IГ6/05 (НШ1) соответственно относится к линиям Н1 классического ВГС и N1 вируса гриппа птиц, а штамм Л/ТЬа11атк1/51 /05 (НЗЫ2) по генам гемагтлютинина [СепВапкТ]688268] и нейраминидазы [Сеп Вапк: Г[6882691 является представителем линии НЗЫ2 вируса гриппа человека.

Обсуждение

Проведенные исследования показали, что оба тайских штамма ВГС, относящиеся к подтипам ГПМ и ЬГЫ, способны вызывать у свиней поражения кранио-вентральных долей легких и сопутствующие симптомы острого респираторного заболевания, о которых сообщали и другие авторы [7, 8, 11, 17]. Легкие служат основным органом, в котором реплицируется ВГС [3], — об этом свидетельствуют отрицательные результаты попыток обнаружить вирус у поросят вне легких. Иммуногисто-химический метод и ОТ-ПЦР чувствительнее при данной инфекции, чем изоляция возбудителя. Длительность инфекции у животных обеих опытных групп не превышала 2...4 дн. Вирусный антиген локализовался в ядрах эпителиальных клеток

1 Таблица с подтверждающими это данными и построенные филогенетические древа приведены на сайте РВЖ СХЖ (http:// www.rvgfarm.ru).

бронхов и бронхиол, пневмоцитах и легочных макрофагах — в этом отношении отсутствовали различия между обоими штаммами ВГС. Они реплицировались только в респираторном тракте и выделялись с носовым секретом.

Считается, что подтипы H1N1 и H3N2 не создают перекрестного протективного иммунитета [20]. Это подтвердили и результаты проводившейся нами реакции ингибиции гемагглю-тинации. Обычно подтип H3N2 индуцирует более высокие титры сывороточных антител, выявляемые данным тестом, чем подтип H1N1 |9, 20]. С. Ванг и соавт. [21] обнаружили, что гем-агглютинин штамма А/Рапаша/2007/99 (НЗ) легче расщепляется на субъединицы, чем этот антиген штамма A/New Caledonia/20/99virus(Hl), что делает последний менее имму-ногенным. Аналогичные результаты получили с подтипами H3N2 и H1N1 вирусов гриппа типов А и В при испытании приготовленных из них медицинских вакцин 119]. В нашем опыте, напротив, на 12-й дпз у поросят, инфицированных подтипом H1N1, развился более интенсивный антительный ответ, чем у животных, которых заражали подтипом H3N2, что соответствует данным П. Китикуна и соавт. [9| об антительном ответе свиней в первую педелю инфекции ВГС. Однако на 14-й и 21-й дпз эти исследователи отметили более интенсивный антительный ответ у животных, инфицированных подтипом H3N2. Такие различия могли быть обусло&тены особенностями изучавшихся упомянутыми авторами и нами штаммов ВГС. Кроме того, мы не проводили серологическое исследование после 12-го дпз.

Генетический анализ [ 1J показал, что обнаруживаемые в настоящее время на Тайване штаммы ВГС относятся к классической линии H1N1 этого вируса и проявляют наибольшую гомологию со штаммом A/Thailand/271/05 (H1N1), выделенным от человека. Циркулирующий на Тайване подтип H3N2 проявляет наибольшее родство со штаммом A/Bilthoven/2600/75 (H3N2), выделенным 1979-х годах от человека [1]. Секвениро-вание по генам гемагтлютинина и нейраминидазы использованных в нашей работе двух штаммов показало, что они относятся к классической линии H1N1 ВГС и линии H3N2 вируса гриппа человека соответственно. Интересно, что оба штамма были изолированы на одной и той же свиноферме в августе 2005 г. Оба подтипа циркулируют на Тайване с 1990 г.