CC BY
21
изучение токсичности оливамида в хроническом эксперименте на кроликах
Э.р. Переверзева, м.и. трещалин, в.А. Голибродо, А.н. тевяшова, и.д. трещалин
ФГБНУ«Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе»; Россия, 119021 Москва, ул. Большая Пироговская, 11, стр. 1
Контакты: Михаил Иванович Трещалин funky@beatween.ru
Введение. Антибиотики группы ауреоловой кислоты — высокоактивные противоопухолевые препараты. Новые данные о механизме их действия обусловили необходимость создания аналогов с улучшенными фармакологическими свойствами. В ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе» были разработаны методы селективной химической модификации антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина А, получен ряд полусинтетических производных. Наиболее активное соединение — N, N-диметиламиноэтиламид 1'-дез-(2,3-дигидроксибути-роил)-1'-карбокси-оливомицина А (оливамид) — было отобрано для углубленного доклинического изучения. Цель исследования — доклиническое изучение токсикологической безопасности лекарственной формы препарата оливамид в хроническом эксперименте на кроликах.
Материалы и методы. Исследование проведено на кроликах «Советская шиншилла». Препарат в лекарственной форме вводили внутривенно ежедневно в течение 15 дней в дозах, суммарно составляющих максимально переносимую и дозу, вызывающую гибель 50 % животных (ЛД0) — (разовые дозы 0,02 и 0,04 мг/кг соответственно). В ходе исследования определяли массу тела, проводили клинический и биохимический анализ крови, анализ мочи, снимали электрокардиограмму. На 1-е и 30-е сутки по окончании курса животных подвергали эвтаназии. Проводили патоморфологическое исследование внутренних органов.
Результаты. Показано, что введение оливамида в дозе, суммарно составляющей максимально переносимую дозу, приводит к повышению активности аспартатаминотрансферазы, увеличению содержания мочевины и креатинина. При анализе мочи было отмечено появление белка, уробилиногена и увеличение удельного веса. При применении оливамида в дозе, суммарно составляющей ЛД5д, помимо отмеченных выше показателей, было выявлено повышение активности щелочной фосфатазы и уровня общего билирубина. При патоморфологическом исследовании были найдены повреждения структуры печени и почек, интенсивность которых зависела от дозы препарата.
Заключение. Выявленные токсические свойства оливамида зависят от величины примененной дозы. При курсовом применении препарата в дозе, суммарно составляющей максимально переносимую дозу, они практически полностью обратимы в течение 30 дней.
Ключевые слова: оливамид, оливомицин А, ауреоловая кислота, хроническая токсичность, кролики
Introduction. Antibiotics of aureolic acid group are highly effective anticancer drugs. New data about their mode of action caused the need for creation of analogs with improved pharmacological properties. The methods of selective chemical modification of aureolic acid antibiotic olivomycin A were developed at the Gause Institute of New Antibiotics. Some semisynthetic derivatives have been prepared. The most active compound — N, N-dimethylaminoethylamide 1'-des-(2,3-dihydroxybutteroil)-1'-carboxy-olivomycin A (oli-vamide) — was selected for advanced preclinical testing.
Objective. The aim of the study was to investigate the toxicological safety of olivamide drug formulation in chronic experiment on rabbits. Materials and methods. The study was performed in male and female "Soviet chinchilla" rabbits. Drug formulation was administrated intravenously at the total doses of maximum tolerated dose and 50 % lethal dose (15 x 0.02 mg/kg or 15 x 0.04 mg/kg with 24-h interval). During the experiment body weight, hematological parameters, blood biochemical parameters, electrocardiography and urinalysis were performed. Animals were sacrificed 1 and 30 days post treatment. The internal organs were subjected to histological evaluation. Results. It has been shown that the treatment with total dose of olivamide maximum tolerated dose produces an increase of aspartate aminotransferase, urea and creatinine level in serum. Urinalysis revealed the elevation of protein, urobilinogen and urine specific gravity. Administration of high dose of olivamide in addition to the above-mentioned laboratory parameter caused the raising of alkaline phosphatase and total bilirubin level in serum. Microscopic pathology observation showed structure abnormalities of varying severity in liver and kidneys.
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-4-91-97
TOXICOLOGICAL STODY OF OLIVAMIDE IN CHRONIC EXPERIMENT ON RABBITS
E.R. Pereverzeva, M.I. Treschalin, V.A. Golibrodo, A.N. Tevyashova, I.D. Treschalin
Gause Institute of new antibiotics; 1 bldg, 11B. Pirogovskaya St., Moscow 119021, Russia
92 Оригинальные статьи
Conclusion. Olivamide drug formulation displayed dose-dependent toxic properties. Multiple administration of low dose of the drugproduces transient toxic effects completely reversible within 30 days. Key words: olivamide, olivomycin, aureolic acid, chronic toxicity, rabbits Введение группы АК предотвращают развитие резистентно- Среди первых представителей противоопухо- сти опухолевых клеток к другим противоопухолевым левых антибиотиков, вошедших в клиническую средствам, в том числе по механизму, связанному практику в 60-70-х годах прошлого столетия, были с ингибированием транскрипции гена MDR1, ги-антибиотики группы ауреоловой кислоты (АК): оли- перэкспрессия которого обеспечивает феномен мно-вомицин А (ОА), хромомицин (ХМ) и митрамицин жественной лекарственной устойчивости [6, 7]. (М). Препараты очень близки по структуре. ХМ и М Появление новых технологических подходов, та-имеют одинаковый хромофор хромомицинон, но ких как комбинаторный биосинтез, биокатализ, ген-отличаются сахарными остатками. Хромофор ОА ная инженерия, позволило получить аналоги природ-оливин не имеет метильной группы в положении 7 ных структур с улучшенными химиотерапевтическими хромомицинона [1]. В клинике ОА был эффективен свойствами [8]. Однако такой эффективный способ при лечении опухолей яичка (тератобластома, эм- получения новых препаратов, как химическая моди-бриональный рак), хорионэпителиомы матки, зло- фикация природных соединений, для антибиотиков качественных опухолей миндалин. В комбинации группы АК ранее практически не применялся [9]. с другими препаратами его использовали для лечения В ФГБНУ «НИИНА» были изучены различные на-некоторых форм сарком мягких тканей. М применя- правления химической модификации ОА как на-ли при лечении эмбрионального рака яичка. Во вре- иболее перспективного цитотоксического вещества, мя клинических испытаний ХМ наблюдали случаи обладающего наилучшим химиотерапевтическим объективного эффекта при раке желудка, толстой индексом среди антибиотиков группы АК, мощного кишки, костных и мягкотканных саркомах [2]. Несмо- индуктора апоптоза опухолевых клеток и ингибито-тря на близость строения, эти препараты отличались ра Р53-индуцированной транскрипции [10]. Были не только по спектру действия, но и по токсичности. получены серии полусинтетических производных, ОА наименее токсичен и имеет наилучший терапев- ряд из которых показал преимущества перед исход-тический индекс. ХМ оказался наиболее токсичным ным антибиотиком [11, 12]. Соединение N, N-диме-из 3 антибиотиков. При клинических испытаниях тиламиноэтиламид 1'-дез-(2,3-дигидроксибутиро-почти у всех больных наблюдали развитие почечной ил)-1'-карбокси-оливомицина А (оливамид) было недостаточности, вплоть до острого некроза каналь- отобрано для углубленного доклинического изучения. цев. Одним из самых тяжелых проявлений побочного действия М в клинике оказался геморрагический Материалы и методы диатез, сопровождающийся тромбоцитопенией [3]. Работа выполнена в соответствии с правилами Эти препараты применялись довольно широко, од- экспериментального изучения оригинальных фарма-нако позже были признаны недостаточно эффектив- кологических веществ [13] с соблюдением этических ными, слишком токсичными, и их перестали исполь- норм обращения с животными, принятых Европей-зовать для лечения больных со злокачественными ской конвенцией по защите позвоночных животных, опухолями. используемых для исследовательских и иных науч- Интерес к антибиотикам группы АК возродился ных целей [14]. в 2000-х годах. Он был обусловлен появлением новых Исследования проведены на кроликах породы данных о механизме их действия. Так, было показано, Советская шиншилла, самцах и самках массой 2500— что в основе противоопухолевого эффекта антиби- 2800 г, полученных из питомника «Белый мох». Жи-отиков этой группы лежит ингибирование процессов вотные были разделены на 6 групп (3 группы самцов репликации и транскрипции посредством взаимо- и 3 группы самок) по 6 особей. В качестве суммарных действия с GC-богатыми нуклеотидными последо- доз были выбраны максимально переносимая доза вательностями в присутствии ионов Mg2+, в частно- (МПД) — 0,28 мг/кг доза, вызывающая гибель 50 % сти с сайтом транскрипционного фактора Sp1, животных (ЛД), — 0,63 мг/кг, которые были рассчи-расположенным в этом регионе [4]. Белок Sp1, вли- таны для кроликов путем пересчета с соответствую-яющий на клеточный рост, дифференциацию и апоп- щих доз для крыс с учетом коэффициента поверхно-тоз, играет критическую роль в пролиферации клеток сти тела [15] и коэффициента кумуляции оливамида. и метастазировании различных видов опухолей [5]. Препарат в лекарственной форме вводили внутри-Кроме того, было установлено, что антибиотики венно в краевую вену уха ежедневно в течение 15 сут.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL 0F BIOTHERAPY 4'2018 том 17 | vol. 17
Оригинальные статьи 93
Разовые суточные дозы составили соответственно 0,02 и 0,04 мг/кг. Наблюдение продолжали в течение 30 сут после прекращения введений препарата.
На протяжении исследования ежедневно проводили оценку состояния и поведения животных, 1 раз в неделю определяли массу тела. Гематологическое исследование периферической крови (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, тромбоциты, лейкоформу-ла и гематокрит) проводили перед началом курса введений (0 сутки), на 1, 7 и 15-й дни во время курса, на 3, 5, 7-е; 10, 20 и 30-е сутки после окончания курса введений с помощью автоматического гематологического анализатора «Abacus Junior Vet» (Diatron, Австрия). Биохимическое исследование сыворотки крови животных с определением аланинаминотранс-феразы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), креатинина, мочевины, билирубина прямого и общего, общего белка, альбумина, глюкозы осуществляли на 1-й и 30-й день после окончания курса введений препарата при помощи автоматического биохимического анализатора «ChemWell» (Awareness Technology Inc., США). Общий анализ мочи (рН, лейкоциты, эритроциты, кетоновые тельца, белок, уробилиноген, удельный вес) проводили на 1-й и 30-й день после окончания введений препарата, используя автоматический анализатор мочи «Laura Smart» (Erba Lachema, Чехия). ЭКГ во 2-м стандартном отведении снимали на 1-е и 30-е сутки после курса (электрокардиограф ЭК1Т-07, «Аксион», Россия).
Статистическую обработку количественных данных проводили по критерию t Фишера—Стьюдента при помощи компьютерных программ StatPlus 2006 и Microsoft Excel. Различия определяли как достоверные прир <0,05.
На 1-е и 30-е сутки по окончании курса введений препарата половину животных из каждой группы подвергали эвтаназии, определяли массовые коэффициенты тимуса, сердца, печени, почек, селезенки. Участки внутренних органов фиксировали в 10 % нейтральном формалине, по стандартной методике заливали в парафин. Короткие серии срезов окрашивали гематоксилином и эозином и подвергали световой микроскопии.
Результаты и обсуждение
На протяжении всего эксперимента гибели животных не наблюдалось. Значимых отклонений от контрольных значений показателей периферической крови не выявлено. Отклонений в поведенческих реакциях животных не отмечено.
При биохимическом исследовании сыворотки крови и у самцов, и у самок на 1-е сутки после окончания введений оливамида в низкой дозе было зарегистрировано повышение активности АСТ (рис. 1—2),
содержания креатинина (рис. 3—4) и мочевины (рис. 5—6). К концу наблюдения значения этих показателей не отличались от контроля. При применении препарата в высокой дозе наряду с отмеченными выше изменениями происходило повышение активности ЩФ (рис. 7—8) и уровня общего билирубина (рис. 9—10). При этом повышенный уровень АСТ и мочевины сохранялся до 30 сут после окончания курса введений.
60
50
40
30
20
о
10
0
30
Сутки после окончания введений
0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
рис. 1. Динамика изменения уровня АСТ в сыворотке крови самцов кроликов
о
:
70 60 50 40 30 20 10 0
1 30
Сутки после окончания введений 0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
рис. 2. Динамика изменения уровня АСТ в сыворотке крови самок кроликов
200
S 150 а.
<и
100
50
о
:
1
30
Сутки после окончания введений 0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
рис. 3. Динамика изменения уровня креатинина в сыворотке крови самцов кроликов
0
а ш
Сутки после окончания введений
0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
Рис. 4. Динамика изменения уровня креатинина в сыворотке крови самок кроликов
с 100
а ш
1 30
Сутки после окончания введений 0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
Рис. 7. Динамика изменения уровня ЩФ в сыворотке крови самцов кроликов
12
10
о
1 30
Сутки после окончания введений
0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
Рис. 5. Динамика изменения уровня мочевины в сыворотке крови самцов кроликов
80
60
40
20
о
:
1 30
Сутки после окончания введений 0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
Рис. 8. Динамика изменения уровня ЩФ в сыворотке крови самок кроликов
8
6
4
2
0
0
12
10
/л д/
о
^ 0
1 30
Сутки после окончания введений
0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
Рис. 6. Динамика изменения уровня мочевины в сыворотке крови самок кроликов
о
:
1 30
Сутки после окончания введений 0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
Рис. 9. Динамика изменения уровня общего билирубина в сыворотке крови самцов кроликов
8
6
4
2
При исследовании состава мочи на 1-е сутки после окончания курса введений препарата в обеих изученных дозах как у самцов, так и у самок отмечено появление белка и уробилиногена, увеличение удельного веса. На 30-е сутки после отмены препарата у кроликов, получавших оливамид в высокой
дозе, сохранялось повышенное содержание уробилиногена. Содержание белка в моче и удельный вес не отличались от контроля.
Патоморфологическое исследование показало, что при ежедневном внутривенном введении в течение 15 дней в обеих изученных дозах оливамид ока-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
4'2018 ТОМ 17 | VOL. 17
/л д/
8 1,5
1
0,5
о
0
1
30
Сутки после окончания введений 0,02 мг/кг 0,04 мг/кг Контроль
рис. 10. Динамика изменения уровня общего билирубина в сыворотке крови самок кроликов
зывает повреждающее действие на структуру печени и почек кроликов, которое выражается как в дистрофических, так и в деструктивных изменениях клеток паренхимы органов. В печени преобладали явления вакуольной дистрофии, в почках — некротические
процессы. Характер морфологических изменений не зависел от пола животных.
При применении препарата в высокой дозе вакуольная дистрофия гепатоцитов носила тотальный характер (рис. 11а, б). Вокруг некоторых триад был выявлен некроз гепатоцитов (рис. 11 в). В течение месяца структура печени частично восстанавливалась, очаги некроза подвергались организации (рис. 11г). При использовании оливамида в дозе, суммарно составляющей МПД, небольшие очаги вакуольной дистрофии возникали только вблизи центральных вен, а к концу наблюдения структура органа не отличалась от контроля.
Применение препарата в дозе, суммарно составляющей ЛД50, приводило к изменению структуры как канальцев, так и клубочков почки. На 1-е сутки после курса введений препарата во всех зонах почки были найдены очаги вакуольной дистрофии и деструкции эпителия извитых и прямых канальцев. В корковой и мозговой зоне были выявлены «лапчатые» клубочки, иногда с резко утолщенной капсулой
2
рис. 11. Патоморфологическое исследование печени кролика. х20: а — интактный контроль, триада; б — оливамид, 0,04 мг/кг х 15, 1-е сутки после курса. Вакуольная дистрофия гепатоцитов; в — оливамид, 0,04 мг/кг х 15, 1-е сутки после курса. Некроз гепатоцитов вокруг триады; г — оливамид, 0,04 мг/кг х 15, 30-е сутки после курса. Очаг некроза гепатоцитов вокруг триады в стадии организации
(рис. 12а, б). Отдельные нефроны подвергались тотальному некрозу, который к 30-м суткам наблюдения завершался фиброзом капсулы клубочков, склерозом очагов некроза и формированием кист на месте деструкции канальцев (рис. 12в, г).
При применении препарата в низкой дозе изменения в ткани почки возникали не у всех животных и носили мелкоочаговый характер, затрагивая небольшие группы извитых канальцев (рис. 12д). В течение 30 дней очаги некроза подвергались организации (рис. 12е).
В остальных органах и тканях патологических изменений не обнаружено.
Таким образом, в хроническом эксперименте на кроликах было установлено, что оливамид обладает гепато- и нефротоксическими свойствами. Ге-патотоксичность препарата проявляется в виде повышения активности АЛТ, АСТ и уровня билирубина. Морфологически она выражается в развитии вакуольной дистрофии гепатоцитов и появлении очагов микронекроза. При применении препарата в дозе, суммарно составляющей МПД, изменения клини-ко-лабораторных показателей и структуры органа полностью обратимы в течение месяца.
Основной лимитирующий вид токсичности оли-вамида — нефротоксичность. Она проявляется в повышении уровня мочевины и креатинина в сыворотке крови, появлении уробилиногена и белка в моче и увеличении ее удельного веса.
Особенностью нефротоксического действия оли-вамида является его свойство повреждать структуру капилляров клубочков, вызывая фибропластический гломерулонефрит, который морфологически выражается в «лапчатости» клубочков и фиброзе их капсулы, и, как следствие, деструкцию канальцев. Очаговый, а иногда тотальный некроз отдельных нефронов, возникающий при применении препарата в высокой дозе, сопровождается повышением активности ЩФ в сыворотке крови. Некротические процессы завершаются формированием кист и склерозом поврежденных участков почки. При использовании препарата в низкой дозе повреждения структуры почки отмечаются лишь у отдельных животных и затрагивают отдельные клубочки и извитые канальцы. В течение 30 дней биохимические показатели сыворотки крови и состав мочи нормализуются, а очаги деструкции подвергаются организации.
Заключение
Оливамид не обладает гематотоксическими свойствами, не оказывает влияния сердечно-сосудистую и пищеварительную систему. Интенсивность изменений структуры и функции печени и почек кроликов, возникающих под действием препарата, зависит от величины примененной дозы. Это позволяет рекомендовать препарат для дальнейшего продвижения.
Рис. 12. Патоморфологическое исследование почки кролика. х20: а — интактный контроль; б — оливамид, 0,04 мг/кг х 15, 1-е сутки после курса. Некроз, деструкция, вакуольная дистрофия эпителия извитых канальцев, кистообразное расширение просвета, «лапчатые» клубочки; в — оливамид, 0,04мг/кг х15, 30-е сутки после курса. Склероз в области некроза канальцев, кисты, выстланные плоским эпителием; г — оливамид, 0,04 мг/кг х15, 30-е сутки после курса. Фиброз капсулы клубочков, х40; д — оливамид, 0,02 мг/кг х15, 1-е сутки после курса. Мелкие очаги вакуольной дистрофии и деструкции эпителия извитых канальцев; е — оливамид, 0,02 мг/кг х 15, 30-е сутки после курса. Очаг некроза в стадии организации
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN J0URNAL 0Р ВЮТШАРУ
4'2018 ТОМ 17 | V0L 17
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики. М.: Медицина; 1987:12-7. [Gause G.F., Dudnik Yu.V. Antitumor antibiotics. М.: Medicine; 1987:12-7. (In Russ.)].
2. Химиотерапия злокачественных опухолей. Под ред. Н.Н. Блохина. М.: Медицина; 1977:126-9 [Chemotherapy of malignant tumors. By ed.
N.N. Blokhin М.: Medicine; 1977:126-9. (In Russ.)].
3. Gause G.F. Chromomycin, Olivomycin, Mithramycin. In: Antineoplastic and Immunosuppressive Agents. Handbook of Experimental Pharmacology (Heffter-Heubner/New Series). Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1975. Vol. 38/2. Pp. 615-622.
DOI: https://doi.org/10.1007/ 978-3-642-65806-8_32.
4. Vizcaino C., Mansilla S., Nirnez L.E. et al. Novel mithramycins abrogate the involvement of protein factors
in the transcription of cell cycle control genes. Biochem Pharmacol 2012;84:1133-42. PMID: 22981341. DOI:10.1016/j.bcp.2012.08.003.
5. Deacon K., Onion D., Kumari R. et al. Elevated SP-1 transcription factor expression and activity drives basal and hypoxia-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression
in non-small cell lung cancer. J Biol Chem 2012;287(47):39967-81. PMID: 22992725. DOI: 10.1074/jbc. M112.397042.
6. Mir M.A., Majee S., Das S., Dasgupta D. Association of chromatin with anticancer antibiotics, mithramycin and chromomycin A3. Bioorg Med Chem 2003;11(13):2791-801.
PMID: 12788353. DOI:10.1016/s0968-0896(03)00211-6.
7. Tagashira M., Kitagawa T., Isonishi S.
et al. Mithramycin represses MDR1 gene expression in vitro, modulating multidrug resistance. Biol Pharm Bul 2000;23(8):926-9. PMID: 10963297.
8. Gonzalez-Sabin J., Moris F. Exploring novel opportunities for aureolic acids as anticancer drugs. Biochem
& Pharmacol 2013;2(1):1-3. DOI: 10.4172/2167-0501.1000e140.
9. Тевяшова А.Н. Оливомицин А - противоопухолевый антибиотик группы ауреоловой кислоты (обзор). Химико-фармацевтический журнал 2016;50(7):3-8. DOI: 10.30906/00231134-2016-50-7-3-8. [Tevyashova A.N. Olivomycin A - antitumor antibiotic
of aureolic acid group. Himiko-farmacevticheskiy zhurnal = Pharmaceutical Chemistry Journal 2016;50(7):3-8. (In Russ.)].
10. Симонова В.С., Самусенко А.В., Филиппова Н.А. и др. Оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток
и подавляет Р53-индуцированную транскрипцию. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2005;4:451-5. [Simonova V.S., Samusenko A.V., Filippova N.A. et al. Olivomycin causes tumor cell apoptosis and suppresses P53-induced transcription. Billyuten experimentalnoy biologicheskoy medicinj = Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2005;4:451-5. (In Russ.)].
11. Tevyashova A.N., Olsufyeva E.N., Balzarini J. et al. Modification
of the antibiotic olivomycin I
at the 2'-keto group of the side chain.
Novel derivatives, antitumor and topoisomerase I-poisoning activity. J Antibiot (Tokyo) 2009;62:37-41. PMID: 19132061. DOI: 10.1038/ja.2008.7.
12. Tevyashova A.N., Shtil A.A., Olsufyeva E.N. et al. Modification of olivomycin A at the side chain
of the aglycon yields the derivative with perspective antitumor characteristics. Bioorg Med Chem 2011;19:7387-93. PMID: 22088308. DOI: 10.1016/j.bmc.2011.10.055.
13. Якубовская Р.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А. и др. Методические рекомендации по изучению фотоин-дуцированных противоопухолевых свойств лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова и др. Ч. 1. М.: Гриф и К, 2012. С. 13-24. [Yakubovskaya R.I., Kazachkina N.I., Karmakova T.A. et al. Methodical recommendations on the study
of photoinduced antitumor properties of drugs. In: Guide to conducting preclinical studies of medicines. Ed. by A.N. Mironov. P.I. Moscow: Grif i K, 2012. Pp. 13-24. (In Russ.)].
14. Council of Europe. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. ETS 1986:123.
15. Freireich E.J., Gehan E.A., Rall D.P.
et al. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey and man. Cancer Chemother Rep 1966;50(4):219-44. PMID: 4957125.
ORCID авторов/ORCID of authors
Э.Р. Переверзева/E.R. Pereverzeva: https://orcid.org/0000-0001-7368-9695 В.А. Голибродо/V.A. Golibrodo: https://orcid.org/0000-0001-8643-6427 А.Н. Тевяшова/A.N. Tevyashova: https://orcid.org/0000-0003-1091-1011 И.Д. Трещалин/I.D. Treschalin: https://orcid.org/0000-0001-7331-5490
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
