CC BY
9
не обучения и воспитания. Материалы. М., 1968, с. 49— М., 1977, вып. 4, с. 59—72. 50. Сорокина Т. Н.— Там же, с. 35—44.
iКуинджи И. Н,— В кн.: Гигиена детей и подростков. Irasek Л— Pedagógica (Praha), 1966, v. 16, р. 710—720.
Поступила 21/VI 1979 г.
УДК 614.771-078
В. В. Королик
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ШТАММОВ Е. COLI, SALM. TyPHIMURIUM И CL. PERFRINGENS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНСЕКТИЦИДЫ НА ОСНОВЕ ВАС. THURINGIENSIS
II Московский медицинский институт им. Н. И. Пирогова
При исследовании влияния бактериальных инсектицидов на основе Вас. thuringiensis (энтобактерин и дендро-•бациллин) на патогенные бактерии в почве и определении выживаемости Вас. thuringiensis в почве мы изучали возможность изменчивости основных свойств штаммов Е. coli, Salm, typhimurium, Cl. perfringens и Вас. thuringiensis. Выяснение данного вопроса имеет важное значение с точки зрения санитарной микробиологии и эпидемиологии, так как при изменении указанных свойств затрудняется индикация патогенных бактерий, которые при этом могут сохранять вирулентность и представлять потенциальную эпидемическую опасность. Кроме того, почва является постоянно действующим природным очагом энтомопатогенной инфекции (Е. В. Талалаев), происходит естественный круговорот микрофлоры растение — почва — растение (3. В. Вишнякова), в связи с чем вопрос изменчивости свойств Вас. thuringiensis в почве имеет большое значение для успешного использования бактериальных препаратов в борьбе с насекомыми.
Учитывая возможность многократных обработок сельскохозяйственных угодий бактериальными инсектицидами, а следовательно, и многократного их поступления в почву, мы через каждые 10 дней обсеменяли почву спорами штаммов Вас. thuringiensis из расчета 6Х 10* жиз-яеспособных спор на 1 г почвы. Лабораторную диагностику осуществляли по общепринятым методикам. Вас. thuringiensis выделяли и идентифицировали по схеме, предложенной К. Н. Дабуровым и соавт. Для выявления изменчивости проводили сравнительное изучение широкого набора тестов штаммов Е. Coli, Salm, typhimurium и Cl. perfringens — исходных, выделенных из почвы контроля, не содержащей бактериальных препаратов, и из опытной, обсемененной энтобактерином и дендробацил-лино.ч. Штаммы Е. Coli и Salm, typhimurium отбирали на уровне выделения единичных клеток из почвы, а Cl. perfringens — через 3 мес после внесения в почву. Изменчивость свойств штаммов Вас. thuringiensis определяли через 3 мес в варианте эксперимента с однократным внесением спор Вас. thuringiensis в почву. Исходные и выделенные из почвы штаммы изучали по морфологйческим, культуральным, биохимическим тестам, устанавливали чувствительность их к антибиотикам, патогенность для животных.
Морфологические особенности выросших культур определяли по характеру роста колоний на плотных питательных средах (Salm, typhimurium — на висмут-сульфитном и мясо-пептонном агаре, Е. Coli — на агаре Эндо и мясо-пептонном агаре, Cl. perfringens — на кровяном агаре Цейсслера, Вас. thuringiensis — на модифицированной нами среде Ю. П. Пивоварова с ТТХ и на мясо-пептон-ном.агаре), по размеру и форме клеток, окрашенных по Граму, и подвижности.
Для изучения сахаролитической активности использовали общепринятые среды Гисса с углеводами (рафино-зой, инулином, мальтозой, глицерином, салицином, ман-нитом, глюкозой, арабинозой, лактозой, сорбитом, ксилозой, сахарозой, дульцитом, рамнозой). Способность штам-
мов к утилизации определяли по рекомендации проф. Г. П. Калины на средах, изготовленных на основе цитратного агара Симмонса, в которые в качестве единственного источника питания вместо цитрата натрия добавляли один из ингредиентов (аспарагин, гистидин, цитрат натрия, глутамат натрия, орнитин, аргинин, маннит, сорбит, рамнозу, крахмал, салицин, галактозу, мальтозу, крахмал+желатин, лактозу, арабинозу, глицерин, глюкозу и сахарозу). Проверяли способность изучаемых штаммов расти в пептонной воде с 5 и 7% хлористого натрия, способность разжижать питательный желатин, образовывать индол и сероводород. Исследовали реакцию на ле-цитиназу, на ацетоин (реакция Фогеса — Проскауэра), уреазную активность. Кроме того, у штаммов Вас. thuringiensis изучали тесты на гидролиз крахмала, казеина и образование эскулитина. Декарбоксилазную активность изучали полуколичественным методом ионофоретического разделения аминов и соответствующих аминокислот на хроматографической бумаге, разработанным Е. М. Губаревым и Ю. В. Галаевым. Наличие и степень декарбокси-лазной активности выявляли по отношению к 22 аминокислотам: аланину, аминоуксусной кислоте, аргинину, аспа-рагиновой кислоте, аспарагину, валину, гистидину, глут-аминовой кислоте, глутамину, лейцину, лизину, метиони-ну, орнитину, пролину, серину, тирзину, треонину, триптофану, фенилаланину, цистеину, глицину и норлейцину. Чувствительность штаммов к антибиотикам (пенициллину, тетрациклину, стрептомицину, террамицину, хлор-тетрациклину, мономицину, левомицетину, неомицину и эритромицину) определяли методом бумажных дисков. Вирулентность штаммов Е. Coli и Sal. typhimurium изучали на белых беспородных мышах массой 14—20 г при внутрибрюшинном введении бактериальной взвеси. Ток-сигенность штаммов Cl. perfringens определяли путем введения токсина мышам в боковую вену хвоста. О вирулентности и токсигенности судили по летальной дозе, вызывающей гибель 50% лабораторных животных. Статистическую обработку показателей вирулентности и токсигенности проводили по методу И. П. Ашмарина и А. А. Воробьева. Среди выделенных из почвы штаммов Salm, typhimurium встречались атипичные формы колоний сальмонелл в виде черных круглых, но не дающих четко выраженного металлического блеска колоний. При микроскопическом исследовании также обнаружен ряд изменений: полиморфизм, который проявлялся в различных размерах и формах клеток, наличие слабоокрашенных клеток, ограничение подвижности.
Среди кишечных палочек, выделенных из экспериментальной почвы, обнаружены единичные варианты с пониженной способностью расщеплять лактозу. На агаре Эндо такие колонии были розового цвета, без металлического блеска. При микроскопическом исследовании встречались слабоподвижные варианты. Существенных отличий куль-туральных и морфологических свойств штаммов Е. coli и Salm, typhimurium в опыте и контроле не выявлено. Культуральные и морфологические свойства штаммов Cl. perfringens, выделенных из почвы в эксперименте, не
имели существенных отличий от исходных. При изучении сахаролитической активности установлено, что у экспериментальных штаммов Е. coli по сравнению с исходными снижается или утрачивается способность утилизировать ряд Сахаров на средах Гисса. Выделенные из почвы штаммы кишечной палочки не сбраживали мальтозу и рамнозу, резко снизилась сахаролитическая активность в отношении глицерина и ксилозы. Существенных различий между штаммами в опыте и контроле не установлено. Фермента-Тивные свойства штаммов Salm, typhimurium, Вас. thu-ringiensis, Cl. perfringens, выделенных из почвы, оказались более стабильными. Различий между исходными и экспериментальными штаммами при росте их в средах Гисса не было.
На модифицированном цитратном агаре Симмонса 50% штаммов Е. coli, выделенных из почвы опыта, утратили способность утилизировать салицин, в то время как активность штаммов в контроле осталась на уровне исходных штаммов. У экспериментальных штаммов Salm, typhimurium по сравнению с исходными ферментативная активность резко сократилась в отношении гистидина (отрицательная реакция у всех штаммов в опыте и у большинства в контроле) и цитрата натрия (отрицательная реакция у большинства штаммов в опыте, положительная у всех в контроле). Повышение ферментативной активности наблюдалось в отношении глутамата натрия (положительная реакция в опыте у незначительной части штаммов и у всех в контроле) и аргинина (положительная реакция только в контроле у незначительной части штаммов). Таким образом, на модифицированных средах Симмонса штаммы Е. coli и Salm, typhimurium, выделенные из почвы в контроле, отличались от опытных значительно большей ферментативной активностью. Оценку ферментативной активности Cl. perfringens по данным тестам не проводили из-за отсутствия роста на указанных средах. Сахаролитическая активность штаммов Вас. thuringiensis, выделенных из почвы, оказалась стабильной без существенных различий экспериментальных и исходных штаммов.
При определении декарбоксилазной активности установлено, что у экспериментальных штаммов Е. coli по сравнению с исходными произошли снижение активности декарбоксилазы треонина и утрата декарбоксилаз аргинина и аспарагина. Активность треонин-декарбоксилазы стала ниже у опытных штаммов по сравнению с контрольными. У штаммов Salm, typhimurium, вегетировавших в почве, по сравнению с исходными снизилась декарбоксил-азная активность в отношении гистидина, но повысилась активность лизнн-декарбоксилазы. У штаммов, выделенных из опытной почвы, по сравнению с контрольными оказалась менее активной лизин-декарбоксилаза и полностью исчезла способность декарбоксилировать пролин. У штаммов Cl. perfringens (исходных, выделенных из почвы опыта и контроля) существенной разницы декарбоксилазной активности не отмечено. У штаммов Вас. thuringiensis, выделенных из почвы, по сравнению с исходными несколько снизилась активность в отношении валина.
Л ИТЕ1
Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы
в микробиологических исследованиях. Л., 1962. Вишнякова 3. В.— В кн.: Кристаллоносные микроорганизмы и перспективы их использования в лесном хозяйстве. М., 1967, с. 74—84. Губарев Е. М., Галаев Ю. В.— Биохимия, 1957, т. 22, L № 3, с. 441—444.
В результате изучения чувствительности к антибиотикам, исходных, опытных и контрольных штаммов Salm, typhimurium, Е. coli, Cl. perfringens и Вас. thuringiensis значительной разницы не выявлено. По экспериментальным штаммам Salm, typhimurium в целом отмечено некоторое возрастание чувствительности к 4 антибиотикам (в контроле к стрептомицину, мономицину и левомицети-ну, в опыте и к террамицину). Снизилась чувствительность-также к 4 антибиотикам (в опыте к тетрациклину, хлор-тетрациклину н неомицину, в контроле к тем же антибиотикам и террамицину). Опытные штаммы Salm, typhimurium по сравнению с контрольными оказались более чувствительными почти ко всем взятым в опыт антибиотикам. У экспериментальных штаммов Е. coli по сравнеиию]с исходными чувствительность к мономицину, левомицети-ну и неомицину уменьшилась. Опытные штаммы несколько отличались от контрольных большей устойчивостью к антибиотикам. Сколько-нибудь закономерных отличий в-чувствительности к антибиотикам у экспериментальных штаммов Cl. perfringens и Вас. thuringiensis не обнаружено.
При изучении вирулентности Е. coli и Salm, typhimurium — исходных культур и выделенных из почвы » опыте и контроле — установлено, что вирулентность кишечных палочек и сальмонелл, вегетировавших в почве, ниже вирулентности исходных штаммов. Вместе с тем вирулентность штаммов Salm, typhimurium и Е. coli, выделенных из почвы контроля, несколько выше, чем у обнаруженных в почве опыта. Разница вирулентности исходных, опытных и контрольных культур' Е. coli и Salm, typhimurium была несущественной. По токсигенност» исходные, опытные и контрольные штаммы Cl. perfringens существенных различий не имели.
Таким образом, при вегетировании в почве наблюдается изменчивость штаммов Е. coli и Salm, typhimurium. Это выражается в нарушении некоторых морфологических и культуральных свойств, антибиотикоустойчивости, снижении ферментативной активности и вирулентности, что является результатом жизнедеятельности бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды. Штаммы Е. coli и Salm, typhimurium, выделенные из почвы, интенсивно загрязненной спорами Вас. thuringiensis, отличались от контрольных значительно меньшей ферментативной активностью и некоторым снижением вирулентности. У штаммов Вас. thuringiensis — основы бактериальных инсектицидов энтобактерина и дендробациллина — после-длительного пребывания в почве могут изменяться морфологические и культуральные свойства, подавляется де-карбоксилазная активность, возможна утрата или снижение способности к кристаллообразованию, что косвенно-свидетельствует о снижении их энтомоцидной активности. Ввиду способности Вас. thuringiensis подавлять биологическую активность бактерий возникает вопрос о влияния бактериальных препаратов на почвенную микрофлору,, что требует специального изучения.
А Т У Р Л
Дабуров К■ Н., Королик В. В., Дериглазов А. Д. и др.—
Гиг. и сан., 1978, № 11, с. 71—75. Талалаев Е. В.— В кн.: Микробиологические методы
борьбы с вредными насекомыми. М., 1963, с. 81. Файбич М. М. и др.— Микробиол. пром-ность, 1973. № 9, с. 26.
Поступил« 20/VI 1979 г.
