CC BY
92
УДК 611.11+611.127
Ключевые слова: эпикард, васкулогенез, гладкомышечные клетки, эндотелиоциты, иммуногистохимия
Key words: epicardium, vasculogenesis, smooth muscle cells, endothelial cells, immunohistochemistry
Чумасов Е. И.1'2, Петрова Е. С.1, Коржевский Д. Э.1,3
ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ ЭПИКАРДА И ОСОБЕННОСТЕЙ ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ В СЕРДЦЕ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫС
STUDY OF THE STRUCTURE OF DEVELOPING EPICARDIUM AND VASKULARIZATION
IN THE HEART OF NEWBORN RATS
'ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Адрес: 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12
Institute of Experimental Medicine, Federal State Budgetary Research Institution Address: 197376, Russia, Saint-Petersburg, Academician Pavlov's str., 12 2ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Адрес: 196084, Россия, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5 Saint-Petersburg State Academy of Veterinary Medicine, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 196084, Russia, Saint-Petersburg, Chernigovskaya str., 5 3Санкт-Петербургский государственный университет Адрес: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9
Saint Petersburg State University Address: 199034, Russia, Saint-Petersburg, Universitetskaya quay, 7/9
Чумасов Евгений Иванович, д. б. н., профессор, ст. н. с. E-mail: [email protected]
Chumasov Evgeniy I., Doctor of Biological Science, Professor, Senior Researcher. E-mail: [email protected]
Петрова Елена Сергеевна, к. б. н., ст. н. с., ст. н. с. Petrova Elena S., PhD in Biological Sciences, Senior Researcher Коржевский Дмитрий Эдуардович, д. м. н., профессор, зав. лабораторией
Korzhevsky Dmitrij E., Doctor of Medical Science, Professor, Head of the Laboratory
Аннотация. Целью работы явилось изучение особенностей строения развивающегося эпикарда и формирующихся кровеносных сосудов сердца крысы в ранний постнатальный период. Работа выполнена на крысах Вистар разного возраста: первого, четырнадцатого и тридцатого дней постнатального развития (n=12). В работе наряду с гистологическими методами (окраска толуидиновым синим и гематокмилином-эозином) использованы иммуногистохимиче-ские реакции на альфа-актин - маркер гладкомышечных клеток, актин саркомерный - маркер кар-диомиоцитов, фактор Виллебранда - маркер эндотелиоцитов и белок PGP 9.5. Установлено, что в эпителии эпикарда сердца новорожденных крыс содержится белок PGP 9.5. Установлено, что развивающийся эпикард служит источником не только части сосудов, которые объединяются с коронарным руслом, но и даёт начало развитию системы синусоидных капилляров микроциркуляторного русла сердца. Определён клеточный состав клеток в субэпикардиальном слое. Показано, что в процессе васкулогенеза из них образуются гладкомышечные клетки, эндотелиоциты и переходные клеточные элементы миофибробластического ряда. В работе дискутируется вопрос об источниках происхождения эндотелиальных клеток в сердце крысы в онтогенезе.
Summary. The aim of the work was to study the features of the structure and differentiation of developing epicardium cells and vaskularization of the heart of newborn rats. The work was performed on Wistar rats of different ages: the first, the fourteenth and the thirtieth days of postnatal development (n = 12). In addition to histological methods (toluidine blue and hematoxilin-eosin dyeing), immunohistochemical reactions to alpha-actin (marker of smooth muscle cells), actin sarcomer (marker of cardiomyocytes), von Willebrandfactor (marker of endotheliocytes) and PGP protein 9.5 were used. It was found that there was a protein PGP 9.5 in epithelium of the epicarduim of newborn rats. It was established that developing epicardium serves as a source not only parts of a vessels, that divides with coronary channel, but gives rise to the system of sinusoidal capillaries of the microcirculatory channel of the heart, too. The cellular composition of cells in the subepicardial layer was determined. It was shown that at the process of vasculogenesis smooth muscle cells, endothelial cells and transitional cell elements of the myofibroblastic series are formed. The question of sources of origin of endothelial cells in the rat heart during ontogenesis is discussed in the work.
Введение
Известно, что эпителиальный слой эпикарда, покрывающий сердце, происходит из висцерального листка закладки мезодермы (спланхнотома) и, в частности, является продолжением мезотелия септальной перегородки печени [6, 7, 12-14]. По данным литературы, посвященной эмбриональному развитию сердца, этот эпителий многие называют проэпи-кардом (ПЭ), так как в эмбриональный период он служит источником прогениторных клеток, участвующих в васкулогенезе коронарных сосудов миокарда, а в постнатальном онтогенезе из него формируется дефинитивный эпикард [6, 9]. Процесс образования коронарных сосудов авторы описывают следующим образом. Начинается он с выселения популяции клеток из эпителия в субэпикардиальное пространство на границе с закладкой дифференцирующихся клеток миокарда. Кластеры или группы выселившихся клеток рассматриваются как мезенхимальные элементы, «клетки дериваты эпикарда» (EPDCs), или прогениторные клетки. Эти клетки подвергаются так называемой «эпителиально-мезенхимальной трансформации» (ЭМТ) - процессу, достаточно широко обсуждаемому в последние десятилетия в литературе [3, 8, 10]. В механизмах ЭМТ лежат сложные процессы, в которых участвуют биологически активные вещества, влияющие на пролиферацию кардиомиобластов, на образование коронарных сосудов и на их рост [5]. Из предшественников ПЭ образуются различные типы клеток, включая эндотелий коронарных сосудов, гладкомышечные клетки (ГМК) и интерстициальные фибробласты миокарда [3, 4, 12, 14]. Следует отметить, что в эмбриогенезе на стадии сердечной трубки и образования «сердечной петли» (Е10-Е11.5 у мышей) стенка сердца состоит только из двух слоев клеток: наружного - клеток закладки миокарда и внутреннего - эндотелия эндокарда. На более поздней стадии беременности (Е16.5 у мыши), включая новорождение, появляется третий слой - проэпикард [3, 4, 12, 14]. Ранние стадии развития ПЭ были изучены на гистологическом, иммуногистохимическом уровнях с помощью сканирующей и конфокальной лазерной микроскопии [10]. Результаты этих современных методов были использова-
ны для подтверждения упомянутой гипотезы (об ЭМТ), идентификации выселяющихся из ПЭ клеток и выяснения их дальнейшей судьбы. Авторы нашли убедительные доказательства того, что у птиц, мышей и крыс выселяющиеся из ПЭ клетки в эмбриогенезе подвергаются ЭМТ, часть из них остается на месте, а часть мигрирует в миокард, где образует сеть коронарных сосудов. Приводится интересный факт -удаление проэпикарда у птиц приводит к задержке как пролиферации кардиомиобластов, так и развития коронарных сосудов. Несмотря на очевидные и приоритетные данные цитируемых работ, судьба клеток, производных эпикарда, в ранний постнатальный период и их роль в гистогенезе тканей сердца крысы до сих пор остаются недостаточно выясненными.
Цель работы - изучить особенности строения развивающегося эпикарда и формирующихся кровеносных сосудов сердца крысы в ранний постнатальный период.
Материалы и методы
Работа проведена на крысах Вистар разного возраста: первого (Р1), четырнадцатого (Р14) и тридцатого (Р30) дня постнатального развития (n=12). Во всех экспериментах при эвтаназии крыс соблюдали международные правила Хельсинской декларации о гуманном обращении с животными и «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №775 от 12.08.1977 МЗ СССР). Животных умерщвляли парами этилового эфира, выделяли сердце и околосердечную область и фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [2]. После заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Часть срезов окрашивали толуидиновым синим по Нисслю и гематоксилином-эозином. Для иммуноги-стохимического выявления гладкомышеч-ных (ГМК) клеток использовали мышиные моноклональные антитела к альфа-актину (1A4, Dako, Дания). Для выявления кар-диомиоцитов применяли поликлональные кроличьи антитела к саркомерному актину (SpringBioscience, США) в разведении 1:150. Для выявления клеток проэпикарда применяли поликлональные кроличьи антитела к белку PGP 9.5 (1:200, Spring Bioscience, США).
Для идентификации эндотелиальных клеток применяли поликлональные кроличьи антитела к фактору фон Виллебранда (vWF) (Dako, Дания). В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из наборов EnVision+SystemLabelledPolymer-HRP Anti-Mouse (Dako, Дания) и Reveal Polyvalent HRP/ DAB Delection System kit (Spring Bioscience, США). Для иммуногистохимических реакций использовали отрицательный контроль с нанесением на срезы вместо первичных антител их разбавителя (Dako, Дания).
Результаты исследований
Изготовленные через все сердце крысы первых суток развития (Р1) продольные гистологические срезы, окрашенные толуиди-новым синим и перечисленными иммуно-гистохимическими методами (ИГХ), дают представление о топографии, степени зрелости развивающихся тканей и о состоянии васкуляризации. При малом увеличении микроскопа на срезах видно, что если в верхней трети, центральной части миокарда желудочков, на уровне клапанов уже имеются мелкие и среднего диаметра веточки коронарной артерии, то в остальной части желудочка, а также ушек предсердий, артериальные сосуды еще отсутствуют (рис. 1а, 1б). Это свидетельствует о различной степени продолжающихся процессов васкулогенеза в различных отделах сердца новорожденных животных.
Неожиданным оказался факт, что однослойный плоский эпителий ПЭ у крысы Р1 содержит пан-нейрональный маркер-белок PGP 9.5. Это позволило не только уточнить строение, но и проследить его взаимоотношение с подлежащим миокардом. Клетки эпителия хорошо окрашиваются этим методом в темно-коричневый цвет, причем ядра интенсивнее, чем цитоплазма (рис. 2а). Выяснилось, что эпителий, не прерываясь, окружает сердце от верхушки вплоть до корней магистральных сосудов. Вокруг органов и крупных сосудов околосердечной области, вне сердца, эпителий не прослеживается. По нашему мнению, его присутствие связано исключительно с близостью миокарда. Описанный эпителий характеризуется различной степенью реактивности и гетерогенностью морфологиче-
ских признаков (различной интенсивностью окраски ядер, объема и толщины цитоплазмы, а также различной интенсивностью деления клеток в зависимости от топографии).
Обращает на себя внимание, что под эпителием, на границе с миокардом, в ушках и в желудочках имеется менее или более выраженное тканевое пространство или субпро-эпикардиальный клеточный слой (СПЭС). Особенно хорошо его тканевая структура выражена на границе близко прилежащих друг к другу отделов: аорты, правых ушка и желудочка. В этом расширенном участке различаются мелкие и крупные (от 7 до 15 мм), различной формы (звездчатой, треугольной, веретеновидной), с округлым ядром и небольшим объемом цитоплазмы отростчатые клетки, очень сходные с мезенхимальными элементами. Это - рыхлая соединительная ткань формирующейся адвентиции аорты. По мере удаления от стенки аорты видно, как она постепенно переходит в СПЭС ушка и желудочка и прослеживается в разных участках ПЭ вплоть до верхушки сердца.
Анализ СПЭС и близлежащей области миокарда с помощью гистологических и ИГХ методов показал, что в направлении от эпикарда к миокарду наблюдается развитие кровеносных сосудов (рис. 2). В разных местах миокарда нередко можно видеть митотиче-ски делящиеся клетки.
Для морфологической идентификации предшественников различных цитотипов клеток (эндотелиальных, гладкомышечных, фибробластов), участвующих в васкулогене-зе и тесных взаимоотношениях с миокардио-бластами, оказалось недостаточным использование обычных гистологических методов окраски, и поэтому в работе были использованы иммуногистохимические реакции.
С помощью селективного выявления эндо-телиальных клеток с помощью антител к фактору Виллебранда установлено, что процесс образования части сосудов сердца особенно интенсивно происходит в этот срок в СПЭС. Здесь формируются альвеолярные пузырьки или везикуло-тубулярные структуры (рис. 2б). В некоторых участках видно отслоение небольших участков уплощенных клеток от эпителиального пласта путем деламина-
ции. При этом формируются многочисленные сильно уплощенные цистерны или эллипсовидные полости, которые часто встречаются вдоль всего периметра эпикарда, окружающего желудочки сердца. По ширине просвета они составляют от 5 до 25 мкм и длиной от 50 до 300 и более мкм; часть полостей напоминает систему капилляров синусоидного типа. В просвете некоторых из них обнаруживаются эритроциты (рис. 1, 2г, 2д). Многие структуры заполнены белковым содержимым. Состав белкового содержимого цистерн и эллипсоидов, по-видимому, сходен с жидкостью просвета желудочков. Все эти структуры выстланы эндотелиальными клетками с характерными палочковидными ядрами. Многие из них находятся в состоянии митотического деления. В близлежащей области миокарда уже формируются различных типов сосуды, включая артериолы и артерии (рис. 2в).
Для избирательного выявления цитодиф-ференцировки линии ГМК применяли альфа-актин (а-Ак), а для миокардиобластов - актин саркомерный. Отличительные особенности обеих реакций хорошо продемонстрированы на рисунке 3. Установлено, что с помощью первого маркера (а-Ак) выявляются клетки стенок формирующихся сосудов (рис. 3 а, 4). Актин саркомерный выявляется в миокардио-бластах и миокардиоцитах (рис. 3б).
На рисунках видно, что основным местом образования а-АК+ структур в миокарде является СПЭС. В некоторых участках плотность а-Ак+ клеток была высокой, в то время как в других, ближе в верхушке сердца, значительно меньше. Клетки, содержащие а-АК, окрашиваются селективно в желто-коричневый цвет и имеют различную морфологию: одни из них имеют вытянутую, слегка извитую форму и имеют немногочисленные тонкие отростки, другие представляют собой веретеновидные или треугольные клеточные элементы. Они вместе с клетками, сходными с эндотелиацита-ми (а-АК-негативными), образуют однослойные пузырьки или сильно уплощенные цистерны и эллипсоиды, переходящие в синусоидные капилляры. Часть этих клеток определяется в более удаленных от СПЭС участках миокарда, среди миокардиотубул и волокон из ми-окардиоцитов, где они также участвуют в ва-
Рис. 1. Стенка правого желудочка новорождённой крысы: а - коронарные сосуды различного диаметра в миокарде проксимального отдела правого желудочка; б - формирующиеся сосуды миокарда в дистальном отделе вблизи верхушки сердца. Стрелки - синусоидные капилляры, Кл - клапан, П - полость желудочка, ПЭ - проэпикард, М -миокард, А - артерия.
скулогенезе. Они встречаются в составе стенок синусоидных сосудов, капилляров и артериальных сосудов и, как правило, находятся в тесной связи с а-АК иммунонегативными клетками миокарда (рис. 2г). У формирующихся капилляров и артериол нередко видны конусы роста (рис. 2в). Стенка некоторых артериол в местах перехода в капилляры имеет эндотелиальные почки или конусы роста. Встречаются а-АК+ клетки с сильно уплощенной цитоплазмой. Сравнивая продольные и поперечные срезы, сделанные через ГМК, обнаружено, что продукт реакции а-АК+ клеток локализуется в виде кольца по периферии цитоплазмы на некотором удалении от неокрашенного ядра. Данным методом хорошо идентифицируются зрелые миоциты артериол и мелких, и крупных артерий в стенке желудочков. При подкрашивании
Рис. 2. Иммуногистохимические реакции для определения клеточных элементов в эпикарде и миокарде сердца: а - эпителий развивающегося эпикарда (стрелки); б - формирование синусоидных сосудов в миокарде; в - образование артериол и капилляров; г, д - синусоидный капилляр. СПЭС - субэпикардиальный слой между эпителием и миокардом; КР - конус роста; А - артериола. Иммуногистохимические реакции на белок PGP 9.5 (а), альфа-актин (б, в, г), фактор Виллебранда (д). Ув.: х400.
Рис. 3. Периферическая зона миокарда на границе с проэпикардом (а) и центральная часть стенки желудочка (б). СПЭС - субэпикардиальный слой между эпителием и миокардом, КП - синусоид-ные капилляры, стрелки - митозы в миокардио-бластах. Иммуногистохимическая реакция на альфа-актин (а), на актин саркомерный (б), подкраска толуидиновым синим. Ув.: х 400.
Рис. 4. Образующийся артериальный сосуд (артериола): Э - эндотелиальные клетки, ГМК - глад-комышечные клетки. Иммуногистохимическая реакция на альфа-актин, подкраска толуидиновым синим. Ув.: х400.
срезов толуидиновым синим в стенке сосуда четко различается внутренний слой, состоящий из а-АК отрицательных эндотелиоцитов, и наружный слой из а-АК+ ГМК, окрашенных в коричневый цвет (рис. 4).
Использование ИГХ метода выявления сар-комерного актина четко продемонстрировало морфологические отличительные особенности между ГМК и миокардиотубулярными структурами миокарда. Показано, что у крысы Р1 на данной стадии развития в миокарде, наряду с васкулогенезом желудочков, продолжается интенсивная пролиферация и дифференциров-ка миокардиобластов (рис. 3б). В различных участках миокарда предсердий и желудочков, в эпикардиальной зоне, в глубоких слоях стенки желудочков, сосочковых мышцах и нитях на этой стадии развития встречаются различной степени дифференцировки мышечные элементы: многочисленные миотубулы без ис-черченности, пучки и волокна из цилиндрических миокардиоцитов со слабо выраженной поперечной исчерченностью.
Анализ гистологических препаратов сердца крысы Р14 и Р30 показал, что в эти сроки наблюдаются существенные изменения по сравнению с предыдущим сроком развития. Эпителий эпикарда утрачивает прежнюю четкость выявления с помощью PGP 9.5, реже встречаются митотически делящиеся клетки. Через 30 суток после рождения у крыс увеличивается объем сердца, появляются соединительнотканные септы, в септах и в миокарде увеличивается численность различного диаметра артериальных сосудов, реже встречаются ми-тотически делящиеся кардиомиобласты.
Обсуждение результатов
В специальной литературе дискутируется вопрос о дифференцировке клеток, выселяющихся из ПЭ в область эпителиально-мезен-химной трансформации (ЭМТ) и выясняется их дальнейшая судьба в процессе миграции в миокард и участие в васкулогенезе [8, 11]. По мнению одних авторов, предшественники ПЭ способны производить все три цитотипа клеток сосудистой стенки: периваскулярные и интермиокардиальные фибробласты, ГМК и эндотелиальные клетки коронарных сосудов [8, 11]. По мнению других [3] - ПЭ служит
общим источником только для ГМК и фибро-бластов. По их мнению, эндотелиальные предшественники могут находиться не только в новообразованных сосудах субэпикардиального пространства, но и встречаться в удаленных от ПЭ местах миокарда, где также наблюдается васкулогенез. Результаты нашей работы согласуются с данными литературы. Изучив сердце крыс в более поздние сроки развития - в ранний постнатальный период, мы получили данные, подтверждающие высказывания других авторов [8, 11]. При этом полученные нами результаты о гистогенезе эндотелия сосудов миокарда позволяют нам предположить несколько путей или способов его происхождения.
Один путь - прямой, когда выселяющиеся предшественники в виде одиночных клеток образуют пузырьки и трубкообразные структуры. Другой путь - отщепление от общего пласта эпителия эпикарда небольшого слоя клеток, формирующих уплощенные цистерны, эллипсоиды, синусоидные капилляры. Все эти структуры остаются на месте, непосредственно в СПЭС. Третий путь предполагает происхождение эндотелиальных клеток из мигрирующих, коммитированных в эндо-телиальном направлении клеток, которые, также как ГМК-элементы, могут давать временно-положительную реакцию на а-Ак. Так как эти клетки находятся в локомоторном состоянии, в их цитоплазме и отростках должно присутствовать достаточно большое количество актиновых филаментов. Подобные клетки нередко выявляются в составе слоя эндотелия синусоидных и обычных капилляров. Через некоторое время они, вероятно, утрачивают способность синтезировать а-Ак+ и дифференцируются в функционально зрелые эндотелиоциты. Следующие за ними популяции клеток, по-нашему мнению, уже дифференцируются в адвентициальные миофибробласты, перициты и ГМК.
Не менее важным источником эндотелия сосудов миокарда на ранних стадиях его развития служит стенка аорты. По данным литературы [1, 3] и собственным наблюдениям, эндотелий эндокарда появляется значительно раньше в эмбриогенезе. Мы также наблюдали в области клапанного аппарата сердца, как эндотелий интимы аорты переходит в эндотелий эндокарда.
По нашим данным, у новорожденных крысят эндотелиальные клетки еще не полностью выстилают просветы полостей ушек и желудочков, они прослеживаются вокруг межпредсерд-ной перегородки, некоторых миокардиальных сосочков и отдельных пучков миокардиоцитов. На основании изложенного можно предположить, что на какой-то, пока точно не установленной, стадии постнатального развития эндотелий системы капилляров, происходящих из ПЭ, объединяется с эндотелием коронарных сосудов аорты. Возможно, проэпикард служит также источником сосудов, которые формируют систему «сосудистых русел» синусоидно-го типа, связанных непосредственно с кровью желудочков и выполняющих дренажную или депонирующую функции [Афанасьев, Горяч-кина, 2011]. Процесс васкулогенеза в миокарде продолжается и после рождения. Он имеет двухвекторную направленность - сосуды, происходящие из эпикарда, объединяются с сосудами коронарного русла, источником которых является аорта. В результате образуется характерное микроциркуляторное русло миокарда сердца. Это происходит у крысы спустя 2 недели после рождения.
Заключение
В работе исследованы особенности строения развивающегося эпикарда крысы в ранний постнатальный период. Описано строение формирующихся кровеносных сосудов в эпи-и миокарде. Установлена положительная избирательная иммуногистохимическая реакция эпителия развивающегося эпикарда сердца новорожденных крысят к пан-нейрональному маркеру - белку PGP 9.5. Использованные специальные гистологические и иммуногистохи-мические методы дали возможность проследить межтканевые взаимоотношения в стенке сердца, определить клеточный состав проге-ниторных клеток в субэпикардиальном слое. В процессе васкулогенеза в развивающемся миокарде новорожденных крыс были выявлены переходные клеточные элементы миофи-бробластического ряда.
Список литературы
1. Афанасьев, Ю. И. Сердечно-сосудистая система. Руководство по гистологии [Текст] / Ю. И. Афанасьев,
В. Г. Горячкина // Под ред. Р. К. Данилова. - 2-е изд. -СПб. : СпецЛит. - 2011. - Т. 2. - С. 241-296.
2. Коржевский, Д. Э. Теоретические основы и практическое примененеие методов иммуногистохи-мии: руководство [Текст] / Д. Э. Коржевский, О. В. Ки-рик, Е. С. Петрова, М. Н. Карпенко, П. Григорьев, Е. Г. Сухорукова, Е. А. Колос, А. В. Гиляров // СПб.: СпецЛит. - 2014. - 119 с.
3. Dettman, R. W. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart [Текст] / R. W. Dettman, W. Denetclaw Jr, C. P. Ordahl, J. Bristow // Dev. Biol. - 1998. - Vol. 193. - № 2. - P. 169-81.
4. Kirby, M. L. Molecular embryogenesis of the heart [Текст] // Pediatr. Dev. Pathol. - 2002. - Vol. 5. -P. 516-543.
5. Lavine, K. J. Shared circuitry: developmental signaling cascades regulate both embryonic and adult coronary vasculature [Текст] / K. J. Lavine, D. M. Ornitz // Circ Res. - 2009. - Vol. 104. - № 2. - Р. 159-169.
6. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D. & Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significanceof the epicardium [Текст] / J. Manner, J. M. Perez-Pomares, D. Macias, R. Munoz-Chapuli // Cells Tissues Organs. - 2001. - Vol. 169. -№ 89. - P. 103.
7. Majesky, M. W. Development of coronary vessels [Текст] / M. W. Majesky // Curr. Top. Dev. Biol. - 2004. -Vol. 62. - P. 225-259.
8. Mikawa, T. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with in growth of the epicardial organ [Текст] / T. Mikawa, R. G. Gourdie // Dev. Biol. -1996. -Vol. 174. - № 2. - Р. 221-232.
9. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis ofcardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels [Текст] / T. Mikawa, D. A. Fischman // Proc .Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. -P. 9504-9508.
10. Nesbitt, T. Epicardial Development in the Rat: A New Perspective [Текст] / N. Nesbitt, A. Lemley A., J. Davis J. // Microsc. Microanal. - 2006. - Vol. 12. -P. 390-398.
11. Perez-Pomares, J. M. Contribution of the primitive epicardium to the subepicardial mesenchyme in hamster and chick embryos [Текст] / J. M. Perez-Pomares, D. Macias, L. Garcia-Garrido, R. Munoz-Chapuli // Dev. Dyn. - 1997. - Vol. 210. - P. 96-105.
12. Reese, D. E. Development of the coronary vessel system [Текст] / D. E. Reese, T. Mikawa, D. M. Bader // Circ. Res. - 2002. - Vol. 91. - P. 761-768.
13.Wada, A. M. Coronary vessel development: a unique form of vasculogenesis [Текст] / A. M. Wada, S. G. Willet, D. Bader // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. -2003. - Vol. 23. - P. 2138-2145.
14.Wessels, A. The epicardium and epicardially derived cells (EPDCs) as cardiac stem cells [Текст] / A. Wessels, J. M. Pеrez-Pomares // Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. - 2004. - Vol. 276. - № 1. -Р. 43-57.
