CC BY
37
DOI: 10.23868/201805009
интрамиокардиальное введение резидентных c-kit-прогениторных клеток сердца вызывает активацию прогениторных клеток эпикарда и стимулирует васкуляризацию миокарда после инфаркта
К.В. Дергилев1, З.И. Цоколаева1, И.Б. Белоглазова12, Е.С. Зубкова12, М.А. Болдырева12, Е.И. Ратнер1, Д.Т. Дыйканов2, М.Ю. Меньшиков1, Е.В. Парфенова12
1 Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии, Москва, Россия
2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Intramiocardial administration of resident c-kit+ cardiac progenital cells activates epicardial progenitor cells and promotes myocardial vascularation after the infarction
K.V. Dergilev1, Z.I. Tsokolaeva1, I.B. Beloglazova12, E.S. Zubkova12, M.A. Boldyreva12, E.I. Ratner1, D.T. Diykanov2, M.U. Menshikov1, E.V. Parfenova12
1 Russian Cardiology Research and Production Complex, Moscow, Russia
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
e-mail: [email protected]
Обновление миокарда в постнатальном периоде и его восстановление после повреждения происходит при участии резидентных прогениторных клеток сердца (ПКС). В экспериментальных и клинических работах показаны регенеративные эффекты ПКС при трансплантации в поврежденный миокард. Однако механизмы этих эффектов остаются предметом дискуссий. Если первоначально они объяснялись способностью ПКС дифференцироваться в кардиомиоциты и клетки сосудов, то в последнее время их регенеративные эффекты в основном объясняют секрецией биологически активных молекул и высвобождением экзосом, которые способствуют активации регенеративной программы в клетках сердца.
Цель исследования — оценить влияние интрамиокардиаль-ной трансплантации ПКС на активацию васкулогенного пула клеток эпикарда.
Крысам-самцам линии вистар проводили перевязку передней нисходящей коронарной артерии и выполняли интрамиокар-диальные инъекции флуоресцентно меченных (CM-DIL+) ПКС или контрольной среды. Через 14 сут. после трансплантации ПКС сохраняли жизнеспособность и часть клеток проявляла признаки васкулогенной дифференцировки. Морфометрические исследования показали, что достоверных различий в размере площади рубца между группами не было. Однако трансплантация ПКС способствовала уменьшению выраженности негативного ремодели-рования: статистически значимому снижению расширения полости ЛЖ (индекса дилатации), уменьшению распространенности трансмурального поражения и артериогенеза в перинфарктной зоне. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов миокарда показало достоверное увеличение количества Wt1 +-клеток в эпикарде после трансплантации ПКС в сравнении с контрольной группой, что указывает на активацию эпителиально-мезенхимального перехода и формирование прогениторных клеток эпикарда (ПКЭ). ПКЭ мигрировали в миокард, часть из них коэкспрессировала маркеры CD31 (Pecam), альфа-гладкомышечный актин (a-SMA) и участвовала в построении новообразованных сосудов.
Таким образом, интрамиокардиальная трансплантация ПКС способствует увеличению васкуляризации миокарда как за счет дифференцировки трансплантированных клеток, так и активации васкулогенных клеток эпикарда, что в свою очередь может приводить к уменьшению постинфарктного ремо-делирования сердца.
ключевые слова: эпикард, прогениторные клетки сердца, с-kir прогениторные клетки, прогениторные клетки эпикарда, инфаркт миокарда, васкуляризация.
введение
Сердечная недостаточность, возникающая в большинстве случаев после инфаркта миокарда (ИМ), продолжает лидировать среди основных причин смерти и инва-лидизации во всем мире [1]. Несмотря на повсеместное внедрение подходов для лечения острой коронарной
Resident cardiac progenitor cells reside in the adult heart and govern myocardial homeostasis and repair after injury. Many experimental and clinical studies are being completed with encouraging results. However, the mechanisms of the therapeutic action of CPC remain poorly understood. Initially they were explained by the ability of CPC to differentiate into cardiomyocytes and vascular cells, recently their regenerative effects are mainly explained by secretion biologically active molecules and the release of exosomes, which promote activation of the regenerative program in the heart cells.
The aim of the present study is to assess the effect of intramyo-cardial CPC transplantation on the activation of the vasculogenic pool of epicardial cells.
In our study we ligated the anterior descending coronary artery in the hearts of male Wistar rats and intramyocardial injections of a fluorescently labeled (CM-DIL+) CPC or control medium were performed. Fourteen days after transplantation, CPC retained viability, proliferation properties and some cells showed signs of vasculogenic differentiation. We did not find significant differences in the infarct size between two groups assessed by morphometric studies. However, CPC transplantation attenuated adverse remodeling: we found reduction in left ventricular dilatation, severity of transmural injury and activation of arte-riogenesis in the border zone. By immunofluorescence staining of myocardial sections, obtained after CPC transplantation, we found a significant increase the number of Wt1+ cells in the epicardium, indicating activation of the epithelial-mesenchymal transition and the formation of epicardial progenitor cells (EPC). EPC migrated to the myocardium, some of them coexpressed markers CD31 (Pecam), alpha-smooth muscle actin (a-SMA), and participated in the new vessels formation.
Thus, intramyocardial CPC transplantation increased the vascularization of the myocardium by differentiation of the transplanted cells, as well as the activation of vasculogenic epicardial cells, which can contribute the reduction of negative cardiac remodeling.
Keywords: epicardium, cardiac progenitor cells, c-kit+ progenitor cells, epicardial progenitor cells, myocardial infarction, vascularization.
окклюзии, связанных со стентированием или хирургической васкуляризацией, эти методы применимы только при условии наличия «подходящих» для вмешательства коронарных сосудов и сохранения жизнеспособности миокарда. В случае необратимого повреждения миокарда, восстановить кровоснабжение миокарда с помощью
вышеуказанных методов не представляется возможным, что приводит к ремоделированию сердца и развитию сердечной недостаточности [2].
Образование новых кровеносных сосудов является частью естественного процесса регенерации миокарда, регулирует процесс постинфарктного ремоделирования и определяет прогноз для пациентов после перенесенного ИМ [3, 4]. На сегодняшний день были исследованы различные подходы к стимуляции васкуляризации постинфарктного сердца, включая генную терапию, а также локальную/системную доставку ангиогенных факторов роста, результаты которых, к сожалению, оказались весьма спорными и имеющими ограниченную эффективность [5-7]. В связи с этим внимание исследователей было сосредоточено на поиске стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в клетки сосудов и стимулировать васкуляризацию за счет паракринных эффектов, что может способствовать формированию сосудистой сети de novo, обеспечивающей выживаемость ишемизированных/гибернированных кардиоми-оцитов, поддерживать систолическую функцию сердца и предотвращать развитие сердечной недостаточности. Определенные надежды в этой области возлагаются на резидентные прогениторные клетки сердца (ПКС), которые являются активными участниками регенеративных процессов в миокарде [8, 9], как за счет индукции дифференцировки в основные клеточные типы миокарда, прежде всего в клетки сосудов, так и за счет паракрин-ных эффектов, включающих секрецию внеклеточных везикул [10, 11]. В экспериментальных и клинических работах продемонстрирована возможность ПКС существенно улучшать функцию сердца и стимулировать его васкуляризацию [10, 11]. Однако, механизмы участия ПКС в регенерации миокарда, и в частности, в его неова-скуляризации после инфаркта изучены недостаточно.
Цель исследования — оценить влияние интрамиокар-диальной трансплантации ПКС на активацию васкуло-генного пула клеток эпикарда.
Материал и методы
Экспериментальные животные
Эксперименты проводили на самцах крыс линии Wistar (n=30), приобретенных в питомнике лабораторных животных «Пущино» (Пущино, Россия). Животные содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде в соответствии с требованиями ГОСТ. Эвтаназия крыс проводилась после ингаляционной наркотизации изофлюраном (Piramal Healthcare, Индия) методом дислокации шейного отдела позвоночника. Все необходимые манипуляции выполняли в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/ЕС по экспериментам на животных и были одобрены этическим комитетом института (Национальный центр медицинских исследований кардиологии, разрешение № 385.06.2009).
Получение и культивирование резидентных ПКС
С-№-ПКС крысы были получены с использованием модифицированного метода, описанного ранее [12] ПКС выделяли из крыс-самцов линии Wistar (250-300 г). Животных наркотизировали ингаляцией изофлюраном, сердца извлекали, промывали в стерильном растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ), измельчали ножницами до кусочков размером 2-3 мм3 и инкубировали в течение 15 мин. в смеси 0,1 % коллагеназы A (Roche Diagnostics, США) и 0,2 % трипсина (Invitrogen, США). Обработанные образцы миокарда культивировали в условиях эксплантной культуры в течение 10 сут. с использованием питательной среды DMEM/F12 (Gibco, США),
содержащей 10 // ФБC (ATCC, CIA), 10 нг/мл LIF (Sigma, CIA), 100 ЕД/мл пенициллина (Gibco, ОША), 100 ЕД/ мл стрептомицина (Gibco, CIA), 2 мМ L-глутамина (Gibco, CIA). C-kit+^KC были выделены из клеток эксплантной культуры с помощью метода иммуномагнитной селекции с использованием набора для выделения клеток сердца и протокола фирмы Miltenyi Biotec (CIA). На первом этапе была проведена деплеция клеток костного мозга с помощью антител к CD45 (BD, CIA) и антител, конъюгиро-ванных с магнитной бусиной (Miltenyi Biotec, CIA). Затем CD45(-) клетки сортировали с использованием антител против c-kit (Santa Coiz, CIA) и вторичных антител, конъ-югированных с магнитной бусиной (Miltenyi Biotec, CIA). Изолированные клетки культивировали в чашках Петри, покрытых фибронектином, в среде DMEM/F12, содержащей 10 о/ ФБЦ 100 ЕД/мл пенициллина, 100 ЕД/ мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 2 / B27 (Sigma, CIA), 1x инсулин-трансферрин-селинат (Gibco, CIA) и факторы роста: 20 нг/мл bFGF (Peprotech, CIA), 20 нг/ мл EGF (Peprotech, CIA), 10 нг/мл LIF (Sigma, CIA).
Анализ иммунофенотипа ПКС методом
проточной цитофлуориметрии
Для проверки чистоты клеточной культуры и иммунофенотипа П^ использовали цитофлуориметр FACS Canto II (BD, CIA). Для проведения анализа клетки центрифугировали (200 g, 5 мин.), супернатант удаляли, осадок инкубировали в течение 30 мин. при +4 °C в растворе 1 / BSA/Ф^ с антителами к одному из следующих антигенов: c-kit (Santa Coiz, CIA), CD31 (BD, CIA), CD34 (Santa Coiz, CIA) или CD45 (BD, CIA). После инкубации клетки центрифугировали (200 g, 5 мин.), дважды промывали Ф№ и ресуспендировали в 1 / BSA/ Ф№ с вторичными антителами, конъюгированными с AlexaFluo^BB (Invitrogen, CIA). После 30-мин. инкубации при +4 °C клетки промывали, ресуспендировали в Ф№ и исследовали с помощью FACS Canto II (BD, CIA).
Анализ иммунофенотипа ПКС
методом иммуноцитохимии
ПКЦ культивированные на стеклах, покрытых фибронектином, фиксировали 3,7 / параформальдегидом, обрабатывали 0,1 о/ Tnton X-100 в Ф^ и инкубировали с кроличьими поликлональными антителами к маркерам c-kit (Santa Coiz, CIA, 1:100, 2 ч. при 37 °C), Oct 3/4 (Abcam, CIA, 1: 100, 2 ч. при 37 °C), Nanog (Santa Coiz, CIA, 1:100, 2 ч. при 37 °C), а затем с вторичными антителами Alexa Fluor 4ВВ/594 (кат # A11001, A21207, Invitrogen, CIA, 1:800, 1 ч. при 37 °C). Ядра клеток были окрашены DAPI.
Анализ дифференцировочной способности ПКС
C-kit+^KC 3 пассажа высевали на культуральные чашки Петри, покрытые ламинином, с плотностью 20х103 кл/ см2 в среду a-MEM (Gibco, CIA), содержащую 10 // ФБЦ 10 мкМ 5-азацитидина (Sigma, CIA) и инкубировали в течение 72 ч. с ежедневной сменой среды. Затем клетки культивировали в среде a-MEM (Gibco, CIA) с 10 / ФБC и 10 нг/мл TGF-ß (R&D, CIA) в течение 21 сут. со сменой среды каждые 72 ч. Дифференцировку C-kit+-П^ анализировали иммуноокрашиванием антителами к тяжелым цепям миозина (Abcam, CIA, 1:100, 1 ч. при 37 °C) и фаллоидину-Alexa 488 (Invitrogen, CIA, 1: 100, 1 ч. при 37 °C), и вторичными антителами Alexa Fluor 488 (Invitrogen, CIA, 1:800, 1 ч. при 37 °C).
Для индукции эндотелиальной дифференцировки C-kit+^KC 3 пассажа высевали на культуральные чашки Петри в среду DMEM/F12, содержащую 1/ ФБЦ
1 % пенициллина/стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 10-8 M дексаметазона, 10 нг/мл фактора роста VEGF и культивировали 21 сут. с заменой дифференцировоч-ной среды каждые 48 ч. Эндотелиальную дифферен-цировку тестировали путем окрашивания клеток антителами к маркеру Pecam (CD31) (BD, США, 1:100, 1 ч. при 37 °C) и вторичными антителами Alexa Fluor 488 (Invitrogen, США, 1:800, 1 ч. при 37 °С).
Для индукции гладкомышечной дифференцировки С-№-ПКС 3 пассажа высевали на культуральные чашки Петри в среду DMEM/F12, содержащую 1°% ФБС, 1 % пенициллина/стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 10-8 М дексаметазона и 40 нг/мл фактора роста PDGF BB (R&D, США) и культивировали в течение 21 сут. с заменой дифференцировочной среды каждые 48 ч. Гладкомышечную дифференцировку тестировали окрашиванием клеток антителами к маркеру Gata 6 (Santa Cruz, США, 1: 100, 1 ч. при 37 °C), гладкомышечному актину-FITC (Sigma-Aldrich, США, 1:100 , 1 ч. при 37 °С) и вторичными антителами Alexa Fluor 488 (Invitrogen, США, 1:800, 1 ч. при 37 °C).
Моделирование инфаркта миокарда
и трансплантация клеток
Инфаркт миокарда был индуцирован перевязкой передней нисходящей коронарной артерии крыс Wistar по методу, описанному ранее [13]. Перед трансплантацией ПКС метили флуоресцентным красителем CM Dil (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя реагента. Клеточный препарат ПКС трансплантировали с помощью ин-трамиокардиального способа введения (4 инъекции по 25х104 кл/50 мкл среды M199 (Gibco, США) после перевязки передней нисходящей коронарной артерии у взрослых крыс (опытная группа, n=15). Животным контрольной группы (n=15) интрамиокардиально выполняли 4 инъекции (по 50 мкл каждая) среды M199 без добавок. Животных выводили из эксперимента через 14 сут. после трансплантации клеточного препарата.
Морфометрический анализ
Перед забором сердец в полость миокарда ЛЖ вводили 0,1 мл насыщенного раствора KCl, что приводило к остановке сокращений в диастолу. Предсердия и крупные сосуды иссекали, сердца промывали нормальным физиологическим раствором, помещали в криосреду Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek USA Inc, Япония) и замораживали в жидком азоте. Криосрезы сердец (толщина среза 7 мкм, интервал между срезами в поперечной плоскости от верхушки до основания левого желудочка — 300 мкм) хранили при -700 С. Криосрезы окрашивали с помощью метода Мэллори с использованием следующих растворов: раствор A (1 % кислый фуксин), B (1 % фосфомолибденовая кислота) и C (2 % оранжевый G, 0,5 % метиловый синий, 2 % щавелевая кислота). Зафиксированные криосрезы инкубировали последовательно в растворе А (2 мин.), растворе В (4 мин.) и растворе С (15 мин.), промывая дистиллированной водой после каждого красителями, обезвоживали и монтировали, используя среду на основе ксилола.
Количественный анализ размеров рубца и других морфометрических параметров выполняли с помощью пакета программ MetaMorph® Microscopy Automation & Image Analysis Software (США). Размер инфаркта оценивали на основании подсчета площади рубца по отношению к площади левого желудочка, выраженного в процентах. Для подсчета средней толщины поврежденной стенки ЛЖ использовали измерение толщины рубца
в 3 местах. Полученные значения усреднялись. Для количественного определения степени дилатации ЛЖ применяли модифицированный метод Хохмана [14]:
Индекс дилатации = (площадь полости лЖ/общая площадь лЖ) х (средняя толщина неповрежденной области лЖ/средняя толщина стенки лЖ в зонах риска).
Индекс трансмурального поражения рассчитывали по формуле [14]:
Индекс трансмурального поражения (%) = длина трансмурального инфаркта, затрагивающая эпикард/ общая длина инфаркта.
Гистологическая оценка состояния трансплантированных клеток, васкуляризации и активации клеток эпикарда
Замороженные криосрезы миокарда фиксировали 3,7 % параформальдегидом (20 мин.) и промывали ФСБ (5 мин.). При проведении оценки внутриклеточных маркеров дополнительно проводилась обработка срезов 0,1% раствором Тритона X-100 (5 мин.). Срезы миокарда блокировали раствором, содержащим 1 % БСА, 10 % сыворотки донора вторых антител в ФСБ (30 мин.). После этого кри-осрезы окрашивали антителами к маркерам Ki-67 (Abcam, США), cleaved caspase-3 (Cell signaling, США), Pecam (CD31) (Becton Dickinson, США), a-SMA FITC (Sigma-Aldrich, США) или WT1 (Abcam, США) в течение 1 ч., промывали и окрашивали антителами, конъюгированными с AlexaFluor488 (Invitrogen, США, 1:800, 1 ч. при 37 °С).
Анализ плотности капиллярной сети в периинфаркт-ной области включал подсчет CD31-позитивных структур на мм2 площади периинфарктной области; количество артериолов на мм2 оценивалось как количество a-SMA-положительных сосудов с хорошо видимым CD31 + внутренним слоем. Подсчет проводили в программе Imaje J software.
Количество Wt1 + клеток эпикарда оценивали на срезах миокарда, полученных на 14 сут. после трансплантации ПКС или среды M199, с помощью ручного подсчета на мм2 площади эпикарда в программе Imaje J software.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Рибонуклеиновую кислоту выделяли из с-кй+-ПКС 3 пассажа с помощью набора для выделения РНК Quiagen (Quiagen, США). Синтез комплиментарной дезок-сирибонулеиновой кислоты проводили с применением набора реагентов «Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit» (ThermoScientific, США). Полимеразную цепную реакцию осуществляли на амплификаторе StepOnePlus Real-Time PCR System (ThermoScientific, США) по стандартному протоколу с использованием следующих прай-меров: HGF (for: CCAGCTAGAAACAAAGACTTGAAAGA rev: GAAATGTTTAAGATCTGTTTGCGTT), VEGF (for: ACTG-GACCCTGGCTTTACTG; rev: ACGCACTCCAGGGCTTCATC), ангиопоэтин-1 (for: GTGGCTGGAAAAACTTGAGA rev: TGGATTTCAAGACGGGATGT) и ангиопоэтин-2 (for: GAC-CAGTGGGCATCGCTACG rev: CTGGTTGGCTGATGCTACTG).
Микроскопия и анализ изображений
Клетки и криосрезы миокарда анализировали на флуоресцентном микроскопе Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, германия) с программным обеспечением Axiovision 3.1 (Carl Zeiss, германия).
Статистический анализ данных
Данные представлены в формате среднее значение ± стандартное отклонение (в ряде случаев стандартная ошибка среднего значения). Оценку
статистической значимости различий проводили с использованием Ы-критерия Манна-Уитни и программного пакета Statistica 8.0 (Statsoft, США).
результаты
С-№-ПКС были получены из миокарда крыс с помощью метода эксплантной культуры и иммуномагнитной селекции с антителами к маркеру стволовых/прогени-торных клеток с-кй. При анализе иммунофенотипа полученных клеток было обнаружено, что маркер с-кй присутствует на поверхности более чем 90 % клеток (рис. 1А). Маркеры С1334 и С1345 выявлены не были, что исключает костномозговое происхождение популяции этих клеток. Отсутствие маркеров РЕСАМ (С031), С034 в выделенной популяции исключает наличие в ее составе и эндоте-лиальных прогениторных клеток, и клеток зрелого эндотелия [15, 16]. Часть клеток экспрессировала маркеры «стволовости» 0й4, 1\1апод, что является подтверждением их способности к самообновлению с сохранением их низ-кодифференцированного состояния в выбранных условиях культивирования (рис. 1 В). С помощью ПЦР в реальном времени было показано, что резидентные ПКС экспрес-сируют основные проангиогенные факторы роста (УЕЭР, НЭР, ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2), что может указывать на их ангиостимулирующую активность (рис. 1Б).
А
Б
В
VEGF HGF Ang 1 Ang 2
C-kit Oct 3/4 Nanog
CD31 ^Hh^^L ; MHC Phall Gata 6 SMA
рис. 1. Культуры резидентных ПКС: A — экспрессия c-kit, CD31 и гематопоэтических маркеров (CD34, CD45) проточная цитофлуориметрия; Б — экспрессия генов проангиогенных факторов роста (VEGF, HGF, ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2); В — иммунофлуоресцентная реакция с антителами к c-kit и маркерам плюрипотентности (Oct %, Nanog); Г — иммунофлюоресцентная реакция с антителами к маркерам эндотелия (CD31 — Pecam), кардиомиоцитов (тяжелые цепи миозина) и гладкомышечных клеток (Gata 6, a-SMA) после культивирования в дифференцировочных средах
При изучении мультипотентной дифференцировки С-№-ПКС с помощью культивирования в дифференцировочных средах с соответствующими индукторами было обнаружено, что полученные ПКС обладают способностью к мультипотентной дифференцировке (формированию предшественников эндотелильных, гладкомышечных клеток и кардиомиоцитов) (рис. 1 Г), что соответствует ранее заявленным свойствам этих клеток [8].
Процесс раннего ремоделирования левого желудочка начинается в первые сут. после возникновения инфаркта миокарда и приводит к повреждению и изменению структурной организации как первичной зоны повреждения, так и зоны сохраненного миокарда ЛЖ. Для воздействия на процессы раннего постинфарктного ремоделирования С-№-ПКС вводили интрамиокардиально в периинфаркт-ную область в острую фазу инфаркта миокарда. Было выявлено, что трансплантированные клетки локализуются в виде обширных скоплений и практически не мигрируют из зоны первичного введения. Только около одной пятой клеток в зоне трансплантации сохраняли способность к пролиферации, о чем свидетельствует экспрессия маркера Ю67 (2061±429 Ю67+-ПКС на 10х103 трансплантированных клеток) (рис. 2А). Также было показано, что часть трансплантированных клеток экспрессировали маркер Ресат (С031) (рис. 2Б), что косвенно указывает на их дифференцировку в эндотелиальном направлении.
Ki67 ПКС ; „ Г * [ * ПКС1. : ^ V 1 М
ч 1) 1 ' 4 t VV'A V- i л V' 7,*
А Б
рис. 2. Характеристика состояния ПКС после трансплантации в миокард, иммунофлуоресцентные реакции с антителами к: А — Ю67; Б — Сй31. Трансплантированные клетки мечены флуоресцентным красителем СмйН (красное окрашивание)
При количественном анализе площади рубцовой ткани было обнаружено, что достоверных различий между опытной (трансплантация ПКС) и контрольной группами нет (рис. 3). Отсутствие различий в объеме повреждения (зоне рубца) подтолкнули к исследованию второго важного показателя ремоделирования — степени дилатации полости лЖ. расширение полости лЖ в остром периоде ИМ относится к компенсаторному механизму, поддерживающему систолический объем лЖ. При этом оно является специфическим признаком наступления внезапной смерти и развития сердечной недостаточности [17, 18]. Трансплантация ПКС способствовала статистически значимому снижению расширения полости лЖ (рис. 3). в основе снижения уровня дилатации лЖ могло лежать уменьшение величины трансмурального поражения стенки ЛЖ [19]. Париетальное истончение области инфаркта лЖ является следствием снижения сопротивления пораженного миокарда во время систолического напряжения при каждом сокращении и осуществляется за счет нескольких механизмов, включающих растяжение миоцитов с уменьшением их диаметра и скольжение миоцитов по отношению друг к другу. Истончение стенки ЛЖ определяется обширностью поражения, т. е. развитием трансму-рального поражения при котором происходит поражение
клеток во всей толще сердечной стенки. Было обнаружено, что трансплантация ПКС способствует уменьшению распространенности трансмурального повреждения, что является важнейшим показателем восстановления сократительной способности миокарда, уменьшения негативного ремоделирования и снижения риска развития сердечной недостаточности.
Размер инфаркта
Трансмуральное поражение ЛЖ
Индекс дилатации
III
ПКС "Контроль ПКС ^Контроль мПКС п Контроль
Рис. 3. Ремоделирования миокарда левого желудочка через 14 сут. после инфаркта миокарда
Возможным механизмом снижения уровня дилатации ЛЖ и трансмурального поражения является раннее восстановление кровоснабжения в зоне повреждения. Через 14 сут. после трансплантации ПКС количество артериол на мм2 площади в периинфарктной области в опытной группе было значительно выше, чем в группе контроля (рис. 4). Однако эти клетки не несли флуоресцентного маркера (CM Dil) трансплантированных клеток, что исключает возможность их образования из инъецированных клеток. В связи с этим внимание было обращено на клетки эпикарда, которые являются источником васкулогенных клеток-предшественников в эмбриогенезе и постнатальном сердце [20, 21]. Как известно, экспрессия транскрипционного фактора Wt1 — это признак активации эпикарда [22].
A
Инъекции ПКС
I Контроль а ПКС
□ Контроль вПКС
Рис. 4. Васкуляризация периинфарктной области сердца после трансплантации ПКС и в группе контроля: А — иммунофлуоресцентная реакция миокарда крысы антителами к Сй31 (РЕСАМ) (красный) и а-БМА (зеленый), ядра окрашены йАР1; Б — количественная оценка капилляров и артериол в периинфарктной области
Было выявлено, что трансплантация ПКС способ-ствовует активации клеток эпикарда и увеличению
количества Wt1+-клеток в зоне повреждения (рис. 5А, Б). ПКЭ, экспрессирующие Wt1, появляются в значительном количестве в виде «веретенообразного» слоя на наружной поверхности миокарда (рис. 5А). При этом часть из них мигрирует в субэпикардиальное пространство и миокард. Оценка колокализации маркеров эндо-телиальных и гладкомышечных клеток показала, что часть WT1 входят в состав новообразованных сосудов (рис. 5В, Г). При этом совпадения окрашивания с глад-комыщечными клетками наблюдались только в области субэпикарда, с эндотелиальными клетками (маркер РЕСАМ) — как в субэпикарде, так и в миокарде.
А
л 1
Г
Wt1
В
CD31 Wt1
Г
jp
SMA Wt1
Б
350
СУ
к
200
150
100
л о К
П Контроль В ПКС
*
Рис. 5. Прогениторные клетки эпикарда через 14 сут. после трансплантации ПКС и в группе контроля: А — иммунофлуоресцентная реакция ткани миокарда с антителами к Wt1 (контрольная группа (слева), трансплантация ПКС (справа); Б — количественная оценка Wt1 +-клеток в группе контроля и после трансплантации ПКС; В — иммунофлуоресцентная реакция ткани миокарда с антителами к Wt1 и Сй31; Г — иммунофлуоресцентная реакция ткани миокарда с антителами к Wt1 и а-БМА
Обсуждение
Результаты проведенных исследований позволяют утверждать, что трансплантация с-№-ПКС оказывает значительное влияние на регенеративные процессы в постинфарктном сердце. Интрамиокардиальное
введение клеток способствовало достоверному уменьшению постинфарктного ремоделирования ЛЖ (снижение индекса дилатации, распространенности транс-мурального поражения), что может служить важным индикатором снижения риска развития сердечной недостаточности и внезапной сердечной смерти. В основе уменьшения негативного ремоделирования сердца может лежать активация артериогенеза в зоне повреждения [23], индуцированная трансплантацией прогени-торных клеток. Основу постнатального васкулогенеза составляют три основных механизма: ангиогенез, связанный с прорастанием зрелых эндотелиальных клеток из существующих сосудов под действием градиента проангиогенных факторов роста [23], неоваскулоге-нез на основе циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (ЭПК) из костного мозга [15] и адаптивный артериогенез, связанный с образованием коллатералей из предсуществующих артериальных анастомозов [23]. Последние исследования показали [24], что после повреждения формирование новых коронарных сосудов происходит исключительно за счет пролиферации предсуществующих эндотелиальных клеток, а не за счет циркулирующих предшественников. Эти результаты указывают на то, что в миокарде содержится эндогенный пул клеток для формирования новых сосудов. Источником этих клеток могут быть резидентные ПКС, которые локализуются в специализированных «васкулярных клеточных нишах» [25] и после повреждения способны дифференцироваться в направлении эндотелиальных, гладкомышечных клеток и перицитов [26]. В нашем исследовании после трансплантации ПКС сохранялись в миокарде, однако формировали лишь небольшое количество сосудов в зоне повреждения. Причиной ограниченной васкулогенной дифференцировки ПКС может служить их повреждение и массивная гибель при трансплантации в зону ишемии [27]. Следовательно, должен существовать другой источник эндотелиальных клеток для формирования значительного количества сосудов в зоне повреждения de novo. Вероятным источником эндотелиальных клеток является эпикард. Эпикард представляет собой тонкое пленчатое образование, покрывающее миокард предсердий и желудочков и сформированное из крупных полигональных клеток плоского эпителия (мезо-телия) и сети коллагеново-эластических волокон. В период эмбрионального развития прогениторные клетки эпикарда (ПКЭ) взаимодействуют между собой, формируют сосудистое сплетение, которое впоследствии разрастается, соединяется с аортой, образуя коронарную сеть будущего сердца [28]. ПКЭ, характеризующиеся экспрессией маркера Wt1, развиваются из мезотелия эпикарда в результате эпителиально-мезенхимального перехода, обусловленного сложными биохимическими перестройками клеток эпикарда, приводящими к приобретению ими мезенхимального фенотипа, устойчивости к апоптозу, повышению миграционных, адгезивных свойств и секреторной активности. Недавно было показано, что этот процесс происходит не только в эмбриональном, но и в постнатальном сердце млекопитающих. Ученые доказали, что эпителиально-мезенхимальный
ЛИТЕРАТУРА
1. Cochain C., Channon K.M., Silvestre J.S. Angiogenesis in the infarct-ed myocardium. Antioxid. Redox Signal. 2013; 18(9): 1100-13.
2. Shah A.M., Mann D.L. In search of new therapeutic targets and strategies for heart failure: recent advances in basic science. Lancet 2011; 378(9792): 704-12.
3. Battegay E.J. Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects. J. Mol. Med. 1995; 73(7): 333-46.
переход вызывает образование ПКЭ и их дифференци-ровку в эндотелиальные клетки, формирующие в миокарде новые сосуды [29]. При этом клетки эндотелия секретируют ростовые факторы, запускающие диф-ференцировку ПКЭ в перициты и гладкомышечные клетки, инициирующие сборку и стабилизацию новых сосудов [30]. Мы обнаружили, что трансплантация ПКС способствует активации пула WtV-ПКЭ, формированию сосудистых предшественников и стимуляции артериогенеза в зоне повреждения. Вероятным механизмом активации эпикарда и стимуляции ангиогенеза является секреция трансплантированными клетками проангиогенных факторов роста, а также экзосом/ микровезикул. в нашем исследовании было показано, что ПКС крысы экспрессируют гены проангиогенных факторов роста: HGF, VEGF, ангиопоэтин-1 и ангио-поэтин-2 (рис. 1Б). Кроме того, они продуцируют значительное количество различных цитокинов, включая хемокины (TCA-3, SDF-1), сосудистые факторы роста (VEGF, эритропоэтин, bFGF, остеопонтин, SCF) и факторы-регуляторы дифференцировки сердца (Activin A, Dkk homolog-1, TGF-p), секретируемых в виде белков или упакованных в микровезикулы, свойства которых потенциально могут объяснить терапевтические эффекты ПКС [31]. Известно, что паракринные факторы ПКС, такие как Ang-1, bFGF, HGF, IGF-1, PDGF, SCF, SDF-1 и VEGF, обладают кардиозащитными свойствами и способны стимулировать неоваскуляризацию миокарда [32]. Факторы, продуцируемые трансплантированными ПКС, также могут быть сигналами-индукторами эпителиально-мезенхимального перехода клеток эпикарда. Это прежде всего факторы роста сосудистого эндотелия (VEGF) [33], тромбоцитарный фактор роста PDGF [34, 35], трансформирующий фактор роста бета (TGF beta) [36], морфогенетические белки костной ткани (BMP) [37]. Эти факторы, упакованные в везикулы не только активируют эпителиально-мезенхимальный переход, но и способствуют миграции эндотелиальных клеток-предшественников и подавлению апоптоза [38].
Таким образом, c-kir-ПКС выступают в качестве важного регулятора процессов васкуляризации постинфарктного сердца. Наряду со способностью ПКС дифференцироваться в эндотелиальном направлении они, вероятно, за счет обмена экзосомами/микровезикулами и действия проангиогенных ростовых фактором, могут активировать пул прогениторных клеток эпикарда и стимулировать ангиогенное поведение эндотелиальных клеток. Это ведет к формированию новых сосудов в зоне повреждения. Раннее формирование сосудов в зоне рубца улучшает трофику ишемизированной ткани, обеспечивая выживаемость кардиомиоцитов и клеток сосудов, уменьшение негативного ремоделирования и прогресси-рования сердечной недостаточности.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов российского научного фонда № 16-15-00181 и российского фонда фундаментальных исследований № 18-015-00438 (исследование Wt1-положительных клеток эпикарда).
4. Meoli D.F., Sadeghi M.M., Krassilnikova S. et al. Noninvasive imaging of myocardial angiogenesis following experimental myocardial infarction. J. Clin. Invest. 2004; 113(12): 1684-91.
5. Uchida Y., Yanagisawa-Miwa A., Nakamura F. et al. Angiogenic therapy of acute myocardial infarction by intrapericardial injection of basic fibroblast growth factor and heparin sulfate: an experimental study. Am. Heart J. 1995; 130(6): 1182-8.
6. Gyöngyösi M., Wojakowski W., Lemarchand P. et al. Meta-analysis of cell-based CaRdiac stUdiEs (ACCRUE) in patients with acute myocardial infarction based on individual patient data. Circ. Res. 2015; 116(8): 1346-60.
7. Scimia M.C., Gumpert A.M., Koch W.J. Cardiovascular gene therapy for myocardial infarction. Expert Opin. Biol. Ther. 2014; 14(2): 183-95.
8. Bearzi C., Rota M., Hosoda T. et al. Human cardiac stem cells. PNAS USA 2007; 104(35): 14068-73.
9. Bolli R., Chugh A.R., D'Amario D. et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet 2011; 378(9806): 1847-57.
10. Fazel S., Cimini M., Chen L. et al. Cardioprotective c-kit+ cells are from the bone marrow and regulate the myocardial balance of angiogenic cytokines. J. Clin. Invest. 2006; 116(7): 1865-77.
11. Kajstura J., Urbanek K., Perl S. et al. Cardiomyogenesis in the adult human heart. Circ. Res. 2010; 107(2): 305-15.
12. Dergilev K.V., Makarevich P.I., Tsokolaeva Z.I. et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermo-responsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell 2017; 49(1): 64-71.
13. Traktuev D.O., Tsokolaeva Z.I., Shevelev A.A. et al. Urokinase gene transfer augments angiogenesis in ischemic skeletal and myocardial muscle. Mol. Ther. 2007; 15(11): 1939-46.
14. Hochman J.S., Choo H. Limitation of myocardial infarct expansion by reperfusion independent of myocardial salvage. Circulation 1987; 75(1): 299-306.
15. Asahara T., Murohara T., Sullivan A. et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275(5302): 964-7.
16. Lin C.S., Lue T.F. Defining vascular stem cells. Stem Cells Dev. 2013; 22(7): 1018-26.
17. Meizlish J.L., Berger H.J., Plankey M. et al.Functional left ventricular aneurysm formation after acute anterior transmural myocardial infarction. Incidence, natural history, and prognostic implications. N. Engl. J. Med. 1984; 311(16): 1001-6.
18. Xiao Y., Ding L., Chen H. et al. Grain-Moxibustion may Protect Myocardium by Reducing Oxidative Stress in Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2016; 41(6): 502-8.
19. Paul A., Mitra A., Kohli V. et al. Anaesthetic challenges for device closure of post-infarct ventricular septal defect with coronary angioplasty. Ann. Card. Anaesth. 2003; 6(1): 52-5.
20. Duim S.N., Smits A.M., Kruithof B.P. et al. The roadmap of WT1 protein expression in the human fetal heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 2016; 90: 139-45.
21. Duim S.N., Kurakula K., Goumans M.J. et al. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarct-ed heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 2015; 81: 127-35.
22. Xlang F.L., Liu Y., Lu X. et al. Cardlac-speclflc overexpresslon of human stem cell factor promotes eplcardlal activation and arterlogenesls after myocardial lnfarctlon. Clrc. Heart Fall. 2014; 7(5): 831-42.
23. Carmellet P., Jain R.K. Angiogenesis in health and disease. Nat. Med. 2003; 9: 653-60.
24. He L., Huang X., Kanisicak O. et al. Preexisting endothelial cells mediate cardiac neovascularization after injury. J. Clin. Invest. 2017; 127(8): 2968-81.
25. Gómez-Gavlro M.V., Lovell-Badge R., Fernández-Avllés F. et al. The vascular stem cell niche. J. Cardlovasc. Transl. Res. 2012; 5(5): 618-30.
26. Bearzi C., Lerl A., Lo Monaco F. et al. Identifikation of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. PNAS USA 2009; 106(37): 15885-90.
27. Hamdl H., Furuta A., Bellamy V. et al. Cell delivery: intramyocardlal injections or eplcardlal deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 2009; 87(4): 1196-203.
28. Bogers A.J., Glttenberger-de Groot A.C., Poelmann R.E. et al. Development of the origin of the coronary arteries, a matter of ingrowth or outgrowth? Anat. Embryol. (Berl.) 1989; 180(5): 437-41.
29. Reese D.E., Mlkawa T., Bader D.M. Development of the coronary vessel system. Clrc. Res. 2002; 91(9): 761-8.
30. Van den Akker N.M., Winkel L.C., Nisancioglu M.H. et al. PDGF-B signaling is important for murine cardiac development: its role in developing atrioventricular valves, coronarles, and cardiac innervation. Dev. Dyn. 2008; 237(2): 494-503.
31. Tang Y., Wu X., Lei W. et al. TGF-beta1-induced migration of bone mesenchymal stem cells couples bone resorption with formation. Nat. Med. 2009; 15(7): 757-65.
32. Chimenti I., Smith R.R., Li T.S. et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Clrc. Res. 2010; 106: 971-80.
33. Tomanek R.J., Ratajska A., Kitten G.T. et al. Vascular endothelial growth factor expression coincides with coronary vasculogenesls and angiogenesis. Dev. Dyn. 1999; 215(1): 54-61.
34. Folkman J., D'Amore P.A. Blood vessel formation: what is its molecular basis? Cell 1996; 87(7): 1153-5.
35. Kamlnskl W.E., Llndahl P., Lin N.L. et al. Basis of hematopoietic defects in platelet-derived growth factor (PDGF)-B and PDGF beta-receptor null mlce. Blood 2001; 97(7): 1990-8.
36. Austin A.F., Compton L.A., Love J.D. et al. Primary and immortalized mouse eplcardlal cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Dev. Dyn. 2008; 237(2): 366-76.
37. Elsenberg L.M., Markwald R.R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Clrc. Res. 1995; 77(1): 1-6.
38. Vrljsen K.R., Sluljter J.P., Schuchardt M.W. et al. Cardlomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migration of endothelial cells. J. Cell. Mol. Med. 2010; 14: 1064-70.
Поступила: 22.112017
