CC BY
15
УДК 546 Е.А. Левина
Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия, 125047, Москва, Миусская пл., д. 9
e-mail: evgeniya.levina@gmail.com
ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ О-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ПОЛИСАХАРИДА PROTEUS PENNERI Br114
Аннотация
Липополисахарид (ЛПС) является фактором вирулентности грамотрицательных бактерий. Его O-полисахарид (ОПС) цепь называется О-антиген определяет иммуноспецифичность штаммов и используется для их серотипирования. В Proteus, уплотнительные антигены весьма разнообразны, и на основе их специфики 79 О серогрупп были созданы и обоснованы выяснения структуры OPS. Тем не менее, многие штаммы Proteus не вписывается в существующую серологического схемы классификации. В этой работе, мы изучали такой штамм Proteus penneri, Br114 из Польши.
Кислотные вывода полисахарид получают путем деградации слабой кислотой ЛПС, и его структура была установлена с помощью сахара и метилирование анализ наряду с высоким разрешением 1D и 2D 1Н и 13С ЯМР-спектроскопии. ОПС Br114 имеет разветвленную повторяющееся звено, содержащее амид L серин с D-глюкуроновой кислоты:
-50% АсО-4-|
4)-ß-D-Gal^NAc-( 1 —3)-a-D-Galp-( 1 —»-3)-ß-D-GlcpA-( 1 —>-3)-ß-D-Ga1/?NAc-( 1 ß-D-GalpNAc-(l-^3)J L-Ser—»-6)-l
Структура является уникальной среди известных бактериальных полисахаридов. Таким образом, серологические и структурные данные показывают, что штаммы изучали должны быть классифицированы в новом Proteus О-серогруппы 080 для П. penneri Br114.
Ключевые слова: Proteus penneri, липополисахарид, О-антиген, структура бактериального полисахарида, L-серин
О-Специфический полисахарид P. penneri Br114 был выделен мягким кислотным гидролизом липополисахарида с последующей гель-проникающей хроматографией на колонке с носителем Sephandex G-50. Полный кислотный гидролиз ОПС с последующим превращением высвободившихся моносахаридов в ацетаты полиолов и анализом методом ГЖХ выявил наличие галактозы (Gal) и N-ацетилгалактозамина (GalNAc). D-Конфигурация Gal и GalNAc установлена методом ГЖХ ацетилированных (5)-2-октилгликозидов. Исследование гидролизата полисахарида на углеводном анализаторе дополнительно показало присутствие глюкуроновой кислоты (GlcA). D-Конфигурация GlcA была определена на основании анализа эффектов гликозилирования в спектре 13C ЯМР [1, с. 735-747] (см. далее).
Спектр 13С ЯМР ОПС (рис. 1, а) выявил структурную гетерогенность, которая, судя по присутствию сигнала О-ацетильной группы при 21,5 м.д., вызвана нестехиометрическим
О-ацетилированием одного из моносахаридов. О-дезацетилирование ОПС обработкой 12% NH4OH привело к полимеру с типичным для регулярного полисахарида спектром 13C ЯМР (рис. 1, б).
Спектр 13С-ЯМР полисахарида P. penneri Br114 (рис. 1, б) содержит сигналы пяти различных моносахаридных остатков, включая сигналы пяти аномерных атомов углерода (C-1) при 5 100.3-105.5,
четырех атомов углерода, связанных с азотом, (C-2 GalNAc, С-2 Ser) при 5 52.0, 52.5, 53.6, 57.8, трех N-ацетильных групп при 5 23.5, 23.5, 23.6 (CH3) и 175.4, 175.6 (СО) и одной карбоксильной группы (С-6 GlcA) при 5 176.6. Соответственно спектр 1Н-ЯМР содержит среди прочих сигналы пяти аномерных протонов (H-1) при 5 4.46-5.35 и N-ацетильных групп при 5 2.03-2.08.
Спектры 1Н- и 13С-ЯМР полисахаридов были отнесены с использованием двумерных корреляционных экспериментов 1H,1H-COSY. TOCSY, ROESY, 1H,13C-HSQC и 1H,13C-HMBC с детектированием протонов. Спектры COSY и TOCSY выявили спиновые системы всех моносахаридных остатков повторяющихся звеньев. Конфигурации гликозидных связей были определены по величинам КССВ J12 для моносахаридных остатков с глюко- и галакто-конфигурацией (J12 3-4 Гц для а-гексопираноз и J12 7-8 Гц для Р-гексопираноз).
Эксперименты ROESY и HMBC были использованы для определения положения замещения и последовательности моносахаридных остатков. Эти данные вытекали из присутствия межзвеньевых корреляционных пиков в спектре ROESY между аномерными протонами и протонами при связевых атомах углерода, а в спектре HMBC -между аномерными протонами и связевыми атомами углерода гликозилирующего моносахаридного остатка.
105 IOO 95 90 85
„-Р-
55
50 45 40 3 5 30 25 20 ррт
Рис. 1 Спектр 13С-ЯМР полисахарида (а) и О-дезацетилированиого полисахарида (б) Р. penneri Вг114.
В спектре ROESY полисахарида P. penneri Br114 наблюдались следующие корреляционные пики: Р-GalNAc H-1/a-Gal H-3; p-GalNAc H-1/p-GalNAc Н-3; a-Gal Н-1/p-GlcA H-3; p-GlcA H-1/p-GalNAc H-3 и p-GalNAc H-1/p-GalNAc Н-4 при 5 4.61/3.96, 4.46/3.87, 5.35/3.70, 4.67/3.90 и 5.01/3.71 соответственно. Типы замещения моносахаридов были подтверждены значительным смещением в слабое поле за счет эффекта гликозилирования сигналов С-3 P-GalNAc, С-4 p-GalNAc, C-3 a-Gal, С-3 p-GlcA и p-GalNAc (к 5с 80.1, 76.1, 80.0, 82.1 и 82.3) по сравнению с положением этих сигналов в спектрах незамещенных моносахаридов.
Указанная последовательность моносахаридных остатков и типы их замещения дополнительно и независимым образом подтверждались анализом спектра HMBC, в котором присутствуют корреляционные пики аномерных протонов и трансгликозидных атомов углерода за счет наличия небольшой константы 3JH,C через три связи (2-5 Гц), включая гликозидную. В данном случае наблюдались
корреляционные пики P-GalNAc Н-1/p-GalNAc С-3 (5 4.46/80.1), p-GlcNAc Н-1/a-Gal С-3 (5 4.61/80.0), а-Gal Н-1/p-GlcA C-3 (5 5.35/82.1) и p-GlcA H-1/p-GalNAc C-3 (5 4.67/82.3).
ROESY эксперимент для полисахарида P. penneri Br114, растворенного в смеси H2O/D2O (9:1) позволил определить локализацию аминокислоты и ацетильных групп в повторяющемся звене. Присутствие в спектре корреляционного пика Н-5 GlcA и NH Ser при 5 3.97/8.09 говорит о том, что глюкуроновая кислота образует амид с серином.
ГЖХ-масс-спектрометрический анализ частично метилированиях ацетатов полиолов, полученных из ПС, привел к идентификации производных 3-замещенной гексозы, а также 3,4-замещенного, 3-замещенного и терминального гексозамина.
Таким образом, в ходе нашей работы было установлено, что полисахарид P. penneri, относящийся к серогруппе Br114, имеет новую, ранее не встречавшиеся структуру повторяющегося звена следующего строения:
-50% АсО-4
1
'4)-p-D-Ga^NAc-(1^3)-a-D-Gal^-(1^3)-ß-D-GlcM-(l-^3)-p-D-Gal/?NAc-(l-
ß-D-GalpNAc-(l-*3)
J
L-Ser-^6)
J
Эти данные послужат вкладом в создание химической основы классификации бактерий Proteus.
Левина Евгения Александровна - Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, студент 2 курса, г. Москва, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, г. Москва
e-mail: evseniva.levina@smail.com
Литература
1. Shashkov A.S., Lipkind G.M., Knirel Y.A., Kochetkov N.K. Stereochemical factors determining the effects of glycosylation on the 13C chemical shifts in carbohydrates //Magn. Reson. Chem. 1988, 26, 735-747.
STUDYING THE SYRUCTURE OF O-SPECIFIC POLYSACCHARIDE PROTEUS PENNERI Br114
Abstrac: Lipopolysaccharide (LPS) is a virulence factor of Gram-negative bacteria. Its O-polysaccharide (OPS) chain called O-antigen defines the immunospecificity of strains and is used for their serotyping. In Proteus, the O-antigens are highly diverse, and based on their serospecificity, 79 O-serogroups have been established and substantiated by elucidation of the OPS structures. However, many Proteus strains do not fit in the existing serological classification scheme. In this work, we studied such strain of Proteus penneri, Br114 from Poland.
Acidic O-polysaccharide was obtained by mild acid degradation of the LPS, and its structure was established by sugar and methylation analyses along with high-resolution 1D and 2D 1H and 13C NMR spectroscopy. The Br114 OPS has a branched repeating unit containing an amide of L-serine with D-glucuronic acid:
-50% AcO-4-|
P-D-Gal^NAc-(l-^3)J L-Ser-^6)J
The structure is unique among known bacterial polysaccharides. Therefore, the serological and structural data suggest that the strains studied must be classified into new Proteus O-serogroup O8O for P. penneri Br114.
Key words: Proteus penneri; lipopolysaccharide; O-antigen; bacterial polysaccharide structure; L-serine
