CC BY
34DOI: 10.6060/tcct.20186101.5454 УДК: 547.52/.68:577.15
ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБА ПЕРЕРАБОТКИ ЦЕЛЛЮЛОЗНОГО И ЛИГНИНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Н.В. Лакина, В.Ю. Долуда, Э.М. Сульман, И.П. Шкилева, О.С.Бурматова
Наталия Валерьевна Лакина*, Валентин Юрьевич Долуда, Эсфирь Михайловна Сульман, Ирина Павловна Шкилева, Ольга Сергеевна Бурматова
Кафедра биотехнологиии и химии, Тверской государственный технический университета, наб. А. Никитина 22, г. Тверь, Российская Федерация, 170026
E-mail: lakina@yandex.ru*, doludav@yandex.ru, sulman@online.tver.ru, shkileva@yandex.ru, burmatova_olia.boss@mail.ru
В работе приведены результаты исследования получения биоэтанола и других ценных продуктов гидролитической трансформацией торфа. Определены факторы устойчивости целлюлозолигнинового сырья (торф и древесные опилки) к действию различных гидролизующих агентов. Полученные экспериментальные данные указывают на эффективность предобработки образцов торфа и древесных опилок H2SO4 (90%), которая выражается в наиболее высоком выходе редуцирующих веществ в ходе гидролиза образцов, по сравнению с результатами, полученными при предобработке H2SO4 с более низкой концентрацией. В работе приведены результаты гидролиза целлюлозосодержащего сырья различными способами, включая ферментативную обработку. В качестве ферментативного комплекса целлюлозолитических ферментов использовался отечественный ферментный препарат - Целловиридин, содержащий как экзо-, так и эндо-ферменты. Качественный и количественный анализ продуктов гидролиза целлюлозо- и лигнинсодержа-щего сырья проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Было установлено, что максимальная скорость накопления глюкозы (конечного продукта гидролитического процесса целлюлозолигнинового сырья) наблюдается при использовании образцов торфа и опилок, предобработанных H2SO4 (90%). В результате применения последующего ферментативного гидролиза целлюлозолигнинового сырья с помощью препарата Целловиридин увеличилось количество D-глюкозы в гидролизате по сравнению с ее количеством на стадии предобработки H2SO4. Представлена сравнительная характеристика эффективности используемого сырья по выходу целевого продукта - D-глюкозы в процессе комбинированного гидролиза целлюлозного и лигнинсодержащего сырья, максимальный выход моносахарида наблюдался при гидролизе образцов торфа. Полученный гидролизный раствор, после соответствующей нейтрализации, может быть использован для получения этанола и бактериальных сред в микробном синтезе продуктов, применяемых в животноводстве, а также в фармацевтической практике.
Ключевые слова: целлюлоза, гидролиз, ферменты, D-глюкоза, биоэтанол
STUDY OF METHOD OF PROCESSING CELLULOSIC AND LIGNIN-CONTAINING RAW MATERIALS USING CELLULOLYTIC ENZYMES
N.V. Lakina, V.Yu. Doluda, E.M. Sulman, I.P. Shkileva, O.S. Burmatova
Natalia V. Lakina*, Valentin Yu. Doluda, Esfir M. Sulman, Irina P. Shkileva, Olga S. Burmatova
Department of Biotechnology and Chemistry, Tver State Technical University, Nab. A. Nikitina, 22, Tver, 170026, Russia
E-mail: lakina@yandex.ru*, doludav@yandex.ru, sulman@online.tver.ru, shkileva@yandex.ru, burmatova_olia.boss@mail.ru
In the research the results of bioethanol and other valuable products formation are described during peat hydrolytic formation. The factors of cellulose-lignin raw materials (peat and wood sawdust) stability to the action of various hydrolyzing agents were determined. The obtained experimental data indicate the efficiency of peat and sawdust samples pre-treatment with H2SO4 (90 wt.%), which is expressed in the highest yield of reducing substances during hydrolysis of the samples, in comparison with the results obtained with H2SO4 pretreatment of a lower concentration. The article shows the results of cellulose-containing raw materials hydrolysis process study with various ways, including enzymatic treatment. Enzyme complex sample of Celloviridine, containing both exo-and endo-enzymes, was used. Qualitative and quantitative analysis of the cellulose-lignin-containing raw materials hydrolysis products was carried out using high-performance liquid chromatography. It was found that the maximum rate of glucose accumulation (the final product of the hydrolyticprocess of cellulose-lignin raw materials) was observed when using samples of peat and sawdust pretreated with H2SO4 (90wt.%). As a result of cellulosulignin raw material subsequent enzymatic hydrolysis, the amount of D-glucose in the hydrolyzate increased with the help of the Celloviridin preparation in comparison with its amount in the H2SO4 pretreatment. A comparative characterization of the raw material efficiency for the yield of the desired product - D-glucose is shown. In the process of combined hydrolysis of cellulose and lignin-containing raw materials the maximum yield of the monosaccharide was observed during the hydrolysis of peat samples. After appropriate neutralization the resulting hydrolysis solution can be used to produce bioethanol and bacterial biomass in the microbial synthesis of products used for animal feed, as well as for pharmaceutical practice.
Key words: cellulose, hydrolysis, enzyme, D-glucose, bioethanol Для цитирования:
Лакина Н.В., Долуда В.Ю., Сульман Э.М., Шкилева И.П., Бурматова О.С. Изучение способа переработки целлюлозного и лигнинсодержащего сырья с применением целлюлозолитических ферментов. Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2018. Т. 61. Вып. 1. С. 78-83 For citation:
Lakina N.V., Doluda V.Yu., Sulman E.M., Shkileva I.P., Burmatova O.S. Study of method of processing cellulosic and lignin-containing raw materials using cellulolytic enzymes. Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2018. V. 61. N 1. P. 78-83
ВВЕДЕНИЕ
Продолжающееся истощение запасов традиционных источников органического топлива способствует повышению интереса к получению его синтетических аналогов из возобновляемого сырья. Биотопливо второго поколения, получаемое из непищевых источников углеводов и целлюлозо-лигнинового (ЦЛ) сырья, может стать альтернативой нефтяным дистиллятам и природному газу.
Современные способы получения этанола и биогаза из целлюлозолигнинового сырья обладают целым рядом недостатков. Среди основных недостатков необходимо отметить низкий выход целевых продуктов, большое количество агрессивных реагентов и, как следствие, сложность аппаратурного оформления. Преимуществами преобразования ЦЛ сырья с получением этанола является возможность использования как частично возобновляемых ресурсов - таких как торф, так и отходов различных отраслей промышленности [1, 2].
Устойчивость природных ЦЛ-материалов к действию различных гидролизующих агентов определяется в основном двумя факторами:
1) защитной матрицей, образованной лигнином и гемицеллюлозой, в которую погружены целлюлозные фибриллы;
2) кристалличностью природной целлюлозы.
Целлюлоза (рис. 1) представляет собой полимер простого сахара, глюкозы, ковалентно связанного Р-1,4-связями (рис. 1).
CH2OH
O
Рис. 1. Химическая структура целлюлозы Fig. 1. Chemical structure of cellulose
n
В древесине к трудногидролизуемым полисахаридам относится целлюлоза как кристаллический полимер, целлюлозаны - гемицеллюлозы, совместно закристаллизованные с целлюлозой в пара-кристаллической части ее микрофибрилл. Целлюлозаны - это те же самые гемицеллюлозы, т.е. ксиланы и маннаны, но гидролизующиеся только вместе с целлюлозой и труднее извлекаемые щелочами.
Реакции полного гидролиза полисахаридов древесины можно представить следующим уравнением (условным для гексозанов), представленным на схеме 1:
Н+
(С6Нш05)П + nHO -nC6H12O6
Схема. Реакция полного гидролиза полисахаридов древесины Scheme. Reaction of complete hydrolysis of wood polysaccharides
Торф, древесина, отходы сельхозпроизвод-ства, зеленые культуры и коммунально-бытовые твердые отходы рассматриваются в качестве источников получения этанола. Строение древесины представлено на рис. 2. Как видно из рисунка, ЦЛ-материалы прежде всего состоят из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. После преобразования целлюлозы в глюкозу, ее легко ферментировать дрожжами до этанола.
Г°мицеллюлоза
функция укрепление арматуры
Лигнин
функция обязующее Вещество
■ Целлюлоза
функция аркатура
Рис. 2. Строение древесины Fig. 2. Structure of wood
Первичная гидролитическая переработка исходных лигноцеллюлозных субстратов производится: а) физическими методами; б) химическими методами; в) биохимическими методами, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Выход биотрансформируемых сахаров остается небольшим, что связано с образованием побочных продуктов (фурфурол, фурфуриловый спирт, уксусная кислота, ацетальдегид и др). Химический гидролиз ЦЛ-сырья в настоящее время является самым распространенным и широко используемым видом первичной гидролитической переработки биомассы [3].
Однако использование сильных кислот предъявляет особые требования к оборудованию, а также ведет к необходимости очистки большого количества сточных вод. Перспективной альтернативой химического гидролиза ЦЛ-сырья является
биотехнологический способ гидролитической переработки ЦЛ-сырья, который включает применение как микроорганизмов, так и ферментов.
Большое число микроорганизмов продуцируют ферменты, гидролизующие ß-связанные глю-каны. К этим ферментам относятся эндоглю-каназы, целлобиогидролазы и ß-глюкозидазы. Эн-доглюканазы расщепляют целлюлозный полимер в случайных положениях, делая его доступным для воздействия целлобиогидролаз. Целлобиогидро-лазы последовательно высвобождают молекулы целлобиозы с концов целлюлозного полимера. Целлобиоза представляет собой водоростворимый димер глюкозных остатков, связанных ß-l^-свя-зью; ß-глюкозидазы гидролизуют целлобиозу до глюкозы. Глубокий гидролиз целлюлозы осуществляется в результате согласованного действия полиферментной системы [4, 5].
Гидролитическая трансформация биомассы чаще всего производится при помощи микроорганизмов таких как Trichoderma viride, Aspergillus terreus при температуре 35-45 °С, при этом процесс может проводиться на протяжении 3-30 дней, а степень гидролиза сырья составляет до 75-80% [6].
Данные литературных источников указывают на актуальность нахождение новых высокоактивных штаммов микроорганизмов, способных проводить лигно и целлюлозолитическую трансформацию исходного сырья, а также более активных продуцентов биоэтанола и биогаза.
В данной работе изучалась эффективность процесса предобработки 70% и 90% раствором серной кислоты образцов торфа и древесных опилок. На последующем этапе биотрансформации образцов торфа и древесных опилок изучалась эффективность отечественного ферментного препарата Цел-ловиридин, представляющий собой концентрат культуральной жидкости штаммов гриба Tricho-derma viride. Препарат содержит комплекс целлю-лолитических ферментов, включающий геммицел-люлазы, ксиланазы, ß-глюкозидазы и другие ферменты, способные гидролизовать растительные полисахариды с образованием различных видов оли-госахаридов, редуцирующих сахаров, в том числе и глюкозы. Эффективность процесса гидролиза оценивалась по количеству образовавшейся D-глюкозы.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Для проведения исследований использовался верховой торф 30% влажности с 15% степенью разложения, торф отбирался с месторождения Васильевский мох, Калининского района, Тверской области. Также были использованы опилки 30% влажности лиственных и хвойных пород деревьев; для предобработки образцов торфа и опилок использовалась H2SO4 (х.ч., 70%, 90%), препарат ферментный Целловиридин Г20х по ТУ 64-13-11-87.
Степень гидролитической эффективности применяемого метода переработки целлюлозного и лигнинсодержащего сырья оценивали методом отбора проб, определяя содержание редуцирующих веществ (РВ), глюкозы и сухого остатка.
Анализ пробы проводили методом ВЭЖХ (анализатор иШМа1е 3000) с использованием рефрактометрического детектора. Разделение ката-лизата на фракции осуществлялось с помощью колонки Яер1^е1 - Н (500x10 мм, число теоретических тарелок 160000).
Хроматографическое разделение проводили при следующих условиях:
- расход элюента (9 Ммоль раствор Ш804) - 0,5 мл/мин;
- температура колонки 25 °С;
- давление элюента 65 атм;
- время анализа 30 мин.
Качественная идентификация веществ проводилась с использованием эталонов чистых веществ.
Проведение химического гидролиза.
Для этого 10 г торфа (древесных опилок) заливали 1,5 л 70% или 90% раствором серной кислоты и выдерживали суспезию 2 ч при Т = 160 °С. По окончании выдержки смесь охлаждали, фильтровали, промывали образцы на стеклянном фильтре водой и высушивали до постоянной массы.
Предобработанный материал фракционировали. Для работы отбирали фракцию с размерами частиц от 0,8 мм до 3,2 мм. В подготовленных к ферментации образцах определяли влажность, массу сухого остатка, количество глюкозы и редуцирующих сахаров (РВ). Таким образом, было приготовлено 6 образцов, отличающихся методами предобработки. Результаты сведены в таблицу.
Проведение ферментативного гидролиза.
В коническую колбу емкостью 500 см3 помещали 10 г ЦЛ-сырья, 200 см3 ацетатного буфера (рН = 4,7), в котором растворен ферментный препарат Целловиридин. Образец ферментировали в течение 24 ч при 50±2 °С и интенсивном перемешивании. По окончании процесса остаток отфильтровывали под вакуумом, отжимали и высушивали. В гидролизате определяли содержание редуцирующих веществ (РВ) и глюкозы через каждые 3 ч.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование влияния предобработки на количество глюкозы, редуцирующих веществ и сухого остатка в гидролизате.
Данные таблицы показывают, что после предобработки торфа 90% Ш804 (образец №4) массовая
доля сухого целлюлозолигнинового остатка является минимальной (48%) по сравнению с остальными образцами. Это можно объяснить тем, что с увеличением концентрации кислоты степень гидролиза целлюлозы возрастает, и соответственно увеличивается количество растворимых продуктов реакции.
Из результатов, представленных в таблице, видно, что содержание глюкозы и редуцирующих веществ (РВ) в гидролизате исходных торфа и древесных опилок меньше, чем в предобработанных образцах. Данный факт можно объяснить большим содержанием в исходных образцах лигнина, затрудняющего процесс гидролиза целлюлозы. Однако необходимо отметить, что образец торфа №4, предобработанный 90% H2SO4, содержит наибольшее количество глюкозы (39% от исходной навески ЦЛ сырья (и.н.с.)), чем остальные образцы ЦЛ-сырья. Это, очевидно, является следствием предварительной деструкции целлюлозы и образования олигосахаридов, появляющихся в результате ферментативных процессов, производимых сообществами микроорганизмов торфяных геобиоценозов в течение длительного времени.
Таблица
Зависимость выхода глюкозы и редуцирующих веществ от способа предобработки ЦЛ сырья Table. The dependence of glucose and reducing substances
Вид образца Массовая доля сухого остатка от исходной Выход РВ от исходной навески ЦЛ Выход глюкозы от исходной навески ЦЛ сырья, %
навески ЦЛ сырья, % сырья, %
Торф 77 22 15
Древесные опилки 61 19 5
Торф, 70% Н2Б04 60 32 25
Торф, 90% Н2Б04 48 47 39
Торф, 90% Н2Б04, 32 65 58
ферментация
Древесные
опилки, 58 38 9
70% Н2Б04
Древесные опилки, 52 42 15
90% Н2Б04
Древесные
опилки, 34 50 23
90% Н2Б04,
ферментация
В результате проведенного ферментативного гидролиза предобработанных образцов №4 и №6 увеличился выход глюкозы до 58% от и.н.с. и 23% от и.н.с. соответственно; сухой остаток составил 32% от и.н.с. и 34% от и.н.с. соответственно. Полученные результаты указывают на достаточно высокую эффективность последующего процесса ферментации.
Исследование зависимости количества глюкозы от времени ферментации
Образцы №4 и №6 были подвергнуты ферментации с помощью препарата Целловиридин в течение 24 ч. Пробы гидролизата отбирались каждые 3 ч, с помощью метода ВЭЖХ определялось содержание глюкозы (С, мг/мл). Полученные результаты графически отображены на рис. 3.
15
S 5 и
0
0 6 12 18 24
т, ч
Рис. 3. Зависимость концентрации глюкозы в гидролизате от времени ферментации, где 1 - изменение количества глюкозы в образце № 4; 2 - изменение количества глюкозы в образце № 6 Fig. 3. The dependence of the glucose concentration in the hydro-
lyzate on the time of fermentation, where 1 is the change in the amount of glucose in the sample N 4; 2 - changes in the amount of glucose in the sample N 6
Данные эксперимента показывают, что в первые 12 ч наблюдается максимальная скорость образования глюкозы. В гидролизате образца №4
ЛИТЕРАТУРА
1. Хуснутдинов И.Ш., Ахмятзянов А.М., Гаврилов В.И., Заббаров Р.Р., Ханова А.Г. Исследование 1,1-диэтокси-этана как компонента дизельного топлива. Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2009. Т. 52. Вып. 11. С. 119-122.
2. Манаенков О.В., Долуда В.Ю., Филатова А.Е., Макеева О.Ю., Сульман Э.М., Сидоров А.И. Новый тип Ru-содержащего катализатора для процесса гидролитического гидрирования. Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2013. Т. 56. Вып. 8. С. 97-101.
3. Громов Н.В., Таран О.П., Сорокина К.Н., Мищенко Т.И., Утанди Ш., Пармон В.Н. Новые методы одностадийной переработки полисахаридных компонентов лиг-ноцеллюлозной биомассы (целлюлоз и гемицеллюлоз) в ценные продукты. Катализ в пром-ти. 2016. Т. 16. № 1. С. 74-83.
4. Синицын А.П., Короткова О.Г., Синицына О. А., Рожкова А.М., Доценко Г.С., Проскурина О.В., Осипов Д.О., Кон-
(торф, обработанный 90% H2SO4) накапливается 13,0 мг/мл глюкозы за 12 ч проведения процесса. Дальнейшее уменьшение скорости накопления глюкозы как в гидролизате образца №4, так и в гид-ролизате образца №6 можно объяснить уменьшением степени насыщения гидролитических ферментов препарата Целловеридин субстратом целлюлозы и ее продуктами деструкции - олигосаха-ридами в ходе реакции. Наибольшая скорость накопления глюкозы при гидролизе образца торфа, предобработанного 90% H2SO4, также объясняется наличием в образце свободных олигосахаридов, изначально содержащихся в верховом торфе.
ВЫВОДЫ
На основании проведенных исследований и полученных данных можно сделать следующие выводы:
Предварительная предобработка ЦЛ-сырья 90% H2SO4 при Т = 160 °С повышает эффективность ферментативного гидролиза, так как увеличивается степень деструкции целлюлозы и ее доступность для активных центров целлюлолитических ферментов;
показана достаточно высокая активность отечественного мультиферментного препарата Цел-ловиридин по отношению к таким сложным по химическому составу субстратам, как торф и опилки.
Большая скорость образования глюкозы в процессе ферментативного гидролиза предобрабо-танных ЦЛ-сырья торфа и опилок является хорошим и перспективным результатом для дальнейшего получения биоэтанола из возобновляемых источников.
Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ №16-08-00158.
REFERENCES
1. Khusnutdinov I. Sh., Akhmetzyanov A.M., Gavrilov V. I., Zabbarov P.P., Khanova A.G. A studyof 1,1-diethoxyethane as a component of diesel fuel. Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2009. V. 52. N 11. P. 119-122 (in Russian).
2. Manaenkov O.V., Doluda V.Yu., Filatova A.E., Makeeva O.Yu., Siilman E.M., Sidorov A.I. A new type of Ru-con-taining catalyst for hydrolytic hydrogenation process. Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2013. V. 56. N 8. P. 97-101 (in Russian).
3. Gromov N.V., Taran O.P., Sorokina K.N., Michshenko T.I., Utandi Sh., Parmon V.N. New methods for one-step processing of polysaccharide components of lignocellulosic biomass (cellulose and hemicellulose) into valuable products. Katal. Prom. 2016. V. 16. N 1. P. 74-83 (in Russian). DOI: 10.18412/1816-0387-2016-74-83.
4. Sinitsin A.P., Korotkova O.G., Sinitsina O.A., Rozhkova A.M., Dotsenko G.S., Proskurina O.V., Osipov D.O.,
дратьева Е.Г., Чекушина А.В. Оптимизация состава целлю-лазного ферментного комплекса РетсйиитУеггисиШотт: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инжененрии. Катализ в промышленности. 2015. Т. 15. № 6. С. 78-83.
5. Синицын А.П., Скомаровский А.А., ЧекушинаА.В., Синицина О.А., НемашкаловВ.А., Кондратьева Е.Г., Рожкова А.М., Кошелев А.В. Пергамент - потенциальное сырье для получения сахаров с помощью ферментативного гидролиза. Катализ в пром-ти. 2015. Т. 15. № 5. С. 74-77.
6. Будаева В.В., Скиба Е.А., Байбакова О.В., Макарова Е.И., Орлов С.Е., Кухленко А.А., Удоратина Е.В., Щербакова Т.П., Кучин А.В., Сакович Г.В. Кинетика ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов при различных концентрациях субстрата. Катализ в промышленности. 2015. Т. 15. № 5. С. 60-66.
Kondratieva E.G., Chekushina A.V. Optimization of cel-lulases enzyme complex of PenicilliumVerruculosum: increase hydrolytic ability using the methods of genetic Ingenierie. Katal. Prom. 2015. V. 15. N 6. P. 78-83 (in Russian). DOI: 10.18412/1816-0387-2015-6-78-83.
5. Sinitsin A.P., Skomarovskiy A.A., Chekushina A.V., Sinitsinzina O.A., Nemashkalov V.A., Kondratieva E.G., Rozhkova A.M., Koshelev A.V. Parchment - a potential raw material for producing sugars through enzymatic hydrolysis. Katal. Prom. 2015. V. 15. N 5. P. 74-77 (in Russian). DOI: 10.18412/1816-0387-2015-5-74-77.
6. Budaeva V.V., Skiba E.A., Baiybakova O.V., Makarova E.I., Orlov S.E., Kukhlenko A.A., Udoratina E.V., Shcher-bakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Kinetics of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials at different concentrations of substrate. Katal. Prom. 2015. V. 15. N 5. P. 6066 (in Russian). DOI: 10.18412/1816-0387-2015-5-60-66.
Поступила в редакцию 13.07.2016 Принята к опубликованию 28.07.2017
Received 13.07.2016 Accepted 28.07.2017
