CC BY
71
УДК 615+541.451+577.11]:616-073.584
ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК, СПОСОБНОСТИ К ОКИСЛЕНИЮ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ В ТОНКИХ СЛОЯХ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОГО СОРБЕНТА ПРОДУКТА МЕТАБОЛИЗМА КАЛИМИНА 60 Н
© Шорманов В.К., Дурицын Е.П., Илюшина Т.Н., Алёхина М.И.
Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, Курск;
* кафедра фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко, Воронеж
E-mail: r-wladimir@yandex.ru
Изучены спектральные характеристики продукта щелочного гидролиза калимина 6G Н, а также его стабильность при различных значениях рН. Изучена хроматографическая подвижность 1-метил-3-пиридона методом обращеннофа-зовой тонкослойной хроматографии. Определены оптимальные условия (рН, длина волны) для количественного определения 1-метил-3-пиридона в растворе спектрофотометрическим методом. Установлено, что 1-метил-3-пиридон устойчив к окислению кислородом воздуха в течение времени, необходимом для изолирования и очистки при извлечении метаболита из модельных смесей.
Ключевые слова: калимин 6G Н, 1-метил-3-пиридон, спектрофотометрический метод, обращеннофазовая тонкослойная хроматография, химико-токсикологический анализ.
STUDING THE SPECTRAL CHARACHTERISTICS, THE ABILITY TO OXIDATION & CHROMATOGRAPHIC MOBILITY OF METABOLISM PRODUCT KALIMIN б0 N BY REVERSED THIN-LAYER
CHROMATOGRAPHY Shormanov V.K., Duritsyn E.P., Ilyushina T.N., Alyokhina M.I.
Pharmaceutical, Toxicological and Analytical Chemistry Department of Kursk State Medical University, Kursk;
Department of Pharmaceutical Chemistry & Pharmaceutical Technology of N.N. Burdenko Voronezh State Medical Academy, Voronezh The spectral characteristics of alkaline hydrolysis product kalimin 60 N, and its stability for different pH were studied. Chromatographic mobility of 1-methyl-3-pyridone was studied by the method of the reversed thin-layer chromatography. The optimal conditions (pH, wavelength) for a quantitative determination of 1-methyl-3-pyridone in a solution by the spectropho-tometric method were determined. We found out that 1-methyl-3-pyridone is resistant to oxidation by atmospheric oxygen during a period that is necessary for the isolation and cleaning while extracting metabolite from the model mixtures.
Keywords: kalimin 60 N, 1-methyl-3-pyridone, spectrophotometric method, reversed thin-layer chromatography, chemical and toxicological analysis.
Калимин 60 Н (3-[[(Диметиламино)карбо-нил]окси]-1-метилпиридиния бромид) (синоним: пиридостигмина бромид) - биологически активное вещество, широко применяемое в медицинской практике. Калимин 60 Н является синтетическим антихолинэстеразным веществом, обладает сильной обратимой антихолинэстеразной активностью. Вещество улучшает нейромышечную передачу, усиливает моторику ЖКТ, повышает тонус мочевого пузыря, бронхов, секрецию эндокринных желез, вызывает брадикардию. Пиридостигмина бромид применяют в медицине для лечения миастении, миастенического синдрома, атонии ЖКТ и мочевого пузыря. При приеме внутрь биодоступность составляет 8-20%. Частично метаболизируется в печени до неактивных метаболитов. Выводится преимущественно почками в неизмененном виде и в виде метаболитов [1, 6].
По физическим свойствам калимин 60 Н представляет собой белый или почти белый кристаллический порошок с характерным приятным запахом. Очень легко растворим в воде и этаноле, легко растворим в хлороформе, практически нерастворим в эфире, ацетоне, бензоле [1].
Данное вещество, как и многие другие карба-минаты, обладает токсичностью для теплокровных [2, 4, 5]. Описаны случаи тяжелых отравлений людей производными карбаминовой кислоты, в том числе калимином 60 Н, часть из которых приводила к летальным исходам [4, 5].
Широкое применение калимина 60 Н, его токсичность, наличие случаев отравления c летальным исходом обусловливают необходимость изучения этого соединения в судебно-химическом отношении.
Многие вопросы идентификации и количественного определения антихилинэстеразных ве-
ществ карбаминатной структуры и продуктов их метаболизма изучены недостаточно [7, 8, 9].
Целью исследования явилось изучение спектральных характеристик, способности к окислению и хроматографической подвижности в тонких слоях обращеннофазового сорбента продукта щелочного гидролиза калимина 60 Н.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования рассмотрен 3-[[(Диметиламино)карбонил] окси] -1 -метил-пи-ридиния бромид (Калимин 60 Н) (производитель AWD. Pharma (Германия)) (рис. 1). МНН: Пири-достигмина бромид (Pyridostigmini bromidum) [1].
Рассматриваемое вещество является производным карбаминовой кислоты, которая легко гидролизуется под действием кислот, щелочей, ферментов, поэтому из модельной смеси будет извлекаться смесь исходного вещества и его метаболитов.
Для получения эквивалентного количества метаболита (1-метил-3-пиридона) была использована реакция щелочного гидролиза калимина 60 Н с последующим йодометрическим определением количества метаболита.
Для изучения спектральных характеристик продукта щелочного гидролиза калимина 60 Н готовили спирто-водный раствор с концентрацией 9,6^10-6 моль/мл 1-метил-3-пиридона при различных значениях рН (3,0; 6,0; 10,0). Для создания рН среды использовали 1 М раствор кислоты серной. Спектры полученных растворов снимали на спектрофотометре СФ-46 в интервалах длин волн 250 - 340 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см [2, 3].
Для изучения стабильности 1-метил-3-пиридона во времени снимали спектры спиртоводных растворов продукта гидролиза калимина 60 Н в максимуме поглощения при различных значениях рН в течение 60 минут.
Для изучения хроматографической подвижности 1-метил-3-пиридона использовали метод обращеннофазовой тонкослойной хроматографии.
Процесс хроматографирования осуществляли в стеклянных камерах внутренним объёмом около 600 см3. Камеры предварительно насыщались парами подвижной фазы в течение 60 минут. Температура воздуха и атмосферное давление при хроматографировании соответствовали нормальным условиям. Неподвижной фазой являлся гид-роксилированный сорбент (силикагель СТХ-1 ВЭ в виде тонкого слоя на стандартных пластинах «Сорбфил»), предварительно обработанный 3% раствором вазелинового масла в гексане (модель обращённой фазы С14-С15). Размеры пластин -10x10 см.
В качестве возможных подвижных фаз рассмотрены гидрофобные и гидрофильные органические растворители различной полярности.
Хроматографировали 1-метил-3-пиридон восходящим методом, длина пробега растворителя составляла 8 см. После завершения процесса хроматографирования пластину вынимали из хроматографической камеры, высушивали и проявляли в УФ-свете. На хроматограммах метаболит кали-мина 60 Н обнаруживался в виде темного пятна на более светлом общем фоне пластины в УФ-свете. По полученным результатам рассчитывали значения для каждой подвижной фазы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении спектральных характеристик продукта гидролиза калимина 60 Н при различных значениях рН было установлено, что при рН=3,0 и рН=6,0 на спектрах имеется один максимум поглощения при длине волны 290 нм. При рН 10,0 на спектре наблюдали два пика с максимумами поглощения 250 нм и 325 нм (рис. 2).
При различных значениях рН для длин волн, соответствующих максимумам поглощения, рассчитаны молярные и удельные коэффициенты поглощения 1-метил-3-пиридона (табл. 1).
Рис. 1. Структурная формула рассматриваемого соединения.
рН.
Рис. 2. Спектры поглощения продукта щелочного гидролиза калимина 60 Н при различных значениях
Таблица 1
Значения молярных и удельных коэффициентов поглощения 1-метил-3-пиридона при различных значениях рН
X, нм 8 см
рН=10,0 250 0,21-109 1,9-107
рН=10,0 320 0,15-109 1,4107
рН=6,0 290 0,12-109 1,1-107
рН=3,0 290 0,23-109 2,1-107
Таким образом, для количественного определения 1-метил-3-пиридона в растворе спектрофотометрическим методом оптимальным значением рН является рН=3,0 и длина волны 290 нм.
При изучении стабильности вещества установили, что 1-метил-3-пиридон устойчив к окислению кислородом воздуха в спирто-водной среде в течение времени, необходимом для изолирования и очистки при извлечении метаболита из модельных смесей, так как в течение, по крайней мере, 60 минут не происходит изменения оптической плотности и смещения максимумов пиков, регистрируемых спектрофотометрическим методом (рис. 3).
Как свидетельствуют данные, полученные при изучении хроматографической подвижности в тонких слоях обращеннофазового сорбента, наименьшую подвижность 1-метил-3-пиридон проявляет при использовании в качестве подвижной фазы ацетона, изопропанола, диоксана, ТГФ, хлороформа, являющихся полярными или малополярными органическими растворителями.
Рост хроматографической активности наблюдали при использовании в качестве подвижных фаз бутанола, этилового спирта и системы растворителей бутанол - этиловый спирт (5:5), обладающих более полярными свойствами. Еще более подвижным исследуемое вещество становится в условиях применения таких систем растворителей как бутанол - этанол - вода (4:4:2), бутанол -этанол - вода (1:5:4), бутанол - этанол - вода (3:3:4), этанол - вода (5:5). При использовании в качестве подвижной фазы уксусной кислоты пятна на хроматограммах не имели четких границ и не могли быть использованы для дальнейших исследований (табл. 2).
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы.
1. Изучены спектральные характеристики спирто-водных растворов 1-метил-3-пиридона при различных значениях рН, рассчитаны молярные и удельные коэффициенты поглощения. Установлены оптимальное значение рН и анали-
2,5 ■
■
2
Н и • рН=10,0;
I 1— 1,5 Л=320 нм
с а: ■ рН=3,0;
ГС ± Л=290 нм
и си 1
ж 1- а рН=6,0;
с о 0,5 Л=290 нм
0
0 10 20 30 40 50 60
время, АЛИН
Рис. 3. Изучение стабильности 1-метил-3-пиридона в спирто-водной среде спектрофотометрическим методом при различных значениях рН.
Таблица 2
Подвижность 1-метил-3-пиридона в тонких слоях обращеннофазового сорбента при хроматографировании на пластинах «Сорбфил»
№ п/п Подвижная фаза Яг метаболита калимина 60 Н (1-метил-3 -пиридона)
1 Этанол 0,16
2 Уксусная кислота 0,56
3 Бутанол 0,04
4 Ацетон 0,00
5 Изопропанол 0,00
6 Диоксан 0,00
7 ТГФ 0,00
8 Хлороформ 0,00
9 Уксусная кислота - этанол 5:5 0,36
10 Бутанол - этанол 5:5 0,08
11 Бутанол - этанол - вода 4:4:2 0,22
12 Бутанол - этанол - вода 1:5:4 0,58
13 Бутанол - этанол - вода 3:3:4 0,53
14 Этанол - вода 5:5 0,42
тическая длина волны для спектрофотометрических исследований.
2. Установлено, что 1-метил-3-пиридон не подвергается окислению в спирто-водных растворах в течение времени (60 минут), необходимом для изолирования и очистки при извлечении метаболита из модельных смесей.
3. Изучены особенности хроматографической подвижности 1-метил-3-пиридона в тонком слое обращеннофазового сорбента и ее зависимость от природы элюента, подобраны оптимальные системы для хроматографирования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 2. -14-е издание. - М.: Новая волна, 2001. - 608 с.
2. Просветова А.П., Шорманов В.К., Дурицын Е.П., Илюшина Т.Н. Особенности определения и изучение сохраняемости тетраэтилтиурамдисульфида в биологическом материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - Т. 53, № 6. - С. 31 - 34.
3. Пиняжко Р.М., Каленюк Т.Г. Методы УФ-спектро-фотометрии в фармацевтическом анализе. - Киев: издательство «Здоровье», 1976. - 89 с.
4. Шорманов В.К., Иванов В.П., Королёв В.А. и др. Судебно-химическое определение фурадана // Су-
дебно-медицинская экспертиза. - 2005. - Т. 4S, №
3. - С. 27-31.
5. Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Дурицын Е.П. Определение фурадана в биологических жидкостях // Судебно-медицинская экспертиза. - 2005. -Т. 4S, № 5. - С. 3б-39.
6. Энциклопедия лекарств RLSNET [Электронный
ресурс] // РЕГИСТР ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ РОССИИ® РЛС® -
(http://www.rlsnet.ru/).
7. Zhang C., Ma G., Fang G. et al. Development of a Capillary Electrophoresis-Based Immunoassay with
Laser-Induced Fluorescence for the Detection of Car-baryl in Rice Samples // J. Agric. Food Chem. -2008. - Vol. 56, N 19. - P. 8832-8837.
8. Zhang Y., Muench S.B., Schulze H. et. al. Disposable Biosensor Test for Organophosphate and Carbamate Insecticides in Milk // J. Agric. Food Chem. - 2005. -Vol. 53, N 13. - P. 5110-5115.
9. Zhou P., Lu Y., Zhu J. et. al. Nanocolloidal Gold-Based Immunoassay for the Detection of the N-Methylcarbamate Pesticide Carbofuran // J. Agric. Food Chem. - 2004. - Vol. 52, N 14. - P. 4355-4359.
