CC BY
20DOI: 10.24412/1999-6780-2022-3-51-53 УДК 577.121:579.842.11
ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРА И ВЫРАЖЕННОСТИ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИТОВ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ШТАММА ESCHERICHIA COLI М-17
Игнатова Н.И. (доцент)*, Заславская М.И. (профессор кафедры), Ипатова А.О. (магистр кафедры), Лукова O.A. (старший преподаватель)
Приволжский исследовательский медицинский университет, Нижний Новгород, Россия
Проведено исследование антагонистических свойств метаболитов пробиотического штамма Escherichia coli M-17 в отношении Candida auris, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Для исследования микробицидного эффекта и ингибирования роста микроорганизмов метаболитами E. coli использовали метод совместного отсроченного культивирования. Метаболиты Е. coli М-17 подавляли рост всех исследуемых видов: C. auris, C. albicans, P. aeruginosa и S. aureus. Однако выраженный биоцидный эффект отмечен только в отношении штаммов C. auris и S. aureus.
Ключевые слова: Е. coli, метаболиты, микробный антагонизм, биоцидность
THE STUDY OF SPECTRUM AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY INTENSITY OF THE PROBIOTIC STRAIN ESCHERICHIA COLI M-17 METABOLITES
Ignatova N.I. (associate professor), Zaslavskaya M.I. (professor of the department), Ipatova A.O. (master of the department), Lu-kova O.A. (senior lecturer)
Privolzhsky Research Medical University, Nizhny Novgorod, Russia
Antagonistic properties of probiotic strain Escherichia coli M-17 metabolites against Candida auris, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus were investigated. To study the microbicidal effect and inhibition of the microorganism growth by E. coli metabolites, the delayed co-culture method was used. E. coli M-17 metabolites inhibited the growth of all investigated species: C. auris, C. albicans, P. aeruginosa, and S. aureus. However, the manifest biocidal effect was observed only for C. auris and S. aureus strains.
Key words: E. coli, metabolites, microbial antagonism, biocidity
Контактное лицо: Игнатова Надежда Ивановна, e-mail: n.i.evteeva@gmail.com
ВВЕДЕНИЕ
Микроорганизмы находятся в сложных межвидовых взаимоотношениях внутри организма хозяина, что особенно заметно при состоянии дисбиоза. Появление или доминирование минорных представителей, а также оппортунистических экзогенных видов в микробиоте человека может служить индикатором нарушения нормального микробиоценоза и являться риском развития госпитальных инфекций. Полагают, что использование пробиотических продуктов, содержащих метаболиты представителей облигатной микробиоты, способствует поддержанию видового баланса в микробиоме и снижает риск развития инфекционных заболеваний человека за счет элиминации потенциально опасных патогенов [1].
Одним из естественных представителей микробов-ингибиторов могут быть пробиотические штаммы Escherichia coli, используемые для межвидового антагонизма с условно-патогенной микробиотой [2]. Эксперименты на дрозофилах показали, что E. coli могут ингибировать рост Pseudomonas aeruginosa [3]. Выявлено, что пробиотический штамм E. coli M-17 обладает выраженной антагонистической активностью против патогенных кишечных палочек, шигелл и низкой - в отношении стафилококков, в том числе Staphylococcus aureus, а также Candida albicans и Streptococcus spp. [4]. Известно также о конкурентных взаимоотношениях E. coli и микромицетов, когда происходит с одной стороны угнетение роста грибов, а с другой - усиление продукции их факторов вирулентности [5]. Однако в исследованиях не проведено сравнение, насколько эффективно влияют пробиотические штаммы или их секреторные продукты на разные группы микроорганизмов: как бактерий, так и микромицетов. Между тем, подобное изучение чувствительности предполагаемых патогенов к метаболитам пробиотического штамма может способствовать выбору наиболее эффективного ме-табиотика.
Цель данного исследования: провести сравнение выраженности антагонистических свойств про-биотического штамма E. coli M-17 в отношении ряда условно-патогенных микроорганизмов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали Escherichia coli штамм M-17, Candida albicans (штаммы 195, 258, 290, 601), Candida auris (штаммы 70, 78, 84, 95), Pseudomonas aeruginosa (штаммы 333, 327), Staphylococcus aureus (штаммы 87, 5663) из коллекции кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины ПИМУ. Протеом штаммов был предварительно изучен с помощью метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF, Autoflex speed, Bruker Daltonik GmbH, Germany).
Грибы рода Candida предварительно выращивали на декстрозном агаре Сабуро (HiMedia, India), P. aeruginosa, S. aureus, E. coli - на мясопептонном агаре (МПА) (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) в течение 2448 часов при 37 °С.
Для исследования влияния продуктов метаболизма E. coli M-17 на рост других микроорганизмов применяли метод совместного отсроченного культивирования [6]. Для этого E. coli штамм M-17 засевали на поверхность МПА, инкубировали (24 ч, 37 °С), затем формировали второй слой агара путём наслаивания агара Сабуро или МПА поверх выросшей культуры E. coli. В эксперименте для посева на верхний (второй) слой агара использовали стандартизированные клеточные суспензии Candida, Pseudomonas, Staphylococcus в концентрации 104 кл/мл. Для контроля роста микробных культур применяли двухслойный агар без посева E. coli M-17. Затем посевы инкубировали при 37 °С в течение 24 часов (культивирование бактерий) или 48 часов (культивирование микромицетов). Подсчитывали количество и замеряли диаметр колоний микроорганизмов (КОЕ), выросших в чашках Петри. Мик-робицидный эффект оценивали по уменьшению количества выросших колоний на поверхности верхнего слоя агара в эксперименте по сравнению c контролем, а бактериостатический/ фунгистатический эффект - по уменьшению размера колоний.
Статистическую обработку результатов выполняли в программе Statistica 9 с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок. Результаты представлены в виде М (средний диаметр колоний)±о (стандартное отклонение). Различия считали значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Подавление роста микроорганизмов под действием метаболитов Е. coli М-17 было отмечено для всех исследуемых видов: C. auris, C. albicans, P. aeruginosa и S. aureus (табл.1, 2).
Таблица 1
Количество колоний микроорганизмов, выросших на поверхности двухслойного агара, при совместном отсроченном культивировании с Е. coli М-17
Таблица 2
Размер колоний микроорганизмов, выросших на поверхности двухслойного агара, при совместном отсроченном куль_тивировании с Е. coli М-17_
Вид/Штамм Размер колоний, мм
Контроль В присутствии Е. coli М-17
C. auris 70 1,85±0,07 0 *
C. auris 78 2,00±0,06 0 *
C. auris 84 1,79±0,06 0,46 ± 0,02 *
C. auris 95 2,53±0,07 0 *
C. albicans 195 4,25±0,25 0,75 ± 0,25 *
C. albicans 258 2,90±0,10 1,70 ±0,13 *
C. albicans 290 2,70±0,11 0,83 ± 0,17 *
C. albicans 601 4,65±0,13 1,88 ± 1,14 *
P. aeruginosa 333 1,85±0,08 0,75 ± 0,06 *
P. aeruginosa 327 2,05±0,02 0,30 ± 0,02 *
S. aureus 87 0,66±0,04 0 *
S. aureus 5663 0,85±0,04 0 *
- статистически значимые различия по сравнению с контролем (Р <0,05)
При этом выраженный (p<0,05) фунгицидный эффект наблюдали в отношении большинства представителей C. auris: отсутствие роста культуры выявили у штаммов 70, 78 и 95 (табл. 1). В то же время штамм C. auris 84 сохранял жизнеспособность в присутствии метаболитов кишечной палочки, хотя и обнаружили уменьшение размера колоний в 3,9 раз (p<0,05), что свидетельствовало о фунгистатическом эффекте (табл. 2) продуктов метаболизма Е. coli М-17 в отношении данного штамма Candida. Вместе с тем метаболиты E. coli M-17 не проявляли фунги-цидное действие в отношении C. albicans (табл. 1), хотя фунгистатический эффект продуктов метаболизма кишечной палочки был отчетливо виден в этих экспериментах. Так, в присутствии метаболитов E. coli M-17 размер колоний C. albicans существенно уменьшался в 1,7 - 5,7 раз (p<0,05) по сравнению с контролем (табл. 2).
В экспериментах с бактериями продукты метаболизма E. coli, присутствующие в среде для культивирования бактерий, проявляли выраженный (p<0,05) бактериостатический эффект в отношении всех исследуемых штаммов P. aeruginosa и S. aureus (табл. 1). Однако существенное (p<0,05) бактерицидное действие метаболиты кишечной палочки оказывали только на штаммы S. aureus (табл. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Среди исследуемых микромицетов штаммы C. auris оказались более чувствительными к воздействию метаболитов Е. coli М-17 по сравнению с C. albicans. Отсутствие у штаммов C. auris способности противостоять биоцидному действию метаболитов Е. coli делает их менее конкурентноспособными при колонизации слизистых оболочек в сравнении с C.
Вид/Штамм Количество колоний, шт
Контроль В присутствии Е. coli М-17
C. auris 70 25,0±3,0 0 *
C. auris 78 15,5±1,5 0 *
C. auris 84 15,5±0,5 15,5 ±0,5
C. auris 95 13,0±2,0 0 *
C. albicans 195 25,0±3,0 24,0 ± 2,0
C. albicans 258 27,5±1,5 25,5 ± 1,0
C. albicans 290 25,5±0,5 26,5 ± 0,5
C. albicans 601 23,0±2,0 25,0 ± 2,0
P. aeruginosa 333 28,5±1,5 27,5 ± 1,5
P. aeruginosa 327 29,5±0,5 25,5 ± 1,5
S. aureus 87 27,5±1,0 0 *
S. aureus 5663 26,5±0,5 0 *
- статистически значимые различия по сравнению с контролем (Р <0,05)
albicans. Этим можно объяснить редкую персистен-цию C. auris на слизистых оболочках (столь характерную для C. albicans) и, преимущественно, инва-зивный характер инфекций [7].
Антибактериальное биоцидное действие метаболитов Е. coli в отношении штаммов золотистого стафилококка продемонстрировало, что представители облигатной группы микробиоты кишечника, такие как Е. coli, являются одним из существенных факторов, снижающих колонизацию слизистой оболочки S. aureus в биотопе. Взаимоотношения Е. coli с P. aeruginosa имели иной характер: синегнойная палочка оказалась более устойчива к действию продуктов метаболизма пробиотического штамма, что проявлялось в уменьшении размера ее колоний без изменения количества. Наши результаты согласуются с данными других авторов, которые ранее показали, что Е. coli и P. aeruginosa находятся в процессе динамического ингибирования [3] и, в зависимости от концентрации метаболитов кишечной палочки (уксусная и молочная кислоты) или синегнойной полочки (пиоцианин), бактериостатический эффект
может быть смещен в сторону того или иного вида. Также можно предположить, что устойчивости P. aeruginosa к действию метаболитов бактерий-конкурентов способствует наличие у данного микроорганизма объемного слизистого чехла, замедляющего диффузию различных органических субстанций.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Метаболиты пробиотического штамма Е. coli М-17 подавляют рост широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии S. aureus и P. aeruginosa и микромицеты C. auris и C. albicans. Однако существенный микробицидный эффект отмечен только в отношении штаммов S. aureus и C. auris. Эти данные следует учитывать при назначении пробиотических препаратов — метабиотиков, приготовленных на основе пробиотических штаммов Е. coli, для таргетной коррекции нарушений микробиома человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шендеров Б.А., Ткаченко Е.И., Захарченко М.М., Синица А.В. Метабиотики: перспективы, вызовы и возможности. Медицинский алфавит. 2019; 2 (13): 43-48. [Shenderov B.A., Tkachenko E.I., Zakharchenko M.M., Sinitsa A.V. Metabiotics: prospects, challenges and opportunities. Medical alphabet. 2019;2 (13): 43-48. (In Russ.)]. doi.org/10.33667/2078-5631-2019-2-13(388)-43-48
2. Hwang I. Y., Koh E., Wong A., et al. Engineered probiotic Escherichia coli can eliminate and prevent Pseudomonas aeruginosa gut infection in animal models. Nat Commun. 2017; 8: 15028. doi: 10.1038/ncomms15028
3. Christof i T., Panayidou S., Dieronitou I., et al. Metabolic output defines Escherichia coli as a health-promoting microbe against intestinal Pseudomonas aeruginosa. Scientific Reports. 2019; 9 (1): 1-13. doi:10.1038/s41598-019-51058-3
4. Гайдеров А.А. Изучение свойств штаммов Escherichia coli M-17 b Bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиоза: Автореф. дисс... к.б.н.: 03.00. 07. М., 2007. [Gaiderov A.A. Studying the properties of Escherichia coli M-17 b Bacillus subtilis 1719 strains on the experimental dysbiosis model: Abstract. diss... Candidate of Biological Sciences: 03.00. 07. M., 2007 (In Russ)].
5. Yeganeh Farrokhi, Batool Al-Shibli, Dumooa Falah-Joudah Al-Hameedawi, Zeinab Neshati, Ali Makhdoumi. Escherichia coli enhances the virulence factors of Candida albicans, the cause of vulvovaginal candidiasis, in a dual bacterial/fungal biofilm. Res. Microbiol. 2021; 172 (4-5): 103849. doi.org/10.1016/j.resmic.2021.103849.
6. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С., Анкирская А.С. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Изд-во "Лань", 2017. 2-е изд., испр. 608 c. [Labinskaya A.S., Blinkova L.P., Eschina A.S., Ankirskaya A.S. Private medical microbiology with microbiological research technique. Moscow: Publishing House "Lan", 2017. 2nd ed., ispr. 608 c. (In Russ)].
7. Du H., Bing J., Hu T., et al. Candida auris: Epidemiology, biology, antifungal resistance, and virulence. PLoS Pathog. 2020; 16 (10): e1008921. doi.org/10.1371/journal.ppat.1008921
Поступила в редакцию журнала 07.06.2022 Рецензент: И.А. Рябнннн
