Изучение сорбционной активности крилана - гетерогликана Cryptococcus laurentii Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 616.992

ИЗУЧЕНИЕ СОРБЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ КРИЛАНА - ГЕГЕРОГЛИКАНА CRYPTOCOCCUS LAURENTII

С.И. Кузнецов, Д.В. Соколенко

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования, Россия

© Коллектив авторов, 2003

Как известно, род криптококков включает патогенный вид Ciyptococcus neoformans с тремя вариантами — var. gattii, var. grubii и var. neoformans, однако большинство других видов криптококков являются сапробами, обитающими преимущественно в почве. Большинству видов криптококков (патогенным и непатогенным) присуще более или менее выраженное капсулообразование. Капсула имеет полисахаридную природу и выступает как общебиологический защитный фактор для микробной клетки — продуцента данного полимера / //. Среди криптококков-сапробов особое места занимает С, laurentii, поскольку он может расти на питательных субстратах не только при 25 °С, но и при 30 Щ он не ферментирует сахара, но ассимилирует широкий набор углеводов, полиолов, отдельных гликозидов и органических кислот: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, рафинозу, мелецитозу, D-ксилозу, L-арабинозу, D-арабинозу, D-рибозу, Ь-рамноЗу, рибитол, галактитол, D-маннитол, инозитол, и-метил-В-глюкозид, В-глюконат, сукцинат и некоторые другие. Он образует крахмал и фермент уреазу; содержание в клетках Г+Ц(нмоль '"<) составляет 51,2-59,7. В научной литературе описаны случаи выделения С, laurentii из патологического материала — опухолей, дыхательных путей [2-4].

В данной работе представлены материалы о сорбционной активности полимерного углевода — крилана, продуцентом которого был C. laurentii.

К/иочевые слова: Ciyptococcus neoformans, биозы,

крилан, монозы, патологический материал, полиолы, сорбция, триаозы

THE STUDY OF ABSORPTIVE POWER OF «CRYLAN» -CRYPTOCOCCUS LAURENTII HETEROGLYCAN

S.l. Kuznezov, D.V. Sokolenko

Saint Petersburg Medical Academy of of Postgraduate Education, Russia

© Collective of authors, 2003

As it is known Cryptococcus genus includes pathogenic Ciyptococcus neoformans with three variants — var. gattii, var. grubii and var. neoformans, however majority of other Ciyptococci species are saprobes inhabiting in a soil mostly.

More or less noticeable capsule formation is characteristic for majority of Ciyptococci species (pathogenic and non pathogenic ones). Polysaccharide capsule is the commonly-biological defensive factor for microbial cell — a producent of given polymer [1]. Particular place between Ciyptococci — saprobes takes place Ciyptococcus laurentii so long as it can grow in nutrient substrates not only at +25°C but and at +30°G; it does not ferment sugars but assimilates the broad set of carbohydrates, polyols, some glycosides and organic acids: glucose, galactose, sucrose, maltose, cellobiose, trehalose, lactose, rajfinose, melezitose, D-xylose, L-arabinose, B-arabinose, D-ribose, L-rhamnose, ribitol, galac-titol, D-mannitol, inositol, a-methyl-B-glucoside, D-gluconate, succinate and some others. It produces starch and urease. G+C-(MoI%•) in cells is 51,2-59,7.

In the scientific literature described the events of Ciyptococcus laurentii isolation from pathologic materials — tumor, respiratory tract [2-4].

In the real article are presented materials about absorptive power of polymeric carbohydrate — «Ciylan» producent of which is C. laurentii.

Key words: absorption, bioses, carbohydrates, crylan, Ciyptococcus laurentii, monoses, pathologic materials, polyols, triaoses

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение и, часто, нерациональная эксплуатация человеком собственной среды обитания существенно изменились и продолжают изменяться до настоящего времени. Важнейшей социальной проблемой по-прежнему остаются наркомания и токсикомания. Сюда же следует отнести неполноценное и недостаточное питание значительной части малообеспеченных людей, а с этим — снижение защитных сил макроорганизма и, прежде всего, иммунной системы.

В последнее время возрос интерес к использованию сорбционных методов вообще и энтеросорбции, в частности [5], как перспективному методу лечения и профилактики широкого спектра заболеваний. Энтеросорбенты способствуют удалению из организма токсинов и токсичных продуктов метаболизма, радионуклидов, тяжелых металлов и других субстанций [6]. В этом плане интересны экзогликаны грибного происхождения и, прежде всего, дрожжевых организмов |7|. поскольку сами дрожжевые клетки, например, анаморфные криптококки из рода Cryptococcus, могут представлять интерес как отход производства для применения в различных областях деятельности человека. Так, например, С. laurentii имеет благоприятный аминокислотный состав и его белки хрошо перевариваются in vivo; в клетках С. laurentii содержатся другие физиологически активные вещества (каротиноиды, водорастворимые витамины, липиды, богатый набор микро- и макроэлементов), при низком содержании нуклеиновых кислот и низкой токсичности. Всё это заманчиво для использования биомассы

клеток этих дрожжей в качестве добавок к кормам сельскохозяйственных и других животных

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были: культура дрожжей С. laurentii (Kufferath) Skinner (1950) штамм 1803—К, переданная д.б.н. В.И. Голубевым (ИБФМ РАН) по просьбе проф. Н.П. Блинова, поручившего нам выполнение настоящего исследования; неорганические соли — меди сульфат, свинца нитрат, кобальта нитрат и ртути хлорид; клетки Escherichia coli (лабораторный штамм Н/0)\ полимерный углевод, ранее названный криланом. На сусло-агаре С. laurentii образует слизистые колонии бежевого цвета, диаметром 4-6 мм, выпуклые, с ровными краем. Клетки — овальные, 2-5 мкм, иногда вытянутые, имеющие мощную капсулу. Штрих — кремовый, желтый или розовый, без мицелия и псевдомицелия; синтезирует крахмалоподобные вещества. Кислотообразование на меловом агаре отсутствует, желатин не разжижает; культура продуцирует эк-зогликан — крилан, представляющий собой высокомолекулярный полимер с разветвленной структурой. При растворении в воде он образует вязкие растворы или гели. По химической природе крилан является кислым гетерогликаном, содержащим в своем составе маннозу, ксилозу и глюкуроновую кислоту в соотношении 55 : 29 :16 соответственно.

Нами изучена сорбционная активность крилана в отношении ионов тяжелых металлов. Для изучения процессов сорбции использовали следующие растворы солей: меди сульфата, свинца и кобальта нитрата, ртути хлорида в концентрациях от 0.05 н. до 1.0 н.

Содержание меди определяли йодометрическим методом, свинца — комплекс онометрическим методом с использованием пиридин-азонафтола с последующим титрованием трилоном Б [8]. Содержание кобальта и ртути определяли методом прямой кондуктометрии [9].

Последующим объектом изучения сорбционной активности крилана являлись клетки Щ coli. Для проведения данных экспериментов необходимо было получить нерастворимые формы крилана.

Методика получения гелей на основе крилана заключалась в следующем. Реакция щелочного раствора полисахарида с эпихлоргидрином (ЭХГ) протекает экзотермически и приводит к образованию геля. При этом ЭХГ реагирует с двумя гидроксилами различных цепей, и цепи растворимого полимера связываются эфирными связями через остаток глицерина.

Естественно, при этом можно ожидать целого ряда побочных реакций, например, ЭХГ может сразу гидролизоваться в водном растворе щелочи, и образующийся эпоксид этерифицирует лишь один гидроксил; гидролиз может наступить также и после присоединения ЭХГ к полимеру. В этом случае

происходит лишь этерификация полимера глицерином, а поперечные связи не образуются.

Для получения гелей на основе крилана (неочищенного — с инактивированными клетками продуцента и очищенного) сшивкой его с ЭХГ использовали растворы полисахарида с концентрациями от 1 до 10%. Так как полисахарид в концентрации свыше 5% получить трудно (из-за малой его растворимости и высокой степени набухаемости), то для сшивки была выбрана концентрация 5%.

100 мг полисахарида растворяли в 1М КаОН в количестве 2 мл для получения 5% раствора крилана. Процесс проводили при 1° = 40 °С, перемешивание осуществляли на роторной мешалке (500 об/мин). После полного растворения полисахарида в щелочи добавляли (при перемешивании) сшивающий агент — эпихлоргидрин (ЭХГ) и продолжали реакцию до тех пор, пока не повышалась вязкость реакционной массы (время реакции 30-40 минут). Сшитый полисахарид заливали в форму с гладкой стеклянной поверхностью, герметично закрывали и помещали в термостат (1° = 42 °С) на 24 часа, пока полисахарид полностью не заполимеризовывался. Соотношение крилана к ЭХГ брали: 1:1; 1:1.5; 1:2; 1:4. Концентрацию крилана в щелочи использовали: 5%; 7.5%; 10%. После полной полимеризации крилана были получены гранулы диаметром 0,5-1,0 мм. Сшитый сорбент не разрушался при стерилизации 0,5 ати 20 мин. Оптимальные соотношения для получения нерастворимого сорбента: крилан к ЭХГ

— 1:1.5, концентрация крилана в щелочи 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сорбция ионов тяжёлых металлов

Были отработаны условия проведения сорбции. Показано, что сорбция происходила практически мгновенно в исследуемом временном интервале от 3 до 60 мин. Количество сорбированных ионов не изменялось. При анализе зависимости процесса сорбции от концентрации полисахарида (на модели крилан- меди сульфат) показано, что при увеличении концентрации полисахарида происходило возрастание количества сорбируемой меди. Однако, начиная с концентрации крилана 0,6 %, количество поглащаемых ионов не менялось, т.е. кривая имела вид кривой насыщения. Эта концентрация была выбрана для проведения дальнейших экспериментов. Для полного удаления свободных, несвязанных полисахаридом, ионов меди и свинца были отработаны условия проведения диализа.

В предварительных экспериментах сорбции металлов методом прямой кондуктометрии опыты проводили при интенсивном перемешивании, при этом выход на прямую насыщения сорбции осуществлялся в течение 60-80 мин. Можно предположить, что таким перемешиванием мешалкой

происходило разрушение структур полимера, ранее образовавшихся в результате обмена ионами.

Без перемешивания сорбция происходила мгновенно, что наталкивает на мысль о приближённо возможной аналогии в процессах сорбции ш vivo.

С целью определения характера взаимодействия крилана с ионами меди и свинца были построены изотермы сорбции. Они имели вид S-образных кривых, что свидетельствовало о сложном механизме процесса. Вероятно, это связано с особенностями пространственной конфигурации полисахарида и с образованием сложных комплексов крилан — металл. Комплекс может образоваться за счет координационных связей между гидроксильными группами полимеров и ионами металлов с формированием монослоя. При увеличении концентрации ионов сорбция происходила за счет эффекта кооперативного взаимодействия. При этом возможно образование связей с сорбированными и находящимися в растворе ионами.

Изучение влияние температуры и pH на сорбцию ионов меди, свинца, кобальта и ртути криланом представлено в таблице 1.

Таблица 1. Сорбционная активность крилана

Условия Концентрация ионов металлов, мг/г крилана

Медь Свинец Кобальт Ртуть

pH 7,0, Г = 20 ”С 130,0 ±11,5 50,0 ± 7,0 104,4 ±8,6 175,5 ±9,5

pH 7,0, Г = 37 "С 125,0 ±12,4 82,4 ±5,8 - -

pH 2,0, f = 20 ’С 72,0 ±7,5 50,0 ±4,5 75,4 ±10,5 150,0 ±11,4

pH 2,0, f = 37 ”С 38,0 ±4,5 45,5 ±3,0 - -

Повышение температуры до 37 °С при нейтральных значениях pH заметно не влияло на сорбцию меди и увеличивало сорбцию свинца в 1,5 раза. В кислой среде происходило существенное снижение сорбции ионов меди и кобальта, в то время как активность сорбции ионов ртути и свинца менялась незначительно.

Отсутствие четкой закономерности влияния pH и температуры на сорбцию тяжелых металлов криланом можно объяснить различной природой сорбционных связей исследуемых ионов с полисахаридом, что определяет избирательность процессов при различных внешних условиях. В данной связи можно отметить, что при взаимодействии соли свинца с полисахаридом в растворах наблюдали образование хлопьевидных осадков при нейтральных значениях pH и комнатной температуре, однородной взвеси при 37 °С и нитевидных осадков — при pH 2,0, в то время как при взаимодействии полисахарида с другими солями видимых изменений реакционной среды не происходило.

Однако, несмотря на снижение эффективности сорбции крилана при повышении температуры и низких значениях pH (условия среды в желудке человека), препарат по сорбционной активности превышает некоторые известные энтеросорбенты. Так, по эффективности сорбции свинца (из раствора

свинца нитрата) препараты можно расположить в следующей последовательности: крилан, панасорб, полифепан, микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ). При этом сорбция ионов в мг/г сорбента составляла 45.5; 22,0; 1,2 и 0,1 соответственно. Те же закономерности наблюдали в отношении ионов ртути. МКЦ и полифепан слабо сорбировали ртуть из растворов ртути хлорида (до 1.5 мг/г), активность панасорба составляла 4,9 мг/г. Из растворов ртути нитрата сорбция была выше и составляла у панасорба 39 мг/г [ 10], у крилана — значительно эффективнее — 150 мг/г.

На основании приведенных сравнительных данных можно предполагать о высокой энтеросор-бционной активности крилана в отношении ионов тяжелых металлов и перспективности его применения при соответствующих интоксикациях.

СОРБЦИЯ КЛЕТОК Е.соН

Применительно к сорбции бактериальных клеток в качестве модели была выбрана кишечная палочка. Использовали живые, отмытые от питательной среды 0,9% раствором натрия хлорида апатоген-ные клетки £, coli суточного возраста, выросшие на мясо-пептонном бульоне при 37 °С. Соотношение клеток и сорбента было 1:1. Перемешивание смеси производили умеренным встряхиванием примерно через 3-4 мин в течение часа. Количество неадсор-бированных клеток кишечной палочки определяли методом высева из раствора на питательные среды после удаления сорбента. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Сорбция клеток Е.СОІІ на гранулах

крилана

Условия сорбции КОЕ на 1 г. влажного КОЕ на 1 г сухого

сорбента сорбента

pH 6,0 4.0*105 5.3*10“

pH 8,0 2.2*105 2.9*10“

КОЕ - колониеобразующие единицы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Крилан, образуемый C. laurentii, обладает высокой адсорбционной активностью в отношении ионов кобальта, меди, ртути и свинца; он также активен и по отношению клеток E. coli.

Биомасса клеток продуцента крилана потенциально интересна и как биосорбент для иммобилизации ионов тяжёлых металлов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Елинов Н.П. Предпосылки к обобщению биологических функций природных полисахаридов //Мат. научн. конф., посвящённой итогам НИР ЛХФП за 1970 г. — JI., 1971. — С. 5-7.

2. Елинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: «Высшая школа», 1984. — С. 5.

3. The Yeasts. A taxonomic study. 4th revised and enlarged edition. C.P. Kurtzman, J.W. 3Mt eds. ELSEVIER SCIENCE B.V.

— Amsterdam, Netherlands. — 1999. — 1055 p.

4. Lynch D.P. et al. Ciyptococcus laurentii lung abscess // Am. Rev.Respir. Dis. -1981.- Vol. 123. — P. 135-138.

5. Буркова H.B. Использование сорбционных методов для коррекции гемодинамических нарушений у животных: Ав-тореф. дисс... канд. биоя. наук. -СПб., 2001. — 22 с.

6. Энтеросорбция / ПодреД.Н.А. Белякова. — Л., Центр сорбционных технологий. — 1991. — 323 с.

7. Елинов Н.П. Основы биотехнологи. Издательская фирма «Наука», СПб, 1995. — 600 с.

8: Васильев В.П. Аналитическая химия. — М.: «Высшая школа», 1993. — Т 1. — 320 с.

9. Евстратова К.И. Практикум по физической и коллоидной химии. - М.: «Высшая школа», 1990. — С. 58-80.

10. ШиковА.Н. Влияние различных факторов на выращивание биомассы женьшеня и разработка малоотходной технологии готовых лекарственных средств: Автореф. дисс... кавд. биол. наук. — СПб., 1995. — 20 с.

Поступила в редакцию журнала 29.04.03 Рецензент: Бабенко Г.А.