CC BY
35
УДК 612.12:618.19-006.6-085.277.3
ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ И СВОЙСТВ АЛЬБУМИНА, ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ХИМИОТЕРАПИИ НА БЕЛКОВОМ КОНЦЕНТРАТЕ АУТОПЛАЗМЫ
© 2009 г. И.А. Горошинская, Я.В. Светицкая, Л.Ю. Владимирова, Н.Д. Ушакова, П.С. Качесова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Rostov Research Cancer Institute,
14-я линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, 14 line, 63, Rostov-on-Don, 344037,
rnioi@list.ru rnioi@list.ru
Изучены биохимические показатели в плазме крови и в полученном методом ее фильтрационной детоксикации белковом концентрате у больных с местно-распространенным РМЖ. Установлено, что белковый концентрат аутоплазмы, используемый в качестве носителя цитостатиков, отличается от исходной плазмы увеличением содержания альбумина более чем на 60 и почти двукратным возрастанием его эффективной концентрации, тенденцией к нормализации исходно сниженного уровня среднемолекулярных пептидов, двукратным снижением коэффициента интоксикации, тенденцией к нормализации уровня свободнорадикальных процессов и повышенной способностью к антиоксидантной защите. В отбрасываемом фильтрате общая и эффективная концентрации альбумина составляют 3—4 от уровня в белковом концентрате, отсутствует основной антиоксидантный белок плазмы церулоплазмин и обнаруживаются лишь следы каталазной активности; уровень пероксинитрита, являющегося одним из наиболее агрессивных свободнорадикальных продуктов, почти в полтора раза выше, чем в концентрате.
Ключевые слова: рак молочной железы, альбумин, эндогенная интоксикация, производные оксида азота.
Protein concentrate of autoplasma obtained by means of filtrating detoxication is characterized by containing of main part of albumin, qualitative difference of its properties and increased ability for antioxidant defense. Filtrate contains only 3—4 % of total and effective albumin concentration, traces of catalase activity, no ceruloplasmin activity and maximum level of peroxynitrite.
Keywords: breast cancer, albumin, endogen intoxication, nitric oxide derivatives.
Поскольку рак молочной железы (РМЖ) сохраняет первое место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями у женщин, совершенствование методов его лечения остается важнейшей задачей онкологов. В Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте для лечения больных РМЖ предложено использование нового метода -неоадьювантной химиотерапии на белковом концентрате аутоплазмы, что делает актуальным исследование терапии биохимических показателей, прежде всего, выявляющих эндогенную интоксикацию. Особый интерес представляет изучение концентрации и функциональных свойств альбумина, который не только является основным белком, контролирующим связывание токсических соединений, но и действующим началом при проведении химиотерапии на аутоплазме. Важная роль в развитии эндогенной интоксикации принадлежит свободнорадикальным процессам. Свободные радикалы и, в частности, оксид азота (N0) и его производные рассматриваются в качестве ключевых факторов патогенеза опухолевой болезни [1, 2]. Показаны роль оксида азота в промоции канцерогенеза, процессах апоптоза, зависимость его уровня от эффективности лечения [3, 4]. Благодаря быстро протекающим реакциям оксида азота с кислородом, его радикалами и соединениями металлов переменной валентности, время жизни N0 очень коротко (в пределах 100 мс), и ведущее значение в осуществлении его функций приобретают промежуточные соединения N0, исполняющие роль депо, а также образующийся в реакции с
супероксид-анионом новый активный радикал - перок-синитрит-анион ONOO" [5, 6].
Для суждения об изменении свойств альбумина и уровне эндогенной интоксикации изучены общая и эффективная концентрации альбумина (ОКА и ЭКА), его связывающая способность (ССА), уровень молекул средней массы (мсм) и коэффициент интоксикации. Процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по интенсивности H2O2 - люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) и спектрометрически определяемому уровню (ONOO). Исследовали также содержание других производных оксида азота: нитрозоглутатиона и нитро-тирозина, оксидазную активность церулоплазмина, основного белкового антиоксиданта плазмы крови, который является полифункциональным ингибитором большого количества свободных радикалов, и активность каталазы - одного из ключевых антиоксидант-ных ферментов. Все вышеперечисленные показатели определяли в плазме крови, белковом концентрате и фильтрате, полученных из исходной аутоплазмы методом ее фильтрационной детоксикации до начала лечения (фон) у 24 больных местно-распространенным РМЖ и у большинства больных через 4 недели после проведения 1-го курса химиотерапии по схеме CMFA с введением цитостатиков на белковом концентрате аутоплазмы.
Накопление МСМ в плазме крови исследовали при двух длинах волн: 254 и 280 нм по модифицированному методу Н.И. Габриэлян, В.И. Липатовой (1984) [7]. Сте-
пень сорбции токсических лигандов (резервную ССА) оценивали по отношению ЭКАЮКА100 %, что соответствует отношению величин свободных связей пула молекул альбумина к общему количеству его связей [8]. ОКА определяли унифицированным колориметрическим методом с использованием набора реагентов Оль-векс Диагностикум, Санкт-Петербург, ЭКА (транспортную функцию альбумина) - модифицированным методом с использованием конго красного [9]. Рассчитывали также коэффициент интоксикации, отражающий баланс между накоплением и связыванием токсических лигандов, по формуле КИ=(МСМ254/ЭКА) 1000.
Уровень в плазме крови производных N0 определяли спектрометрически на спектрофлюориметре Флюорат-02-панорама при следующих длинах волн: 0N00_ и продукты его взаимодействия с тиолами ^N00" + К-8^0х) - при 302 нм, нитрозоглутатион -338 нм, нитротирозин - 438 нм. Уровень продуктов N0 рассчитывали с использованием выведенных молярных коэффициентов экстинкции [5, 10] и выражали в нмолях/мг белка. Содержание белка определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм. Интенсивность ХЛ исследовали в системе перекись водорода - люминол по методу В.А. Шестакова [11], оксидазную активность церулоплазмина по окисле-
нию п-фенилендиамина [12]. Активность каталазы определяли по методу М.Э. Королюка (1988) [13] .
До начала лечения в плазме крови больных РМЖ ОКА была ниже уровня доноров на 43,5, ЭКА - на 71,9 и ССА - на 46,9 %. Уровень МСМ, определяемых при X = 254 нм (МСМ254), не отличался от уровня доноров, тогда как уровень среднемолекулярных пептидов (СМП или МСМ280) был снижен на 35,5 %. Коэффициент интоксикации превышал норму в 3,8 раза (табл. 1). Интенсивность ХЛ была снижена на 45,6 %, уровни 0N00_ и N0-глутатиона увеличены на 39,5 и 32,6 %. Активность церулоплазмина снижена на 49,3 %, активность катала-зы не отличалась от уровня доноров (табл. 2).
После проведения 1 -го курса химиотерапии в плазме крови больных имело место хотя и незначительное по величине, но достоверное увеличение содержания альбумина, ОКА выросла на 14,6 %, ЭКА -на 34,2 % по сравнению с фоном до лечения, в результате чего снижение по сравнению с нормой составило для ОКА, ЭКА и ССА 35,2, 62,3 и 37,8 % соответственно. Изменение в сторону нормализации наблюдалось и для среднемолекулярных пептидов. Изначально сниженный их уровень вырос на 36,6 % и достоверно не отличался от нормы (табл. 1). Достоверных изменений других показателей не выявлено.
Таблица 1
Содержание альбумина, МСМ и коэффициент интоксикации у больных РМЖ в плазме крови, белковом концентрате и фильтрате до и после химиотерапии
Группа ОКА, г/л ЭКА, г/л ССА, % МСМ254 МСМ280 Коэффициент интоксикации
Доноры (п=15) 44,44±1,01 40,37±1,69 86,6±4,58 0,273±0,005 0,203±0,005 6,94±0,31
Плазма до лечения (п =24) после 1-го курса (п=17) 25,12±0,691 28,79±1,281' 2 11,34±1,151 15,22±1,271' 2 46,02±4,681 53,9±5,351 0,263±0,012 0,278±0,012 0,131±0,0101 0,179±0,0152 26,45±3,571 24,4±2,461
Концентрат до лечения (п =24) после 1-го курса (п=17) 43,26±2,23 46,92±2,943 22,46±1,961' 3 25,98±2,641' 3 53,68±4,451 61,19±5,581 0,264±0,012 0,265±0,008 0,150±0,0101 0,189±0,0142 12,65±1,11' 3 12,71±1,681' 3
Фильтрат до лечения (п=19) после 1-го курса (п=13) 1,96±0,36 1 3 4 1,55±0,311' 3 4 0,66±0,351' 3 4 0,8±0,351' 3 4 24,13±10,781' 3 4 27,13±11,081' 3 4 0,265±0,021 0,269±0,01 0,124±0,0121 0,143±0,0091'4 129,86±28,181, 3, 4 136,1±26,871, 3, 4
Примечание. Статистически значимое отличие: 1 - от значений у доноров (р<0,01-0,001); 2 - по сравнению с фоном до лечения (р<0,05); 3 - по сравнению с плазмой (р<0,05-0,001); 4 - по сравнению с концентратом (р<0,05-0,001).
Важно отметить, что в процессе проведения химиотерапии на белковом концентрате аутоплазмы не наблюдалось увеличения МСМ254. Хотя при проведении больным РМЖ традиционной полихимиотерапии по схеме САБ имело место последовательное (от курса к курсу) повышение концентрации МСМ, рассматриваемое авторами как проявление синдрома эндогенной интоксикации и сопровождавшееся наличием у больных ранних и поздних токсических осложнений [14].
После проведения фильтрационной детоксикации альбумин локализовался преимущественно в белковом концентрате, ОКА и ЭКА были выше в концентрате, полученном как из плазмы до лечения, так и из
плазмы крови больных спустя 4 недели после проведения 1 -го курса химиотерапии (используемом для проведения 2-го курса химиотерапии на белковом концентрате). Для ОКА увеличение по сравнению с исходной плазмой составило 72,2 и 63 %, для ЭКА -98,6 и 70,7 %. Степень снижения ССА относительно нормы меньше в концентрате (38 и 29,3 %), чем плазме (46,9 и 37,8 %). В фильтрате показатели альбумина многократно ниже. В фоновом фильтрате уровень ОКА составлял 7,8 от плазмы и 4,5 % от концентрата, уровень ЭКА - 5,8 и 2,9 %. Для фильтрата, полученного из плазмы крови больных после 1 -го курса химиотерапии, эти величины были равны 5,4 и 3,3 % в случае ОКА и 5,3 и 3,1 % - для ЭКА.
Достоверных изменений МСМ254 не обнаружено ни в одной из исследованных фракций. Уровень МСМ280 нормализовался после 1 -го курса именно в концентрате, где был достоверно выше, чем в фильтрате.
В концентрате интенсивность ХЛ оказалась выше по сравнению с плазмой. Белки, обладающие антиок-сидантными функциями (церулоплазмин, каталаза), локализовались преимущественно в концентрате. Уровень 0N00_ в концентрате достоверно не отличался от плазмы, превосходя норму на 42,9 (до лече-
ния) и на 49,6 % (после 1-го курса). В фильтрате он был значительно выше: из фоновой крови уровень 0N00_ был выше нормы на 221,2 %, по сравнению с плазмой и концентратом - на 111,7 и 124,8 %, из крови больных после 1 -го курса это превышение достигало 264, 153,1 и 143,4 % соответственно. Уровни N0-глутатиона и N0-тирозина в концентрате существенно не отличались от плазмы, а в фильтрате были значительно ниже: N0-глутатион - в среднем на 50 %, N0-тирозин - на 60 (табл. 2).
Таблица 2
Показатели свободнорадикальных процессов у больных РМЖ до и после 1-го курса химиотерапии
Группа Пероксинитрит, нмоль/мг белка NO-глутатион, нмоль/мг белка NO-тирозин, нмоль/мг белка ХЛ, имп. за 6 с ЦП, мкм/л Каталаза, мкм/мин^л
Доноры (п= 15-17) 85,51±5,31 27,2+1,43 5,06+0,49 2964,7+264 0,995+0,054 23,45±1,97
Плазма до лечения (п =24) после 1 курса (п=17) 129,75±10,71 123,0±8,231 36,07±4,33 36,33±3,741 5,06±0,7 6,13±0,68 1611,82±208,011 1606,9±177,241 0,504±0,0661 0,604±0,1191 21,76±3,85 18,64±3,57
Концентрат до лечения (п =24) после 1 курса (п =17) 122,2±8,91 127,9±14,31 25,6±3,23 34,33±6,9 5,1±0,70 5,5±0,90 1828,7±211,31 2325,6±305,7 3 1,51±0,181, 3 1,44±0,21, 3 26,07±3,82 22,36±2,96
Фильтрат до лечения (п=19) после 1 курса(п=13) 274,68±36,51, 3, 4 311,26±88,41, 3, 4 17,51±5,191, 3 18,97±5,011, 3 1,98±0,561, 3, 4 2,40±0,961, 3, 4 543,3±94,91, 3, 4 418,5±51,61, 3, 4 - 1,693±0,8581, 3, 4 0,781±0,3611, 3, 4
Примечание. Статистически значимое отличие: 1 - от значений у доноров ^<0,05-0,001); 3 - по сравнению с плазмой ^<0,05-0,001); 4 - по сравнению с концентратом ^<0,05-0,001).
0N00 образуется в результате реакции супероксидного анион-радикала (02) с N0 и выступает в качестве чрезвычайно токсического соединения. Обладая гораздо большей реакционной способностью, чем N0 и супероксидный радикал, 0N00_ участвует в инициации ПОЛ, окислении биологических тиолов, способствует модификации белков и окислительному повреждению клетки, является сильным ДНК-расщепляющим агентом и тем самым может рассматриваться как один из важнейших факторов канцерогенеза [1]. Такие производные N0, как нитрозоглутатион и нитротирозин, выполняют функцию его депонирования. S-нитрозо-тиолы рассматриваются как основные переносчики N0 от клеток-доноров к клеткам мишеням его действия. В отличие от N0, живущего доли секунды, время полупревращения S-нитрозоглутатиона составляет 10 ч, а S-нитрозоцистеина - более 90 мин [5]. Кроме того, S-нитрозотиолы, прежде всего нитрозоглутатион и содержащие глутатион динитрозольные комплексы железа, обладают выраженной антиоксидантной способностью, тем самым обеспечивая защиту от 0N00 и играя решающую роль для выживания клетки в условиях окислительного стресса [15].
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что белковый концентрат аутоплазмы, полученный методом фильтрационной детоксикации и используемый для проведения химиотерапии, отличается от исходной плазмы увеличением концентрации альбумина более чем на 60 %, почти двукратным возрастанием его эффективной концентрации, тенденцией к нормализации исходно
сниженного уровня среднемолекулярных пептидов, в состав которых входят молекулы, обладающие регу-ляторными свойствами, двукратным снижением коэффициента интоксикации, тенденцией к нормализации уровня свободнорадикальных процессов и повышенной способностью к антиоксидантной защите. В отбрасываемом фильтрате содержание альбумина составляет 3,3+4,5 % от уровня в концентрате, его эффективная концентрация - 2,9+3,1 %, в нем отсутствует основной антиоксидантный белок плазмы -церулоплазмин и обнаруживаются лишь следы ката-лазной активности. При этом уровень 0N00, являющегося одним из самых агрессивных свободнора-дикальных продуктов, в фильтрате превосходит норму в среднем втрое и почти в полтора раза выше, чем в концентрате. В то же время другие производные N0, а именно нитрозоглутатион и нитротирозин, которые рассматриваются как соединения, связывающие избыток оксида азота и тем самым препятствующие образованию 0N00, находятся в концентрате в значительно большей концентрации, чем в фильтрате (нитрозоглутатион - на 46+81 %, нитротирозин - на 129+158). Выявленные особенности белкового концентрата способствуют высокой клинической эффективности данного способа химиотерапии.
Литература
1. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 7. С. 1007-1019.
2. Ray G., Husain S.A. Oxidants, antioxidants and carcinoge-
nesis // Indian J. Exp. Biology. 2002. Vol. 40, № 11. P. 1213-1232.
3. Kolb I.P. Mechanisms involved in the pro- and antiapoptotic
role of NO in human leukemia // Leukemia. 2000. Vol. 14, № 9. P. 1685-1694.
4. Роль экзогенных оксидов азота в возникновении нитро-
зативного стресса в организме и их влияние на повышение онкологического риска / В.М. Михайленко [и др.] // IV съезд онкологов и радиологов СНГ. (Баку, 28 сент.-1 окт. 2006). Баку, 2006. С. 31.
5. Степуро А.И., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Роль тиоль-
ной формы тиамина в обмене оксида азота // Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 3. С. 416- 429.
6. Беда Н.В., Недоспасов А.А. Неорганические метаболиты
оксида азота - участники NO-зависимых модификаций биополимеров // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32, № 1. С. 3-26.
7. Габриэлян Н.И., Липатова В.И. Опыт использования
показателей средних молекул в крови для диагностики нефрологических заболеваний у детей // Лаб. дело. 1984. № 3. С. 138-140.
8. Критерии оценки эндогенной интоксикации при ожого-
вой травме / С.Б. Матвеев [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. № 10. С. 3-6.
Поступила в редакцию_
9. Мельник И.А., Барановский П.В., Нестеренко Л.И. Но-
вый способ оценки транспортной функции сывороточного альбумина // Лаб. дело. 1985. № 4. С. 202-204.
10. Лобышева И.И., Сереженков В.А., Ванин А.Ф. Взаимо-
действие динитрозильных тиолсодержащих комплексов железа с пероксинитритом и перекисью водорода in vitro // Биохимия. 1999. Т. 64, вып. 2. С. 194-200.
11. Шестаков В.А., Бойчевская Н.О., Шерстнев М.П. Хе-
милюминесценция плазмы крови в присутствии перекиси водорода // Вопросы медицинской химии. 1979. Т. 25, вып. 2. С. 132-137.
12. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клиниче-
ской химии. Минск, 1982. 326 с.
13. Метод определения активности каталазы / М.А. Коро-
люк [и др.] // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 6-19.
14. Орлова Р.В., Чернецова Л.Ф., Матвеева О.Н. Анализ
влияния программной полихимиотерапии на клиническое состояние, биохимические и иммунологические показатели гомеостаза у больных раком молочной железы // Вопросы онкологии. 2007. Т. 53, № 4. С. 414-418.
15. Взаимодействие динитрозильных комплексов железа с
интермедиатами окислительного стресса / К.Б. Шумаев [и др.] // Биофизика. 2006. Т. 51, вып. 3. С. 472-477.
3 июля 2008 г.
