CC BY
30DOI: 10.24411/2181-0443/2021-10016
ИЗУЧЕНИЕ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА ПЕРЕЛОМОВ БЕДРЕННОЙ КОСТИ КРОЛИКОВ ПРИ ТЕРАПИИ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМОЙ
Хегяй Любовь Николяевня
Межвузовская научно-исследовательская лаборатория Ташкентская медицинская академия Ташкент, Узбекистан Гяффоров Азямят Уйгунович
Бухарский государственный медицинский институт имени Абу али ибн Сино Бухара, Узбекистан
Асиловя Сяодят Убяйевня
Ташкентская медицинская академия Тешяев Азямят Азямович
Бухарский государственный медицинский институт имени Абу али ибн Сино Бухара, Узбекистан
На экспериментальной модели переломов бедренной кости кроликов изучена динамика репаративного остеогенеза при терапии аутологичной плазмой, обогащённой тромбоцитами. Опытные животные были разделены на 3 группы. 1 интактную группу составили 6 здоровых особей. Во 2-й опытной группе 30 кроликам лечение не проводилось, в 3-ей группе 30 животным внутримышечно вводили аутологичную плазму, обогащённую тромбоцитами, начиная с 3 суток опытов. Гистологические исследования в динамике 7,14,30,60 и 90 суток подтверждают интенсивное остеообразование при инъекциях плазмы, обогащённой тромбоцитами, начиная с 30 суток опытов. Установлено, что у животных 2 группы через 30 суток костные пластинки еще не сформированы, кость губчатого типа, кровеносные сосуды, содержащие эритроциты в просветах. В надкостнице, образованной волокнами и клетками типа фибробластов, ориентированными параллельно поверхности кости, выявлены остеобласты. У кроликов 3 группы через 30 суток выявлена четкая дифференциация структур костной ткани: сформирована кость (остеон), состоящая из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами - зрелыми костными клетками, заключенными в костный матрикс, который секретируется остеобластами. Гаверсовы каналы окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами.
Ключевые слова: переломы трубчатых костей, гистоморфология, репаративный остеогенез, аутологичная плазма, обогащённая тромбоцитами, кролики.
STUDY OF REPARATIVE OSTEOGENESIS OF RABBIT FEMORAL BONE FRACTURES
DURING PLASMA RICH THERAPY
The dynamics of reparative osteogenesis during therapy with autologous platelet-rich plasma was studied using an experimental model of rabbit femoral fractures. Experimental animals were divided into 3 groups. 1 intact group consisted of 6 healthy individuals. In the 2nd experimental group, 30 rabbits were not treated, in the 3rd group, autologous plasma enriched with platelets was intramuscularly injected into 30 animals, starting from the 3rd day of the experiments. Histological studies in the dynamics of 7,14,30,60 and 90 days confirm intensive osteogenesis with injections of platelet-enriched plasma, starting from 30 days of experiments. It was found that in animals of the 2nd group, after 30 days, the bone plates have not yet formed, the bone is of the spongy type, the blood vessels containing erythrocytes in the lumens. Osteoblasts were found in the periosteum, formed by fibers and cells of the fibroblast type, oriented parallel to the bone surface. In rabbits of group 3, after 30 days, a clear differentiation of bone tissue structures was revealed: a bone (osteon) was formed, consisting of concentric
plates formed by osteocytes - mature bone cells enclosed in a bone matrix that is secreted by osteoblasts. The Haversian canals are surrounded by the main bone substance with numerous osteocytes.
Key words: fractures of tubular bones, histomorphology, reparative osteogenesis, autologous platelet-rich plasma, rabbits.
ПЛАЗМА ТРОМБОЦИТЛАРИ БИЛАН БОЙИТИЛГАН ТЕРАПИЯДА ЦУЁН СОН СИНИЦЛАРИНИНГ РЕПАРАТИВ ОСТЕОГЕНЕЗИНИ УРГАНИШ
Сон суяги ёриКДари булган ;уёнлар экспериментал моделида тромбоцитлар билан бойитилган плазма билан даволаш ор;али репаратив остеогенез динамикаси урганилди. Тажриба хайвонлари 3 гурухга ажратилди. 1 гурух интакт гурухи булиб, 6 та соглом хайвондан ташкил топган. 2-тажриба гурухига мансуб 30 та ;уёнда даволаш утказилмади, 3-гурухдаги 30 та хайвонга тажрибанинг 3-кунидан бошлаб тромбоцитлар билан бойитилган аутолог плазма мушак ичига киритилди. 7,14,30,60 ва 90 кунлар динамикасидаги гистологик тадк;ик;отлар тажрибаларнинг 30 кунидан бошлаб киритилган тромбоцитларга бой плазма инъекциялари остеогенезни кучайтирганини тасдиКДади. 2-гурух хайвонларида 30 кундан кейин суяк пластинкалари хали шаклланмаганини, суякнинг ёриЦдари битмаганини, ёри;;а эритроцитлар ажратаётган ;он томирлари мавжудлиги ани;ланди. Суяк юзасига параллел йуналлган толалар ва фибробластлар типидаги хужайралар томонидан хосил ;илинган суяк ту;имасида остеобластлар топилган. 3-гурух ;уёнларида 30 кундан кейин ани; шаклланган суяк ту;имаси тузилмалари ани;ланди: остеобластлар томонидан хосил ;илинган суяк матрицасига ;ушилган остеоцитлар - етук суяк хужайралари томонидан хосил ;илинган концентрик пластинкалардан иборат суяк (остеон) хосил булди. Гаверсов каналлари суякнинг асосий моддаси хамда куплаб остеоцитлар билан уралгани кузатилди.
Калит сузлар: найсимон суяк синишлари, гистоморфология, репаратив остеогенез, тромбоцитлар билан бойитилган аутолог плазма, ;уёнлар.
В настоящее время в медицине широко применяется технология лечения аутологичной плазмой обогащённой тромбоцитами (autologous platelet-rich plasma) - АПОТ (APRP). Благодаря природным свойствам плазмы обогащённой тромбоцитами введение её в организм является одной из перспективных процедур в восстановлении тканей. После разрушения тромбоцитов АПОТ содержит а-гранулы, из которых после активации высвобождается множество факторов, таких как трансформирующий фактор роста-бета (TGF-в), фактор роста эндотелия сосудов (VGFF) и эпидермальный фактор роста (EGF) [1]. Доказана эффективность APRP при заживлении ран и восстановлении тканей в челюстно-лицевой хирургии, кардиохирургии, офтальмологии,
ортопедии, пластической хирургии, спортивной медицине и косметологии [2].
В наших исследованиях APRP-терапия апробирована на
экспериментальной модели переломов костей конечностей кроликов с целью стимуляции регенерации костей и
заживления послеоперационных ран. Терапевтические эффекты АПОТ всё ещё противоречивы из-за отсутствия
оптимизированных и стандартизированных протоколов оптимальных условий центрифугирования цельной крови. Нами апробирована методика получения обогащенной тромбоцитами плазмы при двухэтапном центрифугировании
аутологичной крови из ушной вены кролика на настольной центрифуге TDZ4-4Ws (Китай). Исходная концентрация
тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме в среднем составляла 590,58±25,69 (109/л). Эффективность терапии АПОТ оценена по результатам изучения репаративного остеогенеза переломов бедренной кости кроликов при терапии обогащенной тромбоцитами плазмой
Цель исследования:
патоморфологическая оценка процессов регенерации в динамике лечения экспериментальных переломов костей с применением аутологичной плазмой, обогащённой тромбоцитами.
Объект исследований: локальная стимуляция остеогенеза при терапии с применением плазмолифтинга
посттравматических нарушений костной репаративной регенерации и их морфофункциональное состояние
Методы исследований:
экспериментальный, гистоморфологический.
Материалы исследований.
Экспериментальные исследования
прoведены на базе отделов фармако-токсикологических исследований и клеточных технологий с электронной микроскопией Межвузовской научно-исследовательской лаборатории ТМА.
Опыты проведены на 66-ти беспородных кроликах-самцах породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг в возрасте 11-12 месяцев. Все опытные животные были разделены на 3 группы. 1-ую интактную группу составили 6 здоровых особей, во 2-ую и 3-ью опытные группы распределили по 30 особей в каждой. Во 2-й группе терапию аутологичной плазмой, обогащённой тромбоцитами (АПОТ) не применяли, в 3-ей группе терапия включала внутримышечное введение АПОТ, начиная с 3 суток опытов. Исследования проводились на 7,14,30, 60 и 90 сутки опытов. Выбранные сроки наблюдения являются наиболее
показательными для визуализации процессов, происходящих в костной ткани после переломов. В ходе работы соблюдались правила проведения медико-биологических исследований с
использованием животных в соответствии с международными рекомендациями [3,4,5,6]. Лабораторные животные содержались в стандартных условиях вивария и находились на полноценном лабораторном пищевом рационе при свободном доступе к воде. Им был обеспечен растительный
витаминизированный рацион. Все кролики перед работой были дегельминтизированы. С момента начала и в течении всего срока эксперимента животные были обследованы на наличие интеркурентных заболеваний. При их наличии животное выводили из эксперимента. Все животные были пронумерованы по принципу их
происхождения и расположения клеток. После 2-х недельного карантина кролики были тщательно осмотрены, учитывались внешний вид, двигательная активность и реакция на рефлексы. Оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях с соблюдением правил асептики и антисептики под общей анестезией (кроликам под общим наркозом (атропин 0,1% в/м, через 5 мин димедрол 0,7 в/м, ксилозин 1,0 в/м, через 10 мин телозол 0,2 в/м) в стерильных условиях линейным разрезом в средней трети голени вдоль оси конечности обнажали диафиз
большеберцовой кости, для создания дефекта кости использовали
стоматологическую бор-машину, при помощи которой выполнили модель оскольчатого перелома. Рану ушивали, кожу вокруг раны обрабатывали бетадином (1 мг раствора содержит 100 мг активного йода, что соответствует 10 мг повидон-йода), накладывали стерильную повязку. Кролики опытных групп первые двое суток получали внутримышечные инъекции витаминов и антибиотиков. Экспериментальные
животные в послеоперационном периоде получали инфузионную и
антибактериальную терапию с применением цефалоспоринов, обезболивающие
средства. Животным опытной группы, начиная с 3-их суток после остеотомии, в 5-ти точках по периметру зоны раневой поверхности вводили внутримышечно по 0,2 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. Всего за один сеанс вводили 1 мл ОТП. Плазмолифтинг проводили каждые 2 дня. Кроликам контрольной группы инъекции ОТП не проводились, рана обрабатывалась ежедневно раствором бетадина.
Оперированных животных содержали по одиночке.
Результаты исследований.
Животным 3-ей опытной группы, начиная с 3-их суток после остеотомии, в 5-ти точках по периметру зоны раневой поверхности вводили внутримышечно по 0,2 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. Всего за один сеанс вводили 1 мл ОТП. АPRP-терапию проводили через каждые 2 дня. Кроликам 2 опытной группы АPRP-лечение
не проводилось, раны обрабатывались ежедневно раствором бетадина.
Животных выводили из
эксперимента по 6 особей в сроки 7, 14, 30, 60 и 90 сутки после операции путем усыпления литической дозой «Изофурана» посредством ингаляционного наркоза до полной остановки сердца и дыхания.
Течение регенеративного процесса в зоне экспериментального перелома оценивалось гистоморфологическим
анализом тканей костной мозоли из зоны перелома. Для морфологических
исследований после забоя животных производили забор трубчатых костей задних конечностей. Макропрепараты фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере. При макроскопической оценке костей 6 кроликов контрольной группы учитывали такие показатели как внешний вид, архитектуру костных трабекул, степень разреженности костной ткани, наличие деструктивно-дегенеративных
изменений мышечной ткани. В опытных группах при макроскопическом
исследовании зоны остеосинтеза обращали внимание на прочность соединения отломков, наличие их смещения, расположение импланта и его влияние на окружающую ткань. Для проведения микроскопического исследования
фрагменты трубчатых костей после фиксации в 800 спирте промывали водой и проводили декальцинацию с помощью этилендиаминотетрауксусной кислоты
(ЭДТА, трилон Б) по Фрейману. Для чего 5% водный раствор ЭДТА доводили с помощью гидроксида натрия до рН 6,0-6,5. Деминерализацию проводили в первые 24 часа при температуре 40С и затем при комнатной температуре при регулярном контроле и смене раствора трилона Б до 24 суток. Кусочки фрагментов костной ткани заливали парафином — целлоидином и готовили срезы толщиной 5,0 мкм. Парафиновые срезы окрашивали
гематоксилином и эозином [7,8,9].
Светооптические микрофотографии при увеличении в 100 и 400 раз получали на цифровом бинокулярном микроскопе DN-300M, сопряжённым с цифровой камерой и
компьютером. Для оценки характера регенераторного процесса после переломов трубчатых костей конечностей в опытных группах определяли видоспецифичность и архитектонику тканей, заполняющих пространство между костными отломками, качественный клеточный состав этой ткани. Оценивали количество остеобластов, остеоцитов и остеокластов, толщину и расположение трабекул, их
пространственное расположение,
количество и диаметр сосудов [10,11,12].
Течение регенеративного процесса в зоне экспериментального перелома оценивалось по рентгенологическим, денсиметрическим признакам и
гистоморфологическому анализу тканей костной мозоли из зоны перелома на 7, 14, 30,60 и 90 сутки после остеотомии. Морфологический анализ костной ткани диафиза бедренной кости позволил изучить процессы новообразования костной ткани после внутримышечного введения 1 мл ОТП и оценить эффект ее действия на процесс репаративной регенерации.
В костной ткани диафиза бедренной кости кроликов изучена зрелая и незрелая кость. В незрелой кости доминировали клеточные элементы и не прослеживалась её пластинчатая структура. Матрикс в незрелой кости имел больше основного вещества. Гаверсовы канальцы в зрелой кости более минерализованы, чем в незрелой.
В костной ткани различаются следующие типы клеток:
1) предшественники костных клеток -покоящиеся клетки, располагающиеся на границах как внутренней, так и наружной поверхностей кости.
2) остеобласты - клетки близкие к фибробластам и хондробластам. Они сохраняют способность к делению. Эти клетки секретируют коллаген и ответственны за минерализацию костей,
3) остеоциты - зрелые костные клетки, заключенные в костный матрикс, который секретируется остеобластами.
4) остеокласты - большие многоядерные клетки, функция которых заключается в резорбции кости. По своей сути, остеокласты являются фагоцитами.
Зрелая кость слагается из цилиндрических единиц — остеонов или Гаверсовых систем. Остеон состоит из концентрически расположенных ламелл, матрикса кости, окружающих Гаверсовый канал, который содержит сосуды и нервы. Гаверсовы каналы соединяются между собой Фолькмановскими каналами.
Исследования микропрепаратов
костной ткани диафиза бедренной кости показали, что дифференциация структур костной ткани не выражена на 7 и 14 сутки, в большом количестве выявлены покоящиеся клетки.
У животных 2 группы под условным названием «опытная без лечения», ОТП не вводили. Через 30 суток отмечено, что костные пластинки еще не сформированы, кость губчатого типа, кровеносные сосуды, содержащие эритроциты в просветах (рис.1). В надкостнице, образованной волокнами и клетками типа фибробластов,
ориентированными параллельно
поверхности кости, выявлены остеобласты (рис.2).
Рис.1. 2 опытная группа без лечения. Бедренная кость кроликов через 1 месяц. Пластинки не сформированы, кость типа губчатой (чёрная стрелка), сосуды (красная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.
Рис.2. 2 опытная группа без лечения. Надкостница бедренной кости кроликов через 1 месяц. В надкостнице (черная стрелка) остеобласты (синяя стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.
Микроскопические исследования показали, что дифференциация структур костной ткани эпифиза бедренной кости кроликов при внутримышечном введении 1 мл ОТП проявляется на 30 сутки опытов.
Через 1 месяц введения ОТП у кроликов 3 группы на микропрепаратах определяются сформированная кость, новообразованные костные балки, формирующие костные каналы.
Сформированная кость
(остеон) состоит из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами (рис.3). Новообразованные костные балки с оссеоидом в центре остеона, кровоснабжающий сосуд в Гаверсовом канале (рис.4). Гаверсовы каналы ориентированы преимущественно вдоль длинной оси кости и окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами.
1 ^ ; > Л К
Рис.3. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 30 суток введения ОТП. Сформированная кость (чёрная стрелка), новообразованные костные балки, формирующие костные каналы (красная стрелка). Сформированная кость (остеон) из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами. В центре остеона кровоснабжающий сосуд в Гаверсовом канале (зелёная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10 Рис.4. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 30 суток введения ОТП. Новообразованные костные балки с оссеоидом (чёрная стрелка), формирующийся Гаверсов канал (красная стрелка). Остеоциты (синяя стрелка), остеобласты (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х40.
Таким образом, результаты гистоморфологических исследований через 30 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлена четкая дифференциация структур костной ткани. Через 30 суток сформирована кость (остеон), состоящая из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами - зрелыми костными клетками, заключенными в костный матрикс, который секретируется остеобластами. Гаверсовы каналы окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами.
Через 60 суток наблюдения во 3 опытной группе на декальцинированных срезах поверхности костной ткани не определяются посторонние включения и
наложения. Результаты
гистоморфологических исследований через 60 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлено, что сформированная пластинчатая кость преобладает над губчатой костью (рис.5). В костной ткани пластинчатая кость преобладает над губчатой, множество остеонов (рис.6), остеокластов, остеобластов, остеоцитов, в Гаверсовом канале сосуды кровенаполнены (рис.7).
Рис.5. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 60 суток введения ОТП. Сформированная пластинчатая кость (чёрная стрелка) преобладает над губчатой костью (красная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.
Рис.6. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 60 суток введения ОТП. Остеоны (чёрная стрелка), губчатая кость (красная стрелка). Пластинчатая кость преобладает над губчатой. Окраска ГЭ. Ув.10х40.
Рис.7. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 60 суток введения ОТП. Остеокласты (чёрная стрелка), остеобласты (красная стрелка), остеоциты (синяя стрелка) сосуд в Гаверсовом канале (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х40.
Несколько иная
гистоморфологическая картина
прослеживается во 2-ой опытной группе (без лечения). Так, через 30 суток опытов, в костной ткани преобладает губчатая ткань, остеононы не сформированы,
немногочисленные остеобласты (рис.8). Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов состоит из губчатой кости. Пластинки полностью не сформированы, фиксируются немногочисленные
остеобласты и остеоциты (рис.9).
В более отдалённые сроки наблюдения 90 суток костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 группы,
которым в области перелома внутримышечно вводили ОТП,
сформировалась пластинчатая ткань и выявлены многочисленные остеоны (рис.10), и зрелые костные пластинки (рис. 11).
В сравнительном аспекте у кроликов 2 группы, которым не вводили ОТП, через 90 суток опытов преобладает губчатая костная ткань, в которой встречаются единичные цилиндрические единицы зрелой кости — остеоны (рис.12), которые появлялись во 3 группе уже через 30 дней экспериментов. Также в костной 2 группы (без лечения) через 90 дней опытов по-прежнему преобладает губчатая ткань (рис.13)
Рис.8. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 2 опытной группы (без лечения) через 90 суток. Губчатая кость (чёрная стрелка), остеоны не сформированы (красная стрелка), остеобласты (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.
Рис.9. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 2 опытной группы (без лечения) через 90 суток. Губчатая кость (чёрная стрелка). Пластинки полностью не сформированы (красная стрелка). Остеобласты, остеоциты (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х40.
%
к
Рис.10. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 90 суток введения ОТП. Сформирована пластинчатая ткань. Многочисленные остеоны (чёрная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.
Рис.11. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 90 суток введения ОТП. Пластинчатая костная ткань сформирована. Костные пластинки (чёрные стрелки). Окраска ГЭ. Ув.10х40.
Таким образом, результаты гистоморфологических исследований через 60 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлено формирование пластинчатой ткани, зрелые костные пластинки и выявлены многочисленные остеоны. Восстановление дефектов костной ткани происходит по типу полного заживления. Гистологические исследования подтверждают интенсивное остеообразование при инъекциях ОТП, начиная с 30 суток экспериментов.
Заключение. Морфологический
анализ костной ткани эпифиза бедренной кости позволил изучить процессы новообразования костной ткани после плазмолифтинга и оценить эффект действия обогащенной тромбоцитами плазмы на процесс репаративной регенерации.
Результаты гистоморфологических исследований через 30 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлена четкая дифференциация структур костной ткани. В этот срок сформирована кость (остеон), состоящая из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами -зрелыми костными клетками, заключенными в костный матрикс, который секретируется остеобластами. Гаверсовы каналы окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами. Результаты гистологических исследований
подтверждены контрольными
рентгеновскими снимками восстановления дефектов костной ткани по типу полного заживления на 60 сутки опытов.
Доклинические исследования эффективности применения АПОТ в лечении диафизарных переломов трубчатых костей проведены согласно договору о научном сотрудничестве №01-20 от 11 февраля2020 г. с Бухарским государственным медицинским институтом
ЛИТЕРАТУРА:
1. Медведев В.Л., Коган М.И., Михайлов И.В., Лепетунов С.Н. Аутологичная плазма обогащённая тромбоцитами: что это и для чего? Вестник урологии. 2020;8(2):67-77. Medvedev
V.L., Kogan M.I., Mihailov I.V., Lepetunov S.N. Platelet-rich autologous plasma: what is it and for what? Urology Herald. 2020;8(2):67-77. (In Russ.).https://doi.org/10.21886/2308-6424-2020-8-2-67-77.
2. Anitua E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int J Oral Maxillofac Implants. 1999;14(4):529-535. PMID:10453668.
3. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental research or other scientific purposes [(ETS № 123, Strasbourg, 18.III.1986.-20 p.(In Russ.)]. http://conventions.coe.int/ Treaty/en/Treaties/ Html/123.htm.-20 p.(In Russ.)].
4. Clause 3.5.2. state standard (GOST) 33044-2014. Interstate standard. Principles of good laboratory practice - M. Standartinform, -2019-26 p.).
5. Technical Code of Practice (TPK) 125-2008 (02040).
6. ГОСТ Р-53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики" («Principles of Good Laboratory Practice»). www.avrora-it.ru > lims > good_laboratory_practic.
7. Меркулов Г.А. Курс патолого-гистологической техники: Медицина.-М.- 1969 С.156-164 [Merkulov G.A. Course of pathological and histological techniques: Medicine.-M.- 1969 S. 156-164 (In Russ.)]. www.labx.narod.ru .
8. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии : рук. / под ред. Д.Э. Коржевского. - СПб. : Спецлит, 2013. - 128 с.
9. Основы обеспечения качества в гистологической лабораторной технике. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2014. 120 с.
10. Полонская Н.Ю. Основы цитологической диагностики и микроскопическая техника : учеб. пособие. - М.: Academia, 2005.
11. Семченко, В.В. Гистологическая техника : учеб. пособие / В.В. Семченко, С.А. Барашкова, В.Н.Артамонов. - Омск : [б. и.], 2002. - 114 c.
12. Бахметьев В.И., Князев Г.А. Морфологические признаки повреждений длинных трубчатых костей при последовательных нагружениях разнотипных структурных сегментов. Матер. V Всеросс. съезда суд. мед. Москва-Астрахань 2000.- С. 163.
