CC BY
49
© *Сыкал А. А., **Дедух Н. В. УДК 616.379-008.64 *Сыкал А. А., **Дедух Н. В.
МОРФОЛОГИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ У ЖИВОТНЫХ
С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
*Харьковская академия последипломного образования (г. Харьков) **ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М. И. Ситенко НАМН Украины» (г. Харьков)
Работу выполнено согласно плана научно-исследовательских работ Харьковской медицинской академии последипломного образования («Кттинно-молекулярн мехаызми запалення, асоцмованого i3 вторинним остеопорозом та Ышими хроычними захворюваннями, № державно! реестрацп 0114U000523»).
Вступление. При сахарном диабете 2 типа (СД 2 типа) нарушается качество кости [6]. Негативное влияние на метаболизм костной ткани оказывает гипергликемия. Доказано, что глюкоза является основным энергетическим источником для остеокластов, дозозависимо повышая их резорбтивную активность. Кроме того, гипергликемия приводит к неферментативному гликозилированию белков костного матрикса, в том числе и основного белка - коллагена 1 типа, что нарушает качество кости [12]. При СД 2 типа нуждаются в исследовании особенности ремоделирования кости и состояние органического матрикса.
Цель исследования заключалась в изучении ре-моделирования костной ткани и состояния коллагенов I и III типов в двух областях бедренной кости (кор-текс и губчатая кость) после моделирования у крыс СД 2 типа.
Объект и методы исследования. Исследование проведено на 10 лабораторных крысах-самках 2 мес. возраста (живая масса 190 ± 20 г) к началу эксперимента. Эксперименты проведены с учетом требований «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, которых используют в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1986) и Закона Украины о гуманном отношении к экспериментальным животным [2,3]. СД 2 типа моделировали на пяти животных согласно методу, разработанному S. Islam, H. Choi [8]. Пять животных без патологии служили контролем. Для гистологических исследований выделяли бедренную кость у контрольных животных и у животных с моделированным СД 2 типа. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости, декальцинировали в 5% растворе азотной кислоты и заключали в целлоидин. Для световой микроскопии срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизон. Анализировали окрашенные срезы под микроскопом AxioStarPlus. Используя метод ГГ. Ав-тандилова [1] оценивали следующие показатели: объем (%) трабекулярной кости (отношение объ-
ема костных трабекул к объему костные трабекулы + костный мозг, ширина (мкм) костных трабекул (ок. 10, об. 40); - количество лакун с остеоцитами и пустых лакун в поле зрения микроскопа (ок. 10, об. 40); количество пустых резорбционных полостей на костных трабекулах на площади 25 мм2 (ок. 10, об. 10); количество резорбционных полостей на костных трабекулах, содержащих остеокласты, остеобласты или макрофагами на площади 25 мм2 (ок. 10, об. 10). В каждом отдельном случае анализировали три поля зрения на каждом срезе. Сравнительный анализ по тем же показателям проведен с контрольной группой животных.
Гистохимические исследования включали оценку коллагенов I и III типов после постановки реакции с сириусом красным [9]. В костной ткани коллаген I типа при исследовании в поляризованном свете дает красно-оранжево-желтое свечение в зависимости от толщины и зрелости коллагеновых волокон. Коллаген III типа светится зеленым цветом. Для оценки гли-козаминогликанов срезы окрашивали толуидиновым синим при рН 2,5 для выявления сульфатированных гликозаминогликанов - хондроитин-4-сульфата и хондроитин-6-сульфата [4]. Анализ срезов с поставленными гистохимическими реакциями проводили в поляризованном свете (микроскоп Olympus BX 53). Фотографировали препараты с помощью цифровой фотокамеры Canon E0S-300D. Статистический анализ цифровых показателей проводили в пакете для статистических исследований IBM SPSS Statistics.
Результаты исследования и их обсуждение
Кортекс в области середины диафиза бедренной кости крыс с СД 2 типа был на 11,8% тоньше по сравнению с контрольным животными, что свидетельствует о снижении периостального косте-образования. На участках линии склеивания были извитыми, размытыми, с очагами гомогенизации и повышенной базофилии (рис. 1 А). Плотность остеонов была низкой. Известно, что у больных СД 2 типа имеет место дефицит инсулиноподобного фактора роста 1, и в условиях его дефицита на 40% снижается скорость образования остеонов [7]. Остеоны имели расширенный центральный канал, с неравномерным ассиметричным расположением костных пластинок и низкой плотностью в пластинах остео-цитов, спайными линиями с неравномерными контурами и толщиной (рис. 1 Б). На участках спайная линия имела неструктурированный аморфный вид. Зачастую плотность кости в таких областях была на-
Рис. 1. А) Участок кортекса бедренной кости. Линия склеивания на участках размытая, широкая, без четких контуров. Трещины в области наружных генеральных пластинок. Пустые лакуны без остеоцитов. Б) Нарушение организации остеонов. Расширенные центральные каналы. Ассиметричные спайные линии. Пустые
лакуны. Гематоксилин и эозин. Ув. 1000.
рушена, о чем свидетельствует присутствие трещин и щелей, отделяющих остеоны от вставочных пластинок или других остеонов. Обнаружены обломочные структуры остеонов, как показатель нарушения компенсаторных механизмов кости при нагружении животными конечности в условиях СД 2 типа. У некоторых остеонов центральный канал был окружен гиперкальцифицированным кольцом.
Слой вставочных пластинок, располагающихся среди остеонных конструкций, неравномерный, зачастую в этой области присутствовали очаги лизиса костной ткани или не перестроившиеся участки хрящевой ткани. Так как моделирование сахарного диабета 2 типа было проведено в период активного роста животных, оставшиеся хрящевые островки в кортексе свидетельствуют о нарушении энхон-дрального остеогенеза в условиях развивающейся патологи на фоне гипергликемии.
В толще кортекса и на его эндостальной поверхности обнаружены резорбтивные полости, сливающиеся на участках. На повышение полостей резорбции в компактной кости указывали и другие исследователи при использовании высоко-разрешающей периферической компьютерной томографии при обследовании пациентов с СД 2 типа [10].
Очаги резорбции костной ткани в кортексе крыс с СД 2 типа не были заполнены остеобластами. Среди остеоцитов повышена плотность клеток с плотными или фрагментированными ядрами, что может свидетельствовать о начальных проявлениях апоптоза. Если сравнивать плотность остеоцитов в кортексе у животных контрольной и опытной групп, характерной особенностью было повышение на 130% лакун, не заполненных остеоцитами у животных с СД 2 типа, что свидетельствует о гибели клеток.
На эндостальной поверхности кортекса контрольных животных обнаружены остеобласты, располагающиеся в один или несколько слоев, которые характеризовались различной функциональной активностью. Плотность остеобластов на эндосталь-ной поверхности кортекса у животных с СД была
снижена по сравнению с аналогичными участками кортекса контрольных животных.
Важным показателем, характеризующим перестройку костной ткани, является ремоделирование. В компактной кости контрольных животных ремоде-лирование проходило в соответствии классическими представлениями об этом процессе [11]. Согласно стадийности процесса ремоделирования после резорбции кости остеокластами в полость резорбции мигрируют макрофаги, функция которых заключается в очистке области от костной стружки, затем область резорбции заполняется остеобластами, синтезирующими остеоид, процесс заканчивается минерализацией остеоида. Процесс ремоделиро-вания компактной кости происходит в основном по каникулярному типу.
Губчатая кость. Организация не только кортекса, но и трабекулярной сети в эпиметафизах бедренной кости у животных с СД 2 типа отличалась от контрольных животных. У контрольных животных костные трабекулы формировали мелкопетлистую сеть, характеризувались высокой отеоинтеграцией с кор-тексом. У животных с СД 2 типа костные трабекулы в крупнопетлистой сети теряли связь друг с другом. В центральных отделах метадиафиза костные трабекулы в костном мозге располагались в виде изолированных фрагментов (рис. 2 А, Б). Остеоинтеграция костных трабекул с кортексом была нарушена. Зафиксированы лишь единичные контакты. Установлено, что в трабекулярной костной ткани площадь костных трабекул у животных с СД 2 типа была снижена на 19,6%. Костные трабекулы в дистальном отделе бедренной кости животных с моделированным СД 2 типа были неравномерной ширины, по сравнению с контрольными животными ширина трабекул была на 18,3% меньше.
Несмотря на то, что для экспериментального исследования были взяты молодые животные, в меж-трабекулярных пространствах красный костный мозг перемежался с желтым. Известно, что повышение адипогенеза - это характерная особенность изменений клеточного состава костного мозга при СД 2
типа, что приводит к снижению клеток-предшественников остеобластов, при этом ухудшается качество кости [5].
Краевая поверхность костных трабекул на больших территориях была не покрыта остеобластами. На участках трабекул присутствовали в основном остеобласты уплощенной формы, что характерно для неактивных остеобластов. Активные остеобласты находили лишь на небольших территориях костных трабекул. Они имели полигональную форму и крупное гипохромное ядро. У контрольных животных большинство костных трабекул было покрыто активными остеобластами с крупными слабо базо-фильными ядрами и обильной цитоплазмой.
В бедренной кости животных с СД 2 типа выявлено повышение на 143,8% лакун безостеоцитов.
У контрольных животных большинство лакун было заполнено остеобластами. Важным показателем ремоделирования кости является оценка остеокластов. После резорбции остеокластами в лакунах располагались макрофаги или остеобласты. В опытной серии на костных трабекулах обнаружено большое количество резорбционных полостей с остеокластами (рис. 3 А), полостей не заполненных остеобластами (рис. 3 Б), что приводит к негативному ре-моделированию, то есть преобладанию резорбции кости над костеобразованием. Выявлено повышение в 1,7 раза остеокластов по сравнению с контролем (10,1 остеокластов в контрольной группе, 5,93 -в опытной группе).
В полостях резорбции располагались клетки с пикнотичными ядрами, что может отражать гибель клеток путем апоптоза, либо клетки костного мозга и неидентифицированные лизированные клетки.
Костные трабекулы имели на участках неравномерные контуры. Количество резорбционных полостей, заполненных остеобластами или макрофагами, у животных с СД 2 типа было снижено на 75,2% по сравнению с контрольными животными.
Оценка состояния коллагена. У животных с СД 2 типа кортексы губчатая кость по организации колла-геновых волокон различались на участках. При исследовании межклеточного вещества кортекса бедренной кости контрольных животных выявлено, что органический матрикс выполнен преимущественно зрелым коллагеном 1 типа, на что указывает красное свечение (рефракция) волокон в поляризованном свете. Коллагеновые волокна были равномерно распределены по территории кортекса. Рефракция отсутствовала в основном в участках расположения остеоцитов.
В области остеонного слоя у животных с СД 2 типа коллагеновые волокна были выполнены в основном незрелым коллагеном с преобладанием коллагена III типа, который в поляризованном свете дает зеленую рефракцию. Коллагеновые волокна располагались в виде слоев с угловой ориентацией. Со стороны эн-доста выявлены зрелые коллагеновые волокна, которые выполнены коллагеном I типа, характерной особенностью которого было красно-желтое свечение в поляризованном свете. В области формирования лакун резорбции определяются в основном коллаге-новые волокна желтого свечения, что характерно для тонких коллагеновых волокон, содержащих коллаген I типа. Наряду с такими участками, у животных с СД 2 типа обнаружены области с нормальным распределением коллагена 1 типа, дающего на территориях красное свечение.
При исследовании костных трабекул животных с СД 2 типа в поляризованном свете выявлено, что костные трабекулы были выполнены в основном тонкими волокнами с коллагеном 1 типа, дающего рефракцию желтого цвета. Кроме того, обнаружены области рефракции коллагена III типа. После постановки реакции на гликозаминогликаны рефракция была снижена вокруг остеоцитов, что свидетельствует о низких метаболических показателях этих клеток. На территории костных трабекул нарушена интегра-
Рис. 2. Изолированные костные трабекулы губчатой кости. А) Адипоциты в красном костном мозге. Гематоксилин и эозин. Ув. 200. Б) Неравномерная структурная организация коллагеновых волокон в костных трабекулах. Реакция с сириусом
красным. Поляризованный свет. Ув. 100.
Рис. 3. Ремоделирование кости. А) Остеокласт формирует полость резорбции. Б) Полость резорбции не заполненная остеобластами. Фрагмент кости с очагами лизиса. Животное с СД 2 типа.
Гематоксилин и эозин. Ув. 1000.
ция в структуре «коллагеновые волокна - гликоза-миногликаны», что приводило к расслоению пучков коллагеновых волокон.
Данные морфологического исследования компактной и губчатой кости, дополненные проведенным морфометрическим анализом, свидетельствуют о нарушении ремоделирования у животных с СД 2 типа - снижении темпов костеобразования и усилении процесса резорбции, что приводит к нарушению качества кости. У животных с СД 2 типа снижена плотность остеонов и нарушена их организация. Установлено нарушение органической матрицы костной ткани за счет формирования участков с тонкими коллагеновыми волокнами I типа и областей с волокнами, содержащими коллаген III типа.
Выводы
1. У животных с СД 2 типа плотность остеонов снижена. Нарушено качество остеонных конструкций. Остеоны имели расширенный центральный канал, с неравномерным ассиметричным распо-
ложением костных пластинок и низкой плотностью в пластинах остеоцитов. На участках спайная линия имела неструктурированный аморфный вид, присутствовали трещины и щели.
2. Ремоделирование костной ткани у животных с СД 2 типа нарушено за счет повышения лакун резорбции не заполненных остеобластами и макрофагами. В очагах резорбции повышена плотность остеокластов. В кортексе увеличены площади, занимаемые полостями резорбции.
3. Органический матрикс костной ткани нарушен за счет формирования очагов незрелого коллагена 3 типа.
Перспективы дальнейших исследований
Необходимы дальнейшие исследования структурно-функциональных особенностей костной ткани, ремоделирования кости на стадиях развития сахарного диабета в условиях остеотропной терапии, направленной на повышение качества кости.
Литература
1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия / Г Г. Автандилов. - М.: Медицина, 1990. - 381 с.
2. бвропейська конвенщя про захист хребетних тварин, що використовуються для дослщних та шших науковихцшей. Страсбург,
18 березня 1986 року: офщмний переклад [Електронний ресурс] / Верховна Рада УкраУни. - Офщ. веб-сайт. - ^жнародний документ Ради бвропи). - Режим доступу до документа: http: zakon.rada.gov.ua/cgi-bin/laws/main.cgi?nreg=994_137.
3. Закон УкраУни № 3447-IV вщ 21.02.2006 «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» (Стаття 26).
4. Керн М. Принципы поляризационно-оптического анализа в изучении соединительной ткани / М. Керн, Л. Модиш, Н. В. Дедух
[и др.] // Архив анат., гистол. и эмбриол. - 1985. - Т 88, № 6. - С. 5-12.
5. Botolin S. Bone loss and increased bone adiposity in spontaneous and pharmacologically induced diabetic mice / S. Botolin,
L.R. McCabe // Endocrinology - 2007- Vol. 148.- P. 198-205.
6. Carnevalea V. Bone damage in type 2 diabetes mellitus / V. Carnevalea, E. Romagnolib, L. D'Erasmoetal // Nutrition, Metabolism and
Cardiovascular Diseases.- 2014.- Vol. 24, № 11.- P. 1151-1155.
7. Hough S. Fast and slow bone losers. Relevance to the management of osteoporosis / S. Hough // Drugs Aging. - 1998.- № 12.- P. 1-7.
8. Islam S. Nongenetic model of type 2 diabetes: A comparative study / S. Islam, H. Choi // Pharmacology. - 2007. - Vol. 79. - P. 243-249.
9. Li X. J. Detection of collagens in hypertrophic scars by picrosirius polarization method / X. J. Li, T. Lei, J. H. Gao // - 2002. -Vol. 422,
№ 3. - P. 217-219.
10. Patsch J. M. Increased Cortical Porosity in Type 2 Diabetic Postmenopausal Women With Fragility Fractures / J. M. Patsch, A. J. Burghardt, S P. Yapetal // J. of Bone and Mineral Research.- 2013.- Vol. 28, No. 2.- P.313-324.
11. Raggatt L. J. Cellular and molecular mechanisms of bone remodeling / L. J. Raggat, N. C. Partridge // J. Biol. Chem. - 2010. -Vol. 285. - P. 25103-25108.
12.Vashishth D. Influence of nonenzymatic glycation on biomechanical properties of cortical bone / D. Vashishth, G. J. Gibson, L.Khouryetal // Bone. - 2001.-Vol. 28.-P. 195-201.
УДК 616.379-008.64
МОРФОЛОГ1Я К1СТКОВО1 ТКАНИНИ У ТВАРИН З ЦУКРОВИМ Д1АБЕТОМ 2 ТИПУ
Сикал О. О., Дедух Н. В.
Резюме. Дослщжено морфологiю кютки у тварин з цукровим дiабетом 2 типу. В кортексу виявлено пору-шення оргаызаци та щiльностi остеонних конструкцiй, формування резорбтивних порожнин за рахунок ремо-делювання кiстки за канiкулярним типом, пщвищення щiльностi лакун без остеоци™. У губчасто! кiстки порушена трабекулярна сiтка, знижена щiльнiсть активнихостеоблас™ на крайових поверхнях кiсткових трабекул, пiдвищена щiльнiсть остеокластiв та порожнин резорбцп не заповнених остеобластами. Порушена оргаызащя колагенового матриксу за рахунок формування дтянок з III типом колагену.
Ключовi слова: щури, цукровий дiабет 2 типу, морфологiя кютки, коллагени, остеони.
УДК 616.379-008.64
МОРФОЛОГИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ У ЖИВОТНЫХ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
Сыкал А. А., Дедух Н. В.
Резюме. Исследована морфология кости у животных с сахарным диабетом 2 типа. В кортексе выявлено нарушение организации и плотности остеонных конструкций, формирование резорбтивных полостей за счет ремоделирования кости по каникулярному типу, повышение плотности лакун без остеоцитов. В губчатой кости нарушена трабекулярная сеть, снижена плотность активних остеобластов на краевых поверхностях костных трабекул, повышена плотность остеокластов и полостей резорбции не заполненных остеобластами. Нарушена организация коллагенового матрикса за счет формирования участков с III типом коллагена.
Ключевые слова: крысы, сахарный диабет 2 типа, морфология кости, коллагены, остеоны.
UDC 616.379-008.64
THE MORPHOLOGY OF BONE TISSUE IN ANIMALS WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS
Sykal A. A., Dedukh N. V.
Abstract. The quality of the bone tissue in patients with type 2 diabetes mellitus (type 2 DM) is broken, which increases the risk of fracture. Morphological studies are needed to assess the structural features of the organization of the bone; it can be carried out on experimental animals.
The purpose of our study was to clarify of bone remodeling and the collagen types I and III on femur in 2 specific areas (cortex and trabecular bone) after modeling in rats type 2 DM.
Object and methods. Type 2 DM was produced by administering laboratory rats (n=5, two months of age) intraperitoneal^ 230 mg/kg nicotinamide and introduction of 65 mg/kg streptozotozin (S. Islam, H. Choi, 2007), 5 healthy rats were used as control. The animals were removed from the experiment after 28 days. Experiments conducted in compliance with International norms and Ukrainian law of bioethics. Object of the study was diaphysis and distal areas of femur. It has been done histological (with bone morphometric) and histochemical investigation of collagens I and III types into the bone. The reaction was performed with sirius red F3B [ Li X. J. et al., 2002].
Results. Disorders of the organization identified in compact and trabecular bone. It is revealed, that with of cortex of experienced animals was reduced on 11.8% comparing with control ones. On line adhering sites were crimped, blurry, with site of homogenization and increased basophilic.
The density of osteons it was low, some of them were presented with expanded central canal, with uneven asymmetric location of bone laminas and low density in laminas of osteocytes, disorganized cement lines, that had uneven contours and with. Clastic structures of osteons were noticed as an index of compensative mechanism of bone disorders when loading the limb. It has been in dicated that cortical porosity is significantly higher in diabetic animals when compared with normal animals. Quantity of lacunas without osteocytes into cortex was above 130% comparing with control animals.
In trabecular bone trabecules were narrow, with isolated location. Between trabecular spaces increased density of adipocytes, despite the fact that in the experiment used young animals. Marginal surface of bone trabecules on huge territories was not covered by osteoblasts. On trabecular sites were presented flatted shape like osteoblasts. Active osteoblasts were discovered only on small territories of bone trabecules.
Bone remodeling was broken. The majority of resorbtive cavities had no osteoblasts, nevertheless the number of osteoclasts was highly increased. In cancelloius bone the area of bone trabecules in animals with 2 type DM was decreased on 19.6%, with - 18.3% comparing with the controlled ones. The density lacunes without osteocytes was increased on 143.3% comparing with the controlled ones. The number resorbtive cavities filled with osteoclasts or macrophages in animals with 2 type DM is decreased on 75.2% comparing with index of the normal ones.
If organic matrix of bone in normal animals is filled with I type collagen, as red refraction indicating that, then in animal with 2 type DM cortex and bone trabecular sides noticed areas filled with non-mature collagen with predominance of III type collagen and thin fibers I type collagen.
Conclusion. The data of morphological investigation of bone condition in animals with 2 type DM indicates that the bone remodeling is decreased - lower pace of bone formation and intensification of resorbtion, leading to a decrease of quality of bone. Particular disorder of bone organic matrix, it is disorder of collagen types - formation of areas with collagen III type.
Keywords: rats, 2 type diabetes mellitus, bone morphology, collagen, osteons.
Рецензент - проф. Врошенко Г. А.
Стаття надшшла 01.11.2015 року
