CC BY
123
ОЦЕНКА МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
PEMfDULJM I I 73
ЛЛ. ШАМАЛЬ, Т.А. ЯРУШОК, И.Е. ШОХИН, Г.В. РАМЕНСКАЯ
Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Изучение равновесной биофармацевтической
растворимости субстанций лс, применяемых
при лечении онкологических заболеваний
В работе проведено определение равновесной биофармацевтической растворимости субстанций лекарственных средств, применяемых при лечении онкологических заболеваний методом встряхивания в термостатируе-мом шейкере при температуре 37 при скорости вращения 1 400 об/мин в течение 24 ч.
Ключевые слова: онкологические заболевания, темозоломид, иматиниба мезилат, капецитабин, биофармацевтическая классификационная система, равновесная биофармацевтическая растворимость
• ВВЕДЕНИЕ
Биофармацевтическая классификационная система была разработана для того, чтобы использовать научные знания для оценки биофармацевтических свойств субстанций (активных фармацевтических ингредиентов) — водной растворимости и кишечной проницаемости [1]. Данные о растворимости и проницаемости необходимы технологам и разработчикам для улучшения высвобождения лекарственного вещества из лекарственной формы и подбора оптимального состава вспомогательных веществ [2]. Основная цель биофармацевтической классификационной системы — создание регуляторного орудия, которое позволяет упростить некоторые испытания биоэквивалентности тестами in vitro [3]. В настоящее время согласно Руководству по экспертизе лекарственных средств (том I) возможно предоставление данных о сравнительной кинетике растворения дженерика и препарата сравнения без исследований биоэквивалентности для дополнительных дозировок при соблюдении определенных условий [4]. Наиболее полное представление о биофармацевтических свойствах активных фармацевтических ингредиентов сокращает время и снижает затраты при разработке лекарственной формы и выводе лекарственного препарата на рынок, не снижая его качества, что особенно важно для дорогостоящих препаратов, используемых в лечении онко-
логических заболеваний, ВИЧ и т. д. Растворимость лекарственного вещества, измеренная в воде, не всегда отражает растворимость в желудочно-кишечном тракте. Использование водной растворимости для предсказывания абсорбции лекарственного средства для перорального применения может привести к выраженным отклонениям в оценке биодоступности, особенно для плохо растворимых и липофильных лекарственных веществ. Механизмы, ответственные за усиление растворимости в просвете желудочно-кишечного тракта, обсуждаются [5].
Keywords: cancer, temozolomide, imatinib mesylate, capecitabine, biopharmaceutical classification system, equilibrium biopharmaceuti-cal solubility
In the paper there is determination of the equilibrium biopharmaceutical solubility of the drug substances used in the treatment of cancer by shaking in a shaker-incubator at 37 °C at a speed of 1400 r / min for 24 hours. L.L. SHAMAL, T.A. YARUSHOK, I.E. SHOKHIN, G.V. RAMENSKAYA, First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov. EQUIVALENCE STUDY OF BIOPHARMACEUTICAL SOLUBILITY OF DRUG SUBSTANCES USED IN THE TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES.
Для определения растворимости ЛС равновесная растворимость оценивается в условиях, соответствующих физиологическим; другими словами, это значение должно быть определено при температуре 37 ± 1 °С в различных средах со значениями рН в диапазоне 1—7,5. Класс растворимости получается путем расчета объема раствора, необходимого для растворения максимальной дозировки во всем диапазоне рН [1]. Цель настоящего исследования — изучить биофармацевтическую растворимость лекарственных веществ, применяемых для лечения онкологических заболеваний — темозоломида, иматиниба и капецитабина, входящих в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП) [6]. Кроме того, данные препараты входят в список стратегически значимых лекарств [7]. Государство ставит задачу, чтобы к 2015 г. все эти ЛС производились только на территории страны.
• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. ф Темозоломид (3,4-Дигидро-3-метил-4-оксоимидазо[5,М]-1,2,3,5-тетразин-8-карбоксамид) (рис. 1), субстанция-порошок (страна-производитель — Россия, содержание темозоломида 99,86%). Белый кристаллический порошок, малорастворимый в воде и растворах кислот (около 3 мг/мл). Фармакологическое действие: противоопухолевое, алкилирующее, иммуно-депрессивное. В системном кровотоке при физиологических значениях рН подвергается быстрому химическому превращению в цитотоксичный мономе-тилтриазеноимидазолкарбоксамид (МТИК). Цитотоксическое действие МТИК обусловлено алкилированием гуанина в
74 iHOTJpEMffllUM
ОЦЕНКА МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
положении Об и N7 (дополнительно) с последующим запуском механизма аберрантного восстановления метилового остатка. Нарушает структуру и синтез ДНК, клеточный цикл. 4 Иматиниба мезилат (рис. 2), субстанция-порошок (страна-производитель — Россия, содержание иматиниба мезила-та 98,97%). Иматиниб (4-[(4-Метил-1-пиперазинил)метил]-^[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримиди-нил]амино]фенил]бензамид (и в виде мезилата)).
Иматиниба мезилат — белый или почти белый с коричневатым или желтоватым оттенком кристаллический порошок. Растворим в водных буферных растворах при pH < 5,5; растворим очень незначительно или нерастворим в нейтральных/щелочных водных растворах. Растворимость в неводных растворителях варьирует от неограниченной до очень незначительной в диме-тилсульфоксиде, метаноле и этаноле; нерастворим в n-октаноле, ацетоне и ацетонитриле. Молекулярная масса 589,7.
Фармакологическое действие: противоопухолевое средство, ингибитор протеинтирозинкиназы (Bcr-Abl ти-розинкиназы) — аномального фермента, продуцируемого филадельфийской хромосомой при хроническом миелолейкозе.
+ Капецитабин (страна-производитель — Россия, содержание капецита-бина 99,75%). Капецитабин (5'-Дезок-си-5-фтор-^[(пентилокси)карбо-нил]цитидин) (рис. 3). Белый или почти белый кристаллический порошок с растворимостью в воде 26 мг/мл при 20 °С.
Фармакологическое действие: противоопухолевое. Активируется в ткани опухоли и оказывает на нее селективное цитотоксическое действие; in vitro капецитабин цитотоксическим действием не обладает. В организме превращается в 5-фторурацил (5-ФУ), который подвергается дальнейшему метаболизму. Образование 5-ФУ из капеци-табина происходит в ткани опухоли (под действием опухолевого ангиоген-ного фактора тимидинфосфорилазы), что сводит к минимуму системное воздействие 5-ФУ на здоровые ткани организма. Как здоровые, так и опухолевые
рисунок Г 1 Структурная формула темозоломида
рисунок Г 2 Структурная формула иматиниба
1сунок Структурная формула капецитабина
клетки метаболизируют 5-ФУ в цито-токсически активные метаболиты: 5-фтор-2'-дезоксиуридина монофосфат (ФдУМФ) и 5-фторуридина трифосфат (ФУТФ).
• ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ
♦ Стандартный раствор темозоломида. Около 25 мг (точная навеска) стандартного образца темозоломида помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли приблизительно 35 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или рН 6,8), помещали колбу в ультразвуковую ванну на 5 минут. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем тем же растворителем до метки и переме-
шивали (концентрация полученного раствора 1 темозоломида равна 0,5 мг/мл). 1 мл раствора 1 помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 40 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты рН 1,2 или буферного раствора (рН 4,5 или рН 6,8), перемешивали, доводили объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 2 темозоломида равна 0,01 мг/мл).
Темозоломид в буферном растворе при значении рН 6,8 частично гидролизу-ется с образованием активного цито-токсического триазена МТИК, что проявляется внешне пожелтением раствора спустя 4 ч.
♦ Стандартный раствор иматиниба мезилата. Около 50 мг (точная навеска) стандартного образца иматиниба ме-зилата вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или рН 6,8), доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 1 иматиниба ме-зилата 0,5 мг/мл). 1 мл полученного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 2 иматиниба мезилата 0,01 мг/мл).
♦ Приготовление стандартного раствора капецитабина. Около 20 мг (точная навеска) стандартного образца ка-пецитабина помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяли в 40 мл спирта 96%, доводили объем раствора 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты или буферного раствора (рН 4,5 или рН 6,8) до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 1 капецитабина 0,1 мг/мл). 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 8 мл растворителя с соответствующим рН, перемешивали. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем до метки тем же растворителем, перемешивали (концентрация полученного раствора 2 капецитабина 0,01 мг/мл).
РАВНОВЕСНАЯ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ РАСТВОРИМОСТЬ СУБСТАНЦИЙ ЛС
ршшиим
НОЯБРЬ 2 0 14
75
рисунок Г 4 УФ-спектр стандартного раствора темозоломида (0,1 M раствор хлористоводородной кислоты pH 1,2)
рисунок Г 5 УФ-спектр стандартного раствора иматиниба мезилата (0,1 M раствор хлористоводородной кислоты pH 1,2)
I ï; ï:: а
• МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЯ
Определение равновесной растворимости субстанции проводили на приборе — термошейкере в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 °С в трех средах: буферных растворах с pH 4,5; 6,8 и 0,1 M HCl pH 1,2. Испытание проводили в трех повторностях для каждой из сред растворения. В микропробирку Eppendorf вместимостью 1,5 мл со средой растворения (объем среды растворения 1 мл) помещали по 0,1 г исследуемой субстанции. Спустя 24 ч (4 ч для субстанции те-мозоломида в среде буферного раствора pH 6,8) после начала испытания пробы незамедлительно центрифугировали. 4 Для темозоломида: 100 мкл надосадоч-ной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 9,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 1 мл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2).
Количественный анализ полученных растворов темозо-ломида проводили методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб из-
меряли на спектрофотометре при максимуме поглощения 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. Временной период проведения испытания в буферном растворе pH 6,8 был уменьшен в связи с тем, что темозоломид при значениях pH выше 5,0 достаточно быстро разлагается с образованием активного метаболита — МТИК, имеющего максимум поглощения при длине волны 316 нм (рис. 4).
♦ Для иматиниба мезилата: 100 мкл на-досадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью
рисунок Г 6 УФ-спектр стандартного раствора капецитабина (0,1 M раствор хлористоводородной кислоты pH 1,2)
дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 2 — конечное для фосфатного буфера рН 6,8). 1 мл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,0 мл среды растворения, также перемешивали (разведение 3 — конечное для 0,1 М НС1 и ацетатного буфера рН 4,5). Количественный анализ полученных растворов проводили методом УФ-спектрофото-метрии. Оптическую плотность проб измеряли при максимуме поглощения 265 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения (рис. 5). ♦ Для капецитабина: 100 мкл надосадочной жидкости помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивали на вортексе в течение 20 с (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещали в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляли 4,9 мл среды раство-
76 |НоБЛ|РЕМШииМ
ОЦЕНКА МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
таблиц^ 1 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
Название субстанции/ стандартного образца Среда растворения Растворимость, мг/мл (среднее значение) Дозовое число D0 (среднее значение) D/S, мл (среднее значение) Растворимость «высокая/ низкая»
Темозоломид 0,1 M HCl pH 1,2 6,54 6,54 38,25 «высокая»
pH 4,5 6,44 6,44 38,89
pH 6,8 6,62 6,56 38,15
Иматиниба мезилат 0,1 M HCl pH 1,2 88,97 222,43 1,12 «высокая»
pH 4,5 145,21 363,02 0,69
pH 6,8 16,35 40,86 6,12
Капецитабин 0,1 M HCl pH 1,2 - - -
pH 4,5 27,4591 13,73 18,21 «высокая»
pH 6,8 25,4686 12,73 19,63
рения, также перемешивали (разведение 2). Количественный анализ полученных растворов проводили методом УФ-спектрофотометрии (рис. 6). Оптическую плотность проб измеряли при максимуме поглощения 310 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. В среде растворения 0,1 М хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм, что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила (в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 °С).
• РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Значения биофармацевтической растворимости субстанций рассчитывали по формуле:
S =
DixCstxVxP
dSTxIÔÔ
где S — биофармацевтическая растворимость, мг/мл; Dj — оптическая плотность испытываемого раствора; Dst — оптическая плотность стандартного раствора; V — разведение испытываемого раствора; P — содержание исследуемой субстанции в стандартном образце, %. Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляли с использованием пакета Microsoft Office Excel 2007 путем расчета среднего значения количества растворившейся субстанции и относительного стандартного отклонения (RSD, %). Для каждой величины растворимости субстанции в соответствующем буферном растворе проводили расчет отно-
шения дозы к растворимости, которое рассчитывали по формулам, рекомендованным ВОЗ и FDA
D/S = D / S,
' max ' '
где: D/S — отношение дозы к растворимости, мл; Dmax — максимальная дозировка ЛС, зарегистрированная в РФ к медицинскому применению. Растворимость субстанций считалась «высокой», если величина D/S принимала значение менее 250 мл. Расчет дозового числа проводился по формуле:
Do = 250 х S, мг/мл / Dmax, мг,
где S, мг/мл — биофармацевтическая растворимость, Dmax, мг — максимальная дозировка (критерий приемлемости Do > 1). Полученные результаты представлены в таблице 1.
• ВЫВОДЫ
Была определена равновесная биофармацевтическая растворимость субстанций ЛС, используемых при лечении онкологических заболеваний, методом встряхивания в термостатируемом шей-кере в микрообъемах при температуре 37 °С и скорости вращения 1 400 об/мин в течение 24 ч. По результатам исследования равновесная растворимость темо-золомида и иматиниба мезилата была классифицирована как «высокая» во всех трех средах растворения, а капецитаби-на как «высокая» в буферных растворах с pH 4,5 и 6,8. В среде растворения 0,1 М хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм (в отличие от 310 нм для
стандартного раствора капецитабина, приготовленного в комнатных условиях), что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила в течение 24 ч при 1 400 об/мин и 37 °С.
3
ИСТОЧНИКИ
1. Michele G Issa, Humberto G Ferraz. Intrinsic Dissolution as a Tool for Evaluating Drug Solubility in Accordance with the Biopharmaceutics Classification System. Dissolution Technologies, 2011, 3: 6-15.
2. Draft Guidance for Industry, Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms containing certain Active Moieties. Active Ingredients based on a Biopharmaceutics Classification System, February 1999, CDER/FDA.
3. Amidon GL, Lennernas H, Shah VP, Crison JRA. A Theoretical Basis For a Biopharmaceutic Drug Classification: The Correlation of In Vitro Drug Product Dissolution and In Vivo Bioavailability. Pharmaceutical Research, 1995, 12: 413-420.
4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. I. М.: Гриф и К., 2013.
5. Dressman J.B., Vertzoni M., Goumas K., Reppas C. Estimating drug solubility in the gastrointestinal tract. Advanced Drug Delivery Reviews, 2007, 59: 591-602.
6. Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП). Утвержден распоряжением Правительства РФ от 7 декабря 2011 г. №2199-р. М., 2011.
7. Список стратегически значимых лекарств. Распоряжение №1141 от 06.07.2010 «Об утверждении перечня стратегически значимых лекарственных средств, производство которых должно быть обеспечено на территории Российской Федерации для лечения наиболее распространенных заболеваний».
