CC BY
48
УДК 616.71-007.234-092-08.276.3
ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ СБОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ИХ ДИНАМИКА В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОМ «ВОБЭНЗИМ» У БОЛЬНЫХ ОСТЕОАРТРОЗОМ
С. А. Комарова2, Л. А. Ибрагимова1, Ф. Х. Камилов1
1 Башкирский государственный медицинский университет, 2Городская клиническая больница № 18, г. Уфа
Целью и задачами настоящей работы явилось исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), ферментов каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) в плазме и эритроцитах, уровней цитокинов ИЛ-Щ ФНО-а, ИЛ-4 в плазме крови у пациентов с первичным остеоартрозом в динамике с назначением препарата «Вобэнзим». Для исследования продуктов ПОЛ использовался метод И. А. Вол-чегорского, каталаза определялась методом М. А. Королюк, цитокины — методом иммуноферментного анализа. Выявлено повышение первичных продуктов ПОЛ на 35,7%, ИЛ-1р и ФНО-а — более чем в 2 раза, снижение активности ферментов антиоксидантной защиты (р<0,05). Прослеживается связь между содержанием первичных продуктов ПОЛ, ИЛ-ф, ФНО-а, СОД плазмы и тяжестью заболевания. Применение вобэнзима способствовало более эффективному повышению активности каталазы эритроцитов и уровня ИЛ-4, а также снижению содержания ИЛ-1р.
Ключевые слова: свободнорадикальное окисление, каталаза, супероксиддисмутаза, цитокины, остеоартроз, вобэнзим.
Введение
Остеоартроз (ОА) занимает одно из первых мест по распространенности среди ревматических заболеваний, которая охватывает 20% населения земного шара. Рентгенологические признаки заболевания встречаются у пациентов старше 75 лет в 100% случаев [5]. ОА вызывает ухудшение качества жизни [4], становится причиной инвалидизации [21], а также значительных затрат на хирургическое лечение (эндопротезирование суставов) [10].
Несмотря на активное внимание к этой проблеме, патогенез первичного остеоарт-роза до конца не раскрыт. Не все исследователи придерживаются мнения, что в основе
заболевания лежат только естественное старение, дегенерация хряща и околосуставных тканей [2]. В настоящее время является неоспоримым факт участия неконтролируемых процессов свободнорадикального окисления (СРО) в деструкции элементов биомембран, в результате которых образуются продукты окислительной модификации молекул [1, 8].
В основе дегенеративно-дистрофического процесса в суставах лежат нарушения микроциркуляции субхондрального слоя кости и связанная с ними гипоксия, вызывающая изменения окислительных процессов в хрящевой ткани. При этом вторично изменяются состав, структура и свойства коллагена хряща, снижается его устойчивость к физи-
ческим нагрузкам. усиление СРО или ПОл, в свою очередь, приводит к повреждению мембран, изменению активности ферментов, нарушению гомеостаза [8, 23]. Активация ПОл является одним из факторов, усиливающих повреждение эндотелия, нарушение межклеточных контактов, снижение антитромбо-генного потенциала [20]. В результате нарушения сосудистого тонуса, тромбоза капилляров происходит нарушение микроциркуляции. Коллаген теряет эластичность и способность к набуханию. Гидроксилрадикал деполимеризует гиалуроновую кислоту, вызывает деградацию протеогликанов, существенно нарушая молекулярную структуру соединительной ткани [12]. Отмечается, что соединительная ткань обладает наименьшим антиокислительным потенциалом [3]. Повышенное образование и накопление в тканях активных форм кислорода (АФК), реактивных молекул и свободных радикалов вызывает перенапряжение и несостоятельность в функционировании антиоксидантной защиты (АОЗ) с формированием явлений окислительного стресса. установлено, что АФК и продукты ПОл являются медиаторами апо-птоза [22].
Как известно, цитокины являются важным фактором регуляции амплитуды и продолжительности воспалительного и иммунного ответов [13]. Провоспалительные цито-кины, а именно интерлейкин-1 (Ил-1), ин-терлейкин-6 (Ил-6) и фактор некроза опухоли (ФНО-а) активируют синтез матричных металлопротеаз [15]. Кроме этого, под воздействием интерлейкина-1 хондро-циты прекращают синтез протеогликанов, коллагенов хряща [17, 18] и начинают синтезировать ферменты, необходимые для образования оксида азота и простагланди-нов,— циклооксигеназу-2 [19]. Интерлей-кин-4 (Ил-4) является ингибирующим цито-кином, так как он подавляет продукцию Ил-1, ФНО-а и Ил-6 [9, 14], оксида азота и проста-гландинов [14, 15].
Исходя из вышесказанного, исследования перекисного окисления липидов и изменения цитокинового профиля имеют существенное значение для поиска новых путей в терапии остеоартроза.
Цель настоящей работы — исследование продуктов ПОл, ферментов АОЗ катала-зы и СОд и уровней цитокинов Ш-1Р, Ил-4 и ФНО-а у больных с первичным ОА, а также определение эффективности и преимуществ применения препарата «Вобэнзим» у пациентов с ОА.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под нашим наблюдением находились 42 женщины с первичным ОА в возрасте от 45 до 65 лет. у всех больных в динамике проводили клинико-лабораторные, рентгенологические и инструментальные исследования.
В исследуемую группу были включены пациенты без нарушения функций почек и печени. Контрольную группу составили 28 женщин аналогичного возраста без клинических проявлений остеоартроза.
Оценка степени тяжести ОА проводилась на основе совокупности ряда субъективных и объективных признаков. Была разработана система оценки тяжести ОА в баллах. Минимальной степени активности соответствовала сумма баллов от 0 до 20; средней степени — от 21 до 30 и максимальной — от 31 балла и более. В процентном соотношении группы больных разделились на 41%, 29% и 30% соответственно.
Клиническая картина ОА характеризовалась появлением сначала кратковременных, незначительных болей в суставах. чаще всего поражались коленные, тазобедренные и меж-фаланговые суставы кистей рук, и со временем в процесс вовлекались всё новые суставы. Больные предъявляли жалобы на боли, тугоподвижность, припухлость, ограничение
движений, «хруст» и деформацию суставов. По мере прогрессирования ОА боли усиливались, становились длительными, возникали при любых движениях, не исчезали в покое и беспокоили даже ночью. При установлении диагноза мы придерживались критериев Л. И. Беневоленской с соавторами (1993) [7], которые включают в себя клинические (боли в суставах, возникающие в конце дня и/или в первую половину ночи; боли, возникающие после механической нагрузки и уменьшающиеся в покое; деформация суставов за счет костных разрастаний, включая узелки Гебер-дена и Бушара) и рентгенологические (сужение суставной щели, остеосклероз и остео-фитоз) признаки.
Изучение процессов СРО проводилось путем определения продуктов ПОл (первичные, вторичные, шиффовы основания) в плазме крови по методу И. А. Волчегорского с соавторами [16].
Основу метода составляет экстракция ли-пидов крови на фазы гептан-изопропиловой смесью. После разделения гептановую фракцию отбирали в чистую пробирку и измеряли оптическую плотность против контроля при 220, 233, 278 и 400 нм. При длине волны 220 нм определяются изолированные двойные связи, при 233 нм — диеновые конъюга-ты и ацилгидроперекиси (первичные продукты ПОЛ), при 278 нм — кетодиены, сопряженные триены (вторичные продукты ПОл), при 400 нм — шиффовы основания.
Определение активности каталазы проводилось по методу М. А. Королюк с соавторами (1988) [6]. Метод основан на образовании стойкого окрашенного комплекса при взаимодействии перекиси водорода с солями молибденовокислого аммония. Присутствие каталазы снижает интенсивность окрашивания, которая измерялась спектрофотометром против контрольной пробы.
Исследование активности СОД проводилось с помощью набора реактивов фирмы «Randox Laboratol Ltd». Определение уровня
цитокинов осуществлялось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов фирмы «Ци-токин» (г. Санкт-Петербург).
Тактика лечения ОА определялась активностью, характером патологического процесса, степенью функциональных нарушений. Первая группа пациентов получала базисную терапию, преследовавшую следующие цели: ликвидация болевого синдрома; улучшение обменных процессов в суставном хряще; улучшение функции пораженных суставов. Больным ОА назначались нестероидные противовоспалительные средства, селективные ингибиторы циклооксигеназы-2, хондропротекторы, антиоксиданты, препараты, улучшающие микроциркуляцию, физиотерапевтические методы лечения. Вторая группа пациентов получала базисное лечение и дополнительно препарат «Вобэнзим» (Mucos Pharma, Gmbh (Германия), регистрационный номер П № 011530/01-1999 от 30.10.1999). Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы «Statistica 1.2» от 16.12.1991 г. с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Проведенные нами исследования ПОЛ показали, что в группе больных ОА имеет место повышение уровня первичных продуктов ПОЛ на 35,7% (р<0,001), что согласуется с результатами исследований других авторов [11], а также снижение вторичных продуктов и шиффовых оснований (табл. 1). Прослеживается связь между степенью тяжести течения ОА и повышением уровня первичных продуктов ПОЛ.
Исследование ферментов АОЗ показало, что у пациентов с остеоартрозом имеется снижение их уровней и в плазме, и в эритроцитах (табл. 2). Снижение уровня каталазы эритроцитов согласуется с литературными
Таблица 1
Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови у больных с ОА (М±m)
Показатель Контроль (п=28) Больные с остеоартрозом (п=42)
Первичные продукты ПОЛ 0,68±0,025 0,923±0,02**
Вторичные продукты ПОЛ 0,34±0,02 0,273±0,007*
Шиффовы основания 0,105±0,012 0,033±0,004**
Примечание. Различия «контроль — опыт» высокодостоверны: ** — р<0,001; достоверны: * — р<0,05.
Таблица 2
Содержание ферментов АОЗ в препаратах крови у пациентов с ОА (М±m)
Показатель Контроль (п=28) Пациенты с остеоартрозом
Базисная терапия (п=24) Базисная терапия + вобэнзим (п=18)
до лечения после лечения до лечения после лечения
СОДпл, Ед/мл 12,5±0,5 9,1±0,4* 13,1±0,3 9,7±0,4* 13,7±0,2
СОДэр, Ед/мл 39,5±1,3 35,9±0,5* 41,8±0,5 34,6±0,5* 42,6±0,3
Каталаза^, мкмоль/мл 15,5±0,5 12,2±1,3* 16,4±0,5 10,4±0,5** 16,8±0,2
Каталазаэр, мкмоль/мл 30 001±8,5 2228±52,2** 2462±58,1 2290±44,2** 2775±48,5##
Примечание. Различия «контроль — опыт» высокодостоверны: ** — р<0,001; достоверны: * — р<0,01; различия в двух группах после лечения: ## — р<0,001.
данными [3]. В конце курса лечения отмечено достоверное повышение активности СОДпл, СОДэр и каталазыпл у пациентов обеих групп до значений чуть выше контрольных. Во второй группе, получавшей дополнительно к лечению препарат «Вобэнзим», повышение уровня ферментов АОЗ более выражено, чем в первой, принимавшей только базисную терапию. Однако эти изменения недостоверны (р>0,05).
Содержание каталазыэр в конце курса лечения так и не достигало контрольных значений в обеих группах пациентов: в первой группе — 82%, во второй — 92,5% (от контроля). В первой группе отмечено повышение уровня фермента (от исходного) на 10%, а во второй — на 20% (р<0,001). Согласно литературным данным, гипоксия сопровождается отчетливым снижением активности катала-
зы [6]. Недостаточный рост активности ката-лазыэр в конце курса лечения, по нашим данным, согласуется с данными других исследователей [3].
Определение содержания цитокинов показало достоверное повышение содержания ИД-1Р, ФНО-а (р<0,001) более чем в 2 раза и снижение Ил-4 (р<0,001) в 1,5 раза (табл. 3). В конце курса лечения отмечается снижение провоспалительных цитокинов, более выраженное во второй группе: Ил-1 (р<0,01), ФНО-а (р>0,01). Уровень Ш-ф составил 132% от контроля в первой группе и 104% — во второй. Содержание Ил-4, наоборот, повышалось, и более эффективно во второй группе (р<0,01).
По результатам исследований прослеживается прямая связь между выраженностью суставного синдрома и повышением уровней
Таблица 3
Содержание цитокинов в плазме крови у пациентов с ОА
Показатель, г/мл Контроль (п=28) Базисная терапия (п=24) Базисная терапия + вобэнзим (п=18)
до лечения после лечения до лечения после лечения
ИЛ-1Р 36,9±5,2 88,5±4,6** 48,9±3,2 90,3±5,5 38,5±2,3#
ФНО-а 24,7±2,4 58,2±4,4** 34,8±2,3 54,9±3,8 29,3±1,5
ИЛ-4 56,3±4,5 37,8±2** 52±2,1 38,3±3,1 62,5±2,5#
Примечание. Различия «контроль — опыт» высокодостоверны: ** — р<0,001; достоверны: * — р<0,01; различия в двух группах после лечения достоверны: # — р<0,01.
первичных продуктов ПОЛ, ИЛ-Щ ФНО-а, а также со снижением активности СОДпл.
Следует отметить, что применение вобэн-зима удовлетворительно переносилось пациентами и способствовало в дальнейшем снижению доз нестероидных противовоспалительных препаратов.
Выводы
Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы:
1. У пациентов с остеоартрозом выявлены активация перекисного окисления липи-дов и угнетение активности ферментов анти-оксидантной системы. Снижение активности ферментов АОС и недостаточная активация каталазы эритроцитов в конце курса лечения подчеркивает необходимость длительного назначения антиоксидантных препаратов.
2. Повышение уровней ИЛ-1Р, ФНО-а и понижение содержания ИЛ-4 свидетельствуют о воспалительном компоненте в патогенезе остеоартроза. Включение вобэнзима дополнительно в курс базисного лечения способствует повышению содержания ИЛ-4, ка-талазы эритроцитов и понижению ИЛ-1Р, и, таким образом, назначение вобэнзима может быть рекомендовано для применения в патогенетической терапии остеоартроза.
80
Библиографический список
1. Влияние пептидов на осмотическую устойчивость эритроцитов/В. В. Николайчик, А Г. Федулов, Г. Н. Бычко//Материалы III Всесоюзной межуниверситетской конференции физиков, химиков, биологов.— Тбилиси, 1982.— ч. 2.— С. 364—365.
2. Епифанов В. А. Артроз суставов кисти и стопы: клиника, диагностика, лечение/
B. А. Епифанов. — М.: Медпресс-информ, 2005.— 118 с.
3. Зборовская И. А Ревматологические болезни и антиоксидантная система/И. А Зборовская.— М.: Медицина, 2005.— 128 с.
4. Качество жизни больных остеоартрозом/ А Е. Михайлова, В. Г. Кривошапкин, Р. Н. Протопова, Ш. Эрдес//Научно-прак-тическая ревматология.— 2005.— № 2.—
C. 11—15.
5. Клинические рекомендации. Ревматология/Под ред. Е. Л. Насонова.— М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006.— 288 с.
6. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы/М. А Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова, В. Е. Токарев//Лабораторное дело.—1988.— № 1.— С. 16—19.
7. Мазуров В. И. Клиническая ревматология/В. И. Мазуров.— СПб.: Фолиант, 2001.— 415 с.
8. Павлюченко И. И. Интегральные методы оценки уровня эндогенной интоксикации и перекисного окисления биомолекул при острых и хронических заболеваниях/И. И. Павлюченко, А. А. Басов, И. М. Быков, С. В. Орлова //Аллергология и иммунология.— 2004.— Т. 5.— № 4— С. 551—554.
9. Пальцев М. А Цитокины и их роль в межклеточных взаимодействиях/М. А. Паль-цев//Архив патологии.— 1996.— Т. 58.— № 6.— С. 3—7.
10. Плоткин Г. Л. Деформирующий остео-артроз/Г Л. Плоткин, А. А. Домашенко, С. С. Сабаев///Амбулаторная хирургия.—
2004.— Т. 22.— № 13—14. — С. 44—46.
11. Рудык Б. И. Изменение перекисного окисления липидов у больных первичным деформирующим остеоартрозом/Б. И. Рудык, Н. М. Фильчагин, Р. А. Сабадышин// Тер. архив.— 1988.— № 9.— С. 110—113.
12. Терёхина Н. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система/ Н. А. Терёхина, Ю. А Петрович.— Пермь,
2005.— 57 с.
13. Фрейдлин И. С. Регуляторные функции противовоспалительных цитокинов и острофазных белков/И. С. Фрейдлин, П. Г. Назаров///Вестник Российской академии медицинских наук.— 1999.— № 5.— С. 28—32.
14. Хаитов Р. М. Иммунология: учебник/ Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидоро-вич.— М.: Медицина, 2000.— 432 с.
15. Цурко В. В. Строение и функции суставного хряща. Роль цитокинов в патогенезе остеоартроза/В. В. Цурко//Клиническая геронтология.— 2001.— № 12.— С. 63-69.
16. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма/И. А. Волчегорский, И. И. Долгушин, О. А. Колесников, В. Э. Цейлик-ман.— Челябинск, 2000.— 167 с.
17. Independent binding of interleukin-1 alpha and interleukin-1 beta to type I and type II
interleukin receptors//. Slack, C.J. Mc Mahan, S. Waugh et al.//J. Biol. Chem. - 1993.— Vol. 268.— P. 2513—2524.
18. Interleukin-1 receptor antagonist/ W. P. Arend//Adv. Immunol.— 1993— Vol. 54.— P. 167—227.
19. Interleukin-1 receptor in normal and osteoarthritic human artritical chondro-cytes//. Martel-Pellitier, R. Mc Collum, J. A. Di Battista et al.//Arthritis Reum— 1992.— Vol. 35.— P. 530—540.
20. Hou J. C. Inhibitory effect of selenite and other antioxidants on complement mediated tissue in patients with epidemic hemorrhagic fever//Biol. Trace Elem. Res— 1997.— Vol. 56.— P. 125—130.
21. Long-term effects of glucosamint sulfate on osteoarthritis progression: a randomized, placebo controlled clinical trial//. Y. Reginster, R. Deroisy, L. C. Rovati et al.//Lancet— 2001—Vol. 357.— P. 251—256.
22. Signaling apoptosis: a radical approach/ R. J. Carmody, T. J. Cotter//Redox report: communications in free radical research— 2001.— Vol. 6.— P. 77—90.
23. Spiteller J. Are lipid peroxidation processes induced by changes in the cell wall structure and how are these processes connected with diseases?//Medical hypotheses— 2003.— Vol. 60.— P. 69—83.
S. A. Komarova, L. A. Ibragimova, F. Kh. Kamilov
INVESTIGATION OF FREE-RADICAL OXIDATION PROCESSES AND ACTIVITY OF ANTIOXIDANT DEFENSE ENZYMES AND THEIR DYNAMICS IN TREATMENT OF OSTEOARTHROSIS PATIENTS WITH PREPARATION «VOBENZYME»
The objective of the present work was to
investigate lipid peroxidation (LPO) processes,
catalase and superoxiddismutase (SOD) enzymes
in plasma and erythrocytes, IL-ip, TNF-a, IL-4 cytokine levels in blood plasma of patients with primary osteoarthrosis in dynamics applying the preparation «Vobenzyme». LPO products were investigated using I. A. Volchegorskiy's method; catalase was determined with M. A. Korolyuk's method, cytokines - with immunofermental analysis (IFA) method. Elevation of LPO products by 35,7%, more than twofold growth of IL-ip and TNF-a, reduction of activity of antioxidant defense enzymes were detected. Correlation between the content of plasma LPO, IL-ip, TNF-a, SOD primary products and severity of disease was observed. Application of vobenzyme
promoted more effective increase in erythrocyte catalase activity and IL-4 level as well as decrease in IL-ip content.
Keywords: free-radical oxidation, catalase, superoxiddismutase, cytokines, osteoarthrosis, vobenzyme.
Контактная информация: Ибрагимова Людмила Александровна, доктор мед. наук, профессор кафедры факультетской терапии Башкирского государственного медицинского университета, 450077, г. Уфа,ул. Пархоменко,93, тел. 8 (347) 273-92-82
Материал поступил в редакцию 15.05.2009
