CC BY
12
УДК: 579.22
ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК ШТАММОВ ДЕСТРУКТОРОВ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ВОЛОКНИСТЫХ МАТЕРИАЛАХ В УСЛОВИЯХ КОЛОНОЧНОГО БИОРЕАКТОРА
1 ©
Аипова Р., Махатова А.С., Курманбаев А.А.
1Д.б.н. РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК, г. Астана
Аннотация
В статье рассматривается процесс деструкции поверхностно-активных веществ (ПАВ) иммобилизованными клетками штаммов - деструкторов на гидрофобизованных стеклотканевых волокнах в условиях лабораторного колоночного биореактора.
Ключевые слова: поверхностно-активные вещества, иммобилизация, биореактор, стекловолокно.
Keywords: surfactans, immobilization, bioreactor, fiberglass.
Введение
Метод адсорбционной иммобилизации клеток микроорганизмов широко используется в различных отраслях биотехнологии, в том числе процессах биокатализа, а также при решении экологических проблем [1]. Иммобилизованные микроорганизмы характеризуется повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды и высокой каталитической активностью, которая во многих случаях возрастает в несколько раз по сравнению со свободными клетками [2]. Кроме того, иммобилизация позволяет концентрировать большие количества биомассы и избегать ее значительных потерь, что важно в условиях биореактора, а также при внесении бактериальных клеток в окружающую среду [3]. В настоящее время метод адсорбции используется преиумущественно для иммобилизации микроорганизмов, участвующих в очистке загрязненного воздуха или сточных вод [4]. Наиболее эффективно применение адсорбированных микроорганизмов в системе биофильтров и мембранных биореакторов, предназначенных для обработки жидких и летучих промышленных отходов [5]. Ферментативные свойства штаммов - деструкторов ПАВ могут применяться в процессе очистки сточных вод для стимуляции расщепления органических компонентов и как следствие для повышения качества и эффективности очистки воды. Закрепление клеток бактерий деструкторов на поверхности носителя позволит более эффективно очищать, загрязненную воду от синтетических поверхностно-активных веществ (СПАВ). При этом необходимым условием результативности процесса биодеструкции является достижение высокой численности иммобилизованных клеток и их прочное закрепление на поверхности носителя [6].
Целью работы было исследование эффективности волокнистого носителя для иммобилизованных микроорганизмов - деструкторов в процессе очистки сточной воды от СПАВ в аэробном колоночном биореакторе.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы - деструкторы Pseudomonas putida У2, Serratia marcescens K1, Pseudomonas flourescens s8ps, Bacterim sp s5, Rhizobium pusence сф6 из коллекции лаборатории экологической биотехнологии. Клетки штаммов - деструкторов выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл мясопептонного бульона на орбитальном шейкере (160 об/мин) при 28°С в течение 24 ч. Непосредственно перед иммобилизацией бактериальные клетки центрифугировали и отмывали от питательной
© Аипова Р., Махатова А.С., Курманбаев А.А., 2016 г.
среды натрий фосфатным буфером следующего состава, г/л Na2HPO4 - 3,53; KH2PO4 - 3,39. В качестве адсорбента клеток штаммов - деструкторов использовали волокнистый носитель -стекловолокно марки Т-11, толщина 0,28±0,03мм. Непосредственно перед использованием носитель отмывали дистиллированной водой и стерилизовали автоклавированием (121°С, 15 мин). Процесс иммобилизации клеток деструкторов проводили в лабораторном колоночном биореакторе (рисунок 1), представляющем собой пластиковую колонку, заполненную гидрофобизованным стекловолокном. Клеточная суспензия подавалась в колонку с помощью перистальтического насоса через нижнее входное отверстие со скоростью 2,0 - 3,0 мл/мин, орошала носитель в направлении снизу-вверх и возвращалась в колбу. Таким образом, биореактор являлся замкнутой циркуляционной системой с переменной скоростью потока. Процесс иммобилизации осуществляли при комнатной температуре и контролировали путем измерения оптической плотности (ОП600 нм) клеточной суспензии с помощью спектрофотометра "Apel АР - 700" (Japan) в течение 5 суток. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Сорбционную способность носителей и клеток определяли методом Г.Н.Никовский [7]. В качестве модельного раствора использовали минеральную среду М9 с добавлением 200 мг/л додецилсульфат натрия (ДСН). Для определения деструктивной активности микроорганизмов деструкторов ПАВ отбирали образцы иммобилизованных клеток из колоночного реактора на 5-е сутки.
Результаты и их обсуждение.
Штаммы - деструкторы ПАВ хорошо сорбировались на поверхности носителя стекловолокне. Анализ динамики процесса иммобилизации клеток в условиях колоночного биореактора (таблица 1) свидетельствует о том, что закрепление клеток происходит наиболее интенсивно на 3-и и 5-е сутки эксперимента, в результате иммобилизуется от 34 до 89,45 % бактериальных клеток. В дальнейшем наблюдается постепенное замедление процесса клеточной адсорбции и последующая стабилизация показателей оптической плотности суспензии на постоянном уровне, что свидетельствует о достижении уровня адсорбционного насыщения носителя.
Таблица 1
Экспериментальные данные по иммобилизации клеток деструкторов на сорбенте
стекловолокне
Наименование культур ОПбооис х Титр клеток Кол-во сорб-х клеток Сорбция клеток культур Деструкция ПАВ, %
3-е сутки, % 5-е сутки, %
Pseudomonas fluorescens 8 ps 1,39 1,970 х108 12,46 х108 61,81 89,45 99,6
Bacterium spp S5 1,15 9,609 х108 9,63х108 46,45 83,86 99,8
Serratia marcescens К1 1,52 2,686х108 3,43 х108 26,87 87,14 99,7
Rhizobium pusence Сф 6 1,5 1,256х108 1,86 х108 40,37 87,32 99,6
Pseudomonas putida У2 1,30 8,330х108 3,44 х108 34,00 84,10 99,7
Установлено, что данный процесс при заданном режиме (3,0 мл/мин) подачи клеточной суспензии в биореакторе и концентрации клеток 10 кл/мл завершается на 5-е
сутки и характеризуется высокой (89,45%) степенью иммобилизации клеток штаммов-деструкторов на носителе стекловолокне.
Бактерии штаммов - деструкторов ПАВ выращивали в 250мл колбах Эрленмейера, содержащих 1500 мл питательного бульона, при 280С на орбитальном шейкере ("Р8и-20Г, Латвия) при 160 об/мин. Сорбцию клеток проводили путем инокуляции микроорганизмов на носителе стекловолокне. Титр внесенной суспензии микроорганизмов составил 108 кл/мл. Через определенные промежутки времени отбирали образцы культуральной жидкости из установки и определяли их на деструктивную активность и оптическую плотность на спектрофотометре "Аре1 АР - 700". Иммобилизацию клеток штаммов - деструкторов проводили в лабораторном колоночном биореакторе объемом 1500 мл, содержащего 60 г стекловолокна и заполненном культуральной жидкостью с титром 10 кл/мл. Культуральную жидкость микроорганизмов - деструкторов выдерживали в биореакторе в течение 24 ч для их активной адгезии на носителе в отсуствии источника углерода. Через 24 ч из колоночного биореактора удаляли культуральную жидкость и наполняли биореактор модельным субстратом. Модельным субстратом для деструкции служил ДСН в исходной концентрации 200 мг/л на минеральной среде М9. В лабораторной установке колоночного типа осуществляли процесс непрерывного культивирования. Циркуляция субстрата обеспечивалась с помощью перистальтического насоса при скорости 70 об/мин. В этот период протекает активная аккомодация клеток к носителю.
А. Б.
Рис. 1 - Экспериментальная установка по изучению процесса иммобилизации клеток (А) - 1-
е сутки с добавлением ДСН и (Б) - 5-е сутки.
В результате проведенных исследований установлено, что в равных условиях стекловолокно лучше сорбировало клетки Pseudomonas fluorescens - 8 ps и Serratia marcescens K1 на 3-и и 5-е сутки, степень сорбции составила 87,32 % - 89,45 %, степень сорбции клеток Bacterium spp -S5 составила 83% на 5-е сутки культивирования. Все штаммы - деструкторы ПАВ показали высокую степень деструктивной активности до 99% за 5 суток культивирования.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования стекловолокна для иммобилизации клеток штаммов бактерий в биотехнологическом процессе очистки сточных вод.
Литература
1. Козляк Е.И. Физико - химическиеосновы иммобилизации клеток методом сорбции (Обзор) / Е.И. Козляк, М.М. Якимов, И.Б.Уткин [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27, вып. 6. С. 788-801.
2. Синицын, А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д. Спасов. М.: Изд-во МГУ, 1994. 288с.
3. Podoroshko, E.A. Hydrophobies sawdust as a carrier for immobilisation of the hydrocarbon - oxiding bacterium Rhodococcus ruber / E.A/ Podoroshko, V.I.Lozinsky, I.B. Ivshina [et al.] // Biores. Technol. 2008/ Vol. 99/ P. 2001 - 2008.
4. Пирог, Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т. П. Прогов, Т. А. Шевчук, И.Н. Волошина, Н.Н. Грегирчак // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41, № 1. С. 58-63.
5. Prieto, M. B. Biodegradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier / M.B. Prieto, A. Hidalgo, C. Rodriguez-Fernandez [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 853-859.
6. Bell K.S., Philip J. C., Aw D. W.J., Christofi N. // J. Apll. Microbiol. 1998.
7. Никовская Г.Н., Гордиенко А.С., Глоба Л.Н. Сорбция микроорганизмов волокнистыми материалами. Микробиология, 1986, 55, №4, с. 691-694.
